北京大学《药物毒理学》2毒理学实验基础-药学修改后

1、1毒理学研究设计及实验基础The Design of Toxicology Study & Foundations of Toxicology Experiment 2本章的学习目的本章的学习目的学习了解毒理学研究的基础（方法和手段）n实验的设计n实施n观察n结果评价方法科学手段上的毒理学： 实验科学（以动物实验为中心）3一.药物的研发流程n总的来说新药的研发分为两个阶段：总的来说新药的研发分为两个阶段： 研究和开发。研究和开发。 这两个阶段是相继发生有互相联系的。区分这两个阶段是相继发生有互相联系的。区分两个阶段的标志是候选药物的确定，即在确定两个阶段的标志是候选药物的确定，即在确定

2、候选药物之前为研究阶段，确定之后的工作为候选药物之前为研究阶段，确定之后的工作为开发阶段。开发阶段。 41.药物的研究研究阶段包括四个重要环节研究阶段包括四个重要环节 ： （1）靶标的确立 （2）模型的确立 （3）先导化合物的发现 （4）先导化合物的优化 52.药物的开发开发阶段也包括四个重要环节开发阶段也包括四个重要环节 ： （1）临床前试验：由制药公司进行的实验室和动物研究，以观察化合物针对目标疾病的生物活性，同时对化合物进行安全性评估。 （2）研发中新药申请（Investigational New Application, IND） （3）临床试验：（ 期、期、期、期 ） （4）新药申请

3、（New Drug Application, NDA） 6临床前研究临床前研究 （1 1） 药学研究：药学研究： （2 2）药效学研究：）药效学研究：评价化学物质的生物活性和确定药物作用评价化学物质的生物活性和确定药物作用机理。机理。 （3 3）一般药理学研究：指对新药主要药效作用以外广）一般药理学研究：指对新药主要药效作用以外广泛药理作用的研究。主要是药物作用特征、对机体重泛药理作用的研究。主要是药物作用特征、对机体重要系统（神经、心血管、呼吸系统）的影响。要系统（神经、心血管、呼吸系统）的影响。 （4 4）药代动力学研究）药代动力学研究(ADME)(ADME) （5 5）毒理学研究）毒理学

4、研究7二二. .为什么要进行毒理学试验？为什么要进行毒理学试验？ 毒理学试验是对药物安全性评价的主要手段，各毒理学试验是对药物安全性评价的主要手段，各国际组织或各国的行政部门所颁布的规程或指南国际组织或各国的行政部门所颁布的规程或指南已将毒理学实验列为常规试验，也称为法规已将毒理学实验列为常规试验，也称为法规( (管理管理) )毒理学试验（毒理学试验（regulatory toxicology testregulatory toxicology test），），这类毒理学试验是以筛查和描述药物的毒性为目这类毒理学试验是以筛查和描述药物的毒性为目的，属于描述毒理学范畴。的，属于描述毒理学范畴。8

5、毒理实验种类毒理实验种类1.1.体内试验：体内试验：2.2.体外试验：体外试验：3.3.人体调查和流行病学调查：人体调查和流行病学调查：9三三. .毒理学实验的原则和局限性毒理学实验的原则和局限性1.1.基本原则（三个原则）基本原则（三个原则）n第一原则：药物在实验动物产生的作用，可以外推于人。n第二原则：实验动物必须暴露于高剂量受试物。n第三原则：选择成年的健康（雄性和雌性未孕）实验动物和人可能的暴露途径。102.2.利用动物实验的局限性利用动物实验的局限性不确定性：不确定性：用实验动物的毒理学试验资料外推到人群接触用实验动物的毒理学试验资料外推到人群接触的安全性时，会有很大的不确定性。的安

6、全性时，会有很大的不确定性。“给人使用时总给人使用时总是不可避免地要冒一定的风险。是不可避免地要冒一定的风险。”（要知己知彼）（要知己知彼）不确定性的产生：不确定性的产生：药物的毒性作用受到许多因素的影响。的毒性作用受到许多因素的影响。 1.1.实验动物和人对药物的反应敏感性不同，有时甚至存在着质的差实验动物和人对药物的反应敏感性不同，有时甚至存在着质的差别。（症状和体征）别。（症状和体征） 2.2.试验中选用较大的染毒剂量，有些药物在高剂量和低剂量的毒性试验中选用较大的染毒剂量，有些药物在高剂量和低剂量的毒性作用规律并不一定一致。作用规律并不一定一致。 3.3.毒理学试验所用动物数量有限，那

