第五酶和细胞固定化

1、Chapter 5 Immobilized Enzyme and Cell固定化酶和细胞固定化酶和细胞制作：郑穗平酶应用过程中的一些不足酶应用过程中的一些不足l 酶的稳定性较差酶的稳定性较差：除了某些耐高温的酶，如-淀粉酶、Taq酶等；和胃蛋白酶等可以耐受较低的pH条件以外，大多数的酶在高温、强酸、强碱和重金属离子等外界因素影响下，都容易变性失活。 l 酶的一次性使用酶的一次性使用：酶一般都是在溶液中与底物反应，这样酶在反应系统中，与底物和产物混在一起，反应结束后，即使酶仍有很高的活力，也难于回收利用。这种一次性使用酶的方式，不仅使生产成本提高，而且难于连续化生产。 l 产物的分离纯化较困难产

2、物的分离纯化较困难：酶反应后成为杂质与产物混在一起，无疑给产物的进一步的分离纯化带来一定的困难。 固定化技术固定化技术Contents of chapter 51、什么是固定化技术和固定化酶2、固定化酶的研究历史3、酶的固定化技术4、固定化酶的特点GoGoGoGo6、细胞、原生质体的固定化，自学5、固定化酶的应用Go5.1 5.1 什么是固定化酶？什么是固定化酶？水溶性酶水溶性酶水不溶性载体水不溶性载体水不溶性酶水不溶性酶（固定化酶）（固定化酶）固定化技术固定化技术化学偶联酶酶固定化固定化间歇间歇可溶可溶交联包埋吸附间歇间歇连续连续酶的固定化技术和固定化酶固定化酶：经提取和分离纯化后的酶 固定

3、化菌体(死细胞)：含酶菌体或菌体碎片 固定化细胞：在一定的空间范围内进行生命活动的细胞 l 优点：1.不溶于水，易于与产物分离；2.可反复使用；3.可连续化生产；4.稳定性好。l 缺点：固定化过程中往往会引起酶的失活本章目录l 固定化酶的研究从50年代开始，1953年德国的 Grubhofer和Schleith采用聚氨基苯乙烯树脂聚氨基苯乙烯树脂为载体与羧肽酶、淀粉酶、胃蛋白酶、核糖核酸酶等结合，制成固定化酶。l 60年代后期，固定化技术迅速发展起来。1969年，日本的千烟一郎首次在工业上生产应用固定化氨基酰化酶从固定化氨基酰化酶从DL-DL-氨基酸连续生产氨基酸连续生产L-L-氨基氨基酸酸，

4、实现了酶应用史上的一大变革。l 在1971年召开的第一次国际酶工程学术会议上，确定固定化酶的统一英文名称为Immobilized enzymeImmobilized enzyme。5.2 固定化酶的研究历史l 随着固定化技术的发展，出现固定化菌体固定化菌体 。1973年，日本首次在工业上应用固定化大肠杆菌菌体中的天门冬氨酸酶，由反丁烯二酸固定化大肠杆菌菌体中的天门冬氨酸酶，由反丁烯二酸连续生产连续生产L-L-天门冬氨酸天门冬氨酸。l 在固定化酶和固定化菌体的基础上，70年代后期出现了固定化细胞固定化细胞技术。 1976年，法国首次用固定化酵母细胞生产啤酒和酒精，1978年日本用固定化枯草杆菌生

5、产淀粉酶，开始了用固定化细胞生产酶的先例。l 1982年，日本首次研究用固定化原生质体固定化原生质体生产谷氨酸，取得进展。固定化原生质体由于解除了细胞壁的障碍，更有利于胞内物质的分泌，这为胞内酶生产技术路线的变革提供了新的方向。本章目录5.3 5.3 酶固定化技术酶固定化技术l 活性中心活性中心：保护酶的催化作用，并使酶的活性中心的氨基酸基团固有的高级结构不受到损害，在制备固定化酶时，需要在非常严密的条件下进行。l 功能基团功能基团：如游离的氨基、羧基、半胱氨酸的巯基、组氨酸的咪唑基、酪氨酸的酚基、丝氨酸和苏氨酸的羟基等，当这些功能基团位于酶的活性中心时，要求不参与酶的固定化结合l 酶的高级结

6、构酶的高级结构：要避免用高温、强酸、强碱等处理，而且有机溶剂、高浓度的盐也会使酶变性、失活，因此，操作应尽量在非常温和的条件下进行。固定化酶操作的注意事项固定化酶操作的注意事项1 1、吸附法、吸附法 利用各种固体吸附剂将酶或含酶利用各种固体吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面上，而使酶固定化菌体吸附在其表面上，而使酶固定化的方法的方法。 常用的固体吸附剂有活性炭、氧活性炭、氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、硅胶、羟基磷灰石硅胶、羟基磷灰石等。 操作简便，条件温和，不会引起酶变性失活，载体廉价易得，而且可反复使用。 由于靠物理吸附作用，结合力较结合力较弱弱，酶与载