7、些发生率很低的毒性反应，在毒理学试验所用动物数量有限，那些发生率很低的毒性反应，在少量动物中难以发现。少量动物中难以发现。 4.4.实验动物一般都是实验室培育的品系，一般选用成年健康动物，实验动物一般都是实验室培育的品系，一般选用成年健康动物，反应较单一。反应较单一。113.3.毒理实验的重要原则毒理实验的重要原则（1）贯彻优良实验室规范(GLP)（2）尊重动物福利（3R原则）12四四. .毒性评价试验的基本目的毒性评价试验的基本目的1.1.药物毒作用的表现和性质药物毒作用的表现和性质2.2.剂量剂量- -反应反应( (效应效应) )研究研究3.3.确定毒作用的靶器官确定毒作用的靶器官4.4.

8、确定损害的可逆性确定损害的可逆性5.5.其它其它 （1）毒作用的敏感检测指标和生物学标志 （2）毒作用机制研究 （3）受试物的毒物动力学和代谢研究 （4）中毒的解救措施13四四. .毒性评价试验的基本目的毒性评价试验的基本目的1.1.药物毒作用的表现和性质药物毒作用的表现和性质2.2.剂量剂量- -反应反应( (效应效应) )研究研究3.3.确定毒作用的靶器官确定毒作用的靶器官4.4.确定损害的可逆性确定损害的可逆性5.5.其它其它 （1）毒作用的敏感检测指标和生物学标志 （2）毒作用机制研究 （3）受试物的毒物动力学和代谢研究 （4）中毒的解救措施14剂量剂量- -反应反应( (效应效应)

9、)研究研究n是毒性评价和安全性评价的基础。通过对不同有害作用的剂量是毒性评价和安全性评价的基础。通过对不同有害作用的剂量- -反应反应( (效应效应) )研究，可以得到该受试物的多种毒性参数。研究，可以得到该受试物的多种毒性参数。 急性急性( (致死性致死性) )毒性试验：毒性试验：LDLD5050、LDLD0101和和MTDMTD。 急性非致死性毒性试验中：急性可观察到有害作用的最低剂量急性非致死性毒性试验中：急性可观察到有害作用的最低剂量 (LOAEL)(LOAEL)和未观察到有害作用的剂量和未观察到有害作用的剂量(NOAEL)(NOAEL)。 亚急性、亚慢性及慢性毒性试验：相应的亚急性、

10、亚慢性及慢性毒性试验：相应的LOAELLOAEL和和NOAELNOAEL。 致畸试验：致畸试验：LOAELLOAEL和和NOAELNOAEL 致突变、致癌试验：表观的致突变、致癌试验：表观的LOAELLOAEL和和NOAELNOAEL。15四四. .毒性评价试验的基本目的毒性评价试验的基本目的1.1.药物毒作用的表现和性质药物毒作用的表现和性质2.2.剂量剂量- -反应反应( (效应效应) )研究研究3.3.确定毒作用的靶器官确定毒作用的靶器官4.4.确定损害的可逆性确定损害的可逆性5.5.其它其它 （1）毒作用的敏感检测指标和生物学标志 （2）毒作用机制研究 （3）受试物的毒物动力学和代谢研

11、究 （4）中毒的解救措施16四四. .毒性评价试验的基本目的毒性评价试验的基本目的1.1.药物毒作用的表现和性质药物毒作用的表现和性质2.2.剂量剂量- -反应反应( (效应效应) )研究研究3.3.确定毒作用的靶器官确定毒作用的靶器官4.4.确定损害的可逆性确定损害的可逆性5.5.其它其它 （1）毒作用的敏感检测指标和生物学标志 （2）毒作用机制研究 （3）受试物的毒物动力学和代谢研究 （4）中毒的解救措施17四四. .毒性评价试验的基本目的毒性评价试验的基本目的1.1.药物毒作用的表现和性质药物毒作用的表现和性质2.2.剂量剂量- -反应反应( (效应效应) )研究研究3.3.确定毒作用的