7、体结合不牢固而容易脱落，所以使用受到一定的限制。 2 2、包埋法包埋法 将酶或含酶菌体包埋在各种多孔载体中，使酶将酶或含酶菌体包埋在各种多孔载体中，使酶固定化的方法固定化的方法。 包埋法使用的多孔载体主要有：琼脂、琼脂糖、海藻酸钠、角叉菜胶、明胶、聚丙烯酰胺、光交联树脂、聚酰胺、火棉胶等。根据载体材料和方法的不同，可分为：凝胶包埋法凝胶包埋法：将酶或含酶菌体包埋在各种凝胶内部的微孔中，制成一定形状的固定化酶或固定化含酶菌体。大多数为球状或片状，也可按需要制成其他形状。常用的凝胶有琼脂凝胶、海藻酸钙凝胶、角叉菜胶、明胶等天然凝胶以及聚丙烯酰胺凝胶、光交联树脂等合成凝胶。 半透膜包埋法半透膜包埋法

8、：将酶包埋在由各种高分子聚合物制成的小球内，制成固定化酶。常用于制备固定化酶的半透膜有聚酰胺膜、火棉胶膜等 首先被采用包埋法的是： 固定化胰蛋白酶 木瓜蛋白酶 淀粉酶Enzyme+N,N-甲叉双丙烯酰胺，丙烯酰胺，引发剂海藻酸钙海藻酸钙包埋法装置包埋法装置将水溶性的海藻酸钠配成水溶液，并把酶或细胞分散在其中，然后将其滴入凝固浴中（常用CaCl2 溶液），使海藻酸钠中的Na+，部分被Ca2+所取代而形成由多价离子交联的离子网络凝胶。颗粒大小可实时监控颗粒大小可实时监控脂质体包裹脂质体包裹3、结合法、结合法 选择适宜的载体，使之通过共价键或离子键与酶结合在一起选择适宜的载体，使之通过共价键或离子键

9、与酶结合在一起的固定化方法。的固定化方法。根据酶与载体结合的化学键不同，可分为：离子键结合法离子键结合法：通过离子键使酶与载体结合的固定化方法称为离子键结合法。离子键结合法所使用的载体是某些不溶于水的离子交换剂。常用的有DEAE-纤维素、TEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶等。 共价键结合法共价键结合法：通过共价键将酶与载体结合的固定化方法称为共价键结合法。共价键结合法所采用的载体主要有：纤维素、琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶、甲壳质、氨基酸共聚物、甲基丙稀醇共聚物等。酶分子中可以形成共价键的基团主要有：氨基、羧基、巯基、羟基、酚基和咪唑基等。要使载体与酶形成共价键，必须首先使载体活化载体活化，第一

10、个离子结合法固定化酶：第一个离子结合法固定化酶：DEAE-CelluloseDEAE-Cellulose固定化过氧化氢酶固定化过氧化氢酶第一个工业化的固定化酶：第一个工业化的固定化酶：DEAE-SephadexDEAE-Sephadex A-50 A-50固定化氨基酰化酶固定化氨基酰化酶4 4、交联法、交联法借助双功能试剂使酶分子之间发生交联作用，制成网状结构的固定化酶的方法。戊二醛有两个醛基，这两个醛基都可与酶或蛋白质的游离氨基反应，形成席夫（Schiff）碱，而使酶或菌体蛋白交联，制成固定化酶或固定化菌体。交联法制备的固定化酶或固定化菌体结合牢固结合牢固，可以长时间使用。但由于交联反应条件

11、较激烈，酶分子的多个基团被交联，致使酶酶活力损失较大活力损失较大，而且制备成的固定化酶或固定化菌体的颗粒较小颗粒较小，给使用带来不便。为此，可将交联法与吸附法或包埋法联合使用，可将交联法与吸附法或包埋法联合使用，以取长补短以取长补短。 常用的双功能试剂有戊二醛、己二胺、顺丁烯二酸酐、双偶氮苯等。其中应用最广泛的是戊二醛。酶分子之间共价交联和与水不溶性载体共价偶联 酶分子；（a）酶分子之间用双功能基团的化学交联试剂相互交联成水不溶性的固定化酶；（b）酶分子被偶联到水不溶性载体上形成水不溶性的固定化酶本章目录5.4 5.4 固定化酶的特性：固定化酶的特性：l 将酶或含酶菌体固定化制成固定化酶或固定