12、靶器官确定毒作用的靶器官4.4.确定损害的可逆性确定损害的可逆性5.5.其它其它 （1）毒作用的敏感检测指标和生物学标志 （2）毒作用机制研究 （3）受试物的毒物动力学和代谢研究 （4）中毒的解救措施18五五. .毒理学试验设计毒理学试验设计19环境条件环境条件(气温,气湿等)暴露暴露药物药物机体机体 毒效应毒效应化学结构理化性质 水溶性 脂/水分 配系数 挥发度 气/血分 配系数分散度纯度/杂质途径时间/频率溶剂稀释度交叉暴露物种,品系个体因素性别年龄生理状态营养/习惯疾病20五五. .毒理学试验设计要点毒理学试验设计要点1剂量分组 一般至少要设3个剂量组 高剂量组高剂量组 中剂量组 低剂量

13、组低剂量组 希望能得到满意的剂量-反应(效应)关系。(一) 体内毒理学试验设计21未处理对照组（空白对照组）：确定本底值，进行质量控制（常用于遗传毒理学试验）阴性（溶剂）对照：是染毒组比较的基础阳性对照：检测试验体系的有效性历史性对照：检测试验体系的稳定性对照组问题毒理学实践的基本手段之一就是比较分析。222各组动物数3试验期限231.测定药物的溶解性2.试验最高剂量的推荐3.代谢活化4.阳性对照5.重复 （二）体外毒理学试验设计24环境条件环境条件(气温,气湿等)暴露暴露药物药物机体机体 毒效应毒效应化学结构理化性质 水溶性 脂/水分 配系数 挥发度 气/血分 配系数分散度纯度/杂质途径时间

14、/频率溶剂稀释度交叉暴露物种,品系个体因素性别年龄生理状态营养/习惯疾病25六六. .药物药物1.受试样品的准备纯度及杂质成分化学结构和理化性质（挥发性和溶解性）相似化合物的毒性参考资料同种同一批号成分和配方必须固定稳定性受试物应一次备齐全部实验的用量。26受试物的准备n剂型：水溶液、油溶液或混悬液n对溶剂和助溶剂的要求：无毒，与受试物不起反应，稳定。n制剂要点n染毒容积：以受试的实验动物物种或制剂来确定。271.在制备制剂时加热受试物不应接近或者达到改变其化学性质或者物理性质的温度2.在评价固体受试物皮肤毒性时，应保持其形状和颗粒大小3.多成分的受试物应按照配方配制，使染毒制剂准确反映原混合

15、物4.制剂应保持化学稳定性和一致性5.制剂应减少总试验容积，利用溶剂或赋形剂的量不应过多。6.制剂应易于准确染毒7.制剂的pH应为5-9.8.不应用酸碱解离受试物，基于保护动物的原因，并避免改变肠道或者 肾小管内的pH值9.非胃肠道染毒，受试物应尽可能接近等渗28环境条件环境条件(气温,气湿等)暴露暴露药物药物机体机体 毒效应毒效应化学结构理化性质 水溶性 脂/水分 配系数 挥发度 气/血分 配系数分散度纯度/杂质途径时间/频率溶剂稀释度交叉暴露物种,品系个体因素性别年龄生理状态营养/习惯疾病29药物的化学结构药物的化学结构 物理化学性质化学活性ADME毒动学靶毒效学30化学结构对其毒性的影响