12、化菌体以后，由于受到载体等的影响，酶的特性可能会有些变化。 l 固定化酶的稳定性一般比游离酶的稳定性好。 l 固定化酶的最适作用温度一般与游离酶差不多，活化能也变化不大。 l 酶经过固定化后，其作用的最适pH值往往会发生一些变化。这一点在使用固定化酶时，必须引起注意。影响固定化酶最适pH值的因素主要有两个，一个是载体的带电性质，另一个是酶催化反应产物的性质。l 固定化酶的底物特异性与游离酶比较可能有些不同，其变化与底物分子量的大小有一定关系。固定化酶底物特异性的改变，是由于载体的空间位阻作用引起的。 本章目录乙酰乙酰 -DL Ala L Ala +乙酸乙酸乙酰乙酰 -D AlaAminoacy

13、lase 氨氨 基基 酰酰 化化 酶酶5.5 5.5 固定化酶的应用固定化酶的应用世界上第一种工业化生产的固定化酶。世界上第一种工业化生产的固定化酶。1969年，日本田边制药公司将从米曲霉中提取分离得到的氨基酰化酶，用DEAE-葡聚糖凝胶为载体通过离子键结合法制成固定化酶，将L-乙酰氨基酸水解生成L-氨基酸，用来拆分DL-乙酰氨基酸，连续生产L-氨基酸。剩余的D-乙酰氨基酸经过消旋化，生成DL-乙酰氨基酸，再进行拆分。生产成本仅为用游离酶生产成本的60左右。 泵泵储罐反应产物离心机离心机消消旋旋反反应应器器固定化酶柱子晶体 L-AlaL-Ala A-D-AlaA-L-Ala A-D-Ala高果

14、糖浆的生产高果糖浆的生产淀粉液化液淀粉酶糖化酶糖化液喷雾干燥氢化还原结晶异构酶粉状葡萄糖山梨醇结晶葡萄糖果葡糖浆果糖42%葡萄糖55%低聚糖分离混合高果糖浆果糖浆果糖80-90%果糖55%葡萄糖39%低聚糖世界上生产规模最大的一种固定化酶。将培养好的含葡萄糖异构酶葡萄糖异构酶的放线菌细胞用6065热处理15min，该酶就固定在菌体上，制成固定化酶，催化葡萄糖异构化生成果糖，用于连续生产果葡糖浆。 青霉素酰化酶转化流程图青霉素酰化酶转化流程图酶传感器酶传感器l 酶传感器是由固定化酶与传感元件两部分组成的，其中酶是与适当的载体结合形成的不溶于水的固定化酶膜。l 最常用的酶传感器是酶电极酶电极，即将

15、固定化酶膜与转换电极做在一起，当酶膜与被测物发生催化反应而生成电极活性物质后，电极测定活性物质并将其转换为电信号输出。酶电极酶电极l 酶电极是由固定化酶与各种电极密切结合的传感装置。1962年Clark和Lyons提出模型，1967年Updike和Hicks首先制造出酶电极并把它用于葡萄糖的定量分析。l 酶电极一般可根据电极检测物理量的不同分为电流型和电压型，前者一般有氧电极、H2O2电极等，后者有NH3、CO2、H2电极等。l 较典型的一种酶电极为葡萄糖酶电极葡萄糖酶电极。葡萄糖醌H2O葡萄糖酸氢醌葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶氢醌 醌2H2ePt铂电极葡萄糖酶电极结构示意图 l葡萄糖酶电极的敏感

16、膜是葡萄糖氧化葡萄糖酶电极的敏感膜是葡萄糖氧化酶（酶（GOD），它被固定在聚乙烯酰胺凝），它被固定在聚乙烯酰胺凝胶上。在酶膜的作用下葡萄糖发生氧化胶上。在酶膜的作用下葡萄糖发生氧化反应，消耗掉氧而生成葡萄糖酸和过氧反应，消耗掉氧而生成葡萄糖酸和过氧化氢。通过用电极测量被消耗的氧或生化氢。通过用电极测量被消耗的氧或生成的过氧化氢就可了解葡萄糖浓度。成的过氧化氢就可了解葡萄糖浓度。 手掌型葡萄糖手掌型葡萄糖(glucose)(glucose)分析仪分析仪脲电极Urea + 2H2O 2NH4+2HCO3-脲酶产生的2NH4+为阳离子电极感应。此外还有：氨基酸电极醇电极尿酸电极乳酸电极青霉素电极亚硝酸离子电极：菠菜亚硝酸还原酶产生NH3一些常见的酶电极一些常见的酶电极底 物酶电 极5腺苷酸5腺苷酸脱氨酶NH4+乙醇，醇乙醇脱氢