16、n同系物的碳原子数：烷、醇、酮等碳氢化合物按同系物相比，碳原子数愈多，则毒性愈大(甲醇与甲醛除外)。但当碳原子数超过一定限度时(79个)，毒性反而迅速下降。n取代基团：卤代烷烃、基团的位置不同也可能影响毒性n分子中不饱和键n构型异构：顺反异构和手性异构 3132药物的理化性质n溶解度： 水溶性：化学物在水中的溶解度直接影响其毒性大小，溶解度愈大，毒性愈大。 脂溶性：脂溶性物质易在脂肪中蓄积，易侵犯神经系统。n挥发度：n分散度n纯度和杂质：药物的纯度常常改变其毒性 33北医三院眼科用药34 上海华联抗癌药上海华联抗癌药(甲氨喋呤、阿甲氨喋呤、阿糖胞苷糖胞苷) 致残致残130多人多人(其中因厂方其

17、中因厂方瞒报药品被污染事实，导致真相延瞒报药品被污染事实，导致真相延迟揭示，药害例数增加数十人迟揭示，药害例数增加数十人)，症，症状为下肢疼痛乏力、进而行走困难状为下肢疼痛乏力、进而行走困难瘫痪等。瘫痪等。调查调查存在严重的质量管理混存在严重的质量管理混乱乱,导致导致5方面违规生产行为。部分方面违规生产行为。部分批次产品中混入了批次产品中混入了微量硫酸长春新微量硫酸长春新碱碱另一种不能用于鞘内注射的另一种不能用于鞘内注射的抗肿瘤药物（生产尾料未交三废处抗肿瘤药物（生产尾料未交三废处理人员，而由灌装工收集存放于储理人员，而由灌装工收集存放于储藏室，继续用于生产）。藏室，继续用于生产）。鞘内注射甲

18、氨蝶呤致鞘内注射甲氨蝶呤致患者双腿瘫痪变形患者双腿瘫痪变形35越战中美军使用落叶剂2、4、5-T（橙剂）TCDD36环境条件环境条件(气温,气湿等)暴露暴露药物药物机体机体 毒效应毒效应化学结构理化性质 水溶性 脂/水分 配系数 挥发度 气/血分 配系数分散度纯度/杂质途径时间/频率溶剂稀释度交叉暴露物种,品系个体因素性别年龄生理状态营养/习惯疾病37七七. .实验动物的选择和处理实验动物的选择和处理n毒理学的动物试验是以实验动物作为研究对象的，为获得可靠的研究结果，先决条件是正确地选用实验动物。38(一)实验动物物种的选择基本原则对受试物在代谢、生物化学和毒理学特 征与人最接近的物种敏感的物

19、种自然寿命不太长的物种易于饲养和实验操作的物种;经济并易于获得的物种39动物物种大鼠小鼠豚鼠兔狗地鼠弥猴小型猪鸡等等。40表1 常用实验动物生物学和生理学参数41 背肿了42（二）实验动物品系的选择1.近交系：C57、Balb/c、dba-1；shrn、ZDF大鼠、F344/DuCrlCrlj大鼠2.杂交群动物：3.封闭群：昆明种、ICR小鼠； F344大鼠、SD大鼠、wistar大鼠等43（三）对实验动物微生物控制的选择44（四）个体选择性别 年龄和体重 生理状态 健康状况45环境条件环境条件(气温,气湿等)暴露暴露药物药物机体机体 毒效应毒效应化学结构理化性质 水溶性 脂/水分 配系数 挥

20、发度 气/血分 配系数分散度纯度/杂质途径时间/频率溶剂稀释度交叉暴露物种,品系个体因素性别年龄生理状态营养/习惯疾病46n皮肤癌：n饮酒： 47环境条件环境条件(气温,气湿等)暴露暴露药物药物机体机体 毒效应毒效应化学结构理化性质 水溶性 脂/水分 配系数 挥发度 气/血分 配系数分散度纯度/杂质途径时间/频率溶剂稀释度交叉暴露物种,品系个体因素性别年龄生理状态营养/习惯疾病48（五）饲养条件合理的全营养饲料水温度和湿度空气清洁度人工照明的昼夜周期49（六）国家有关实验动物的质量 监督和质量合格证制度1998年实验动物管理条例试验动物微生物学和寄生虫学检测等级实验动物哺乳类动物遗传质量控制实

21、验动物全价营养饲料实验动物环境及设施50环境条件环境条件(气温,气湿等)暴露暴露药物药物机体机体 毒效应毒效应化学结构理化性质 水溶性 脂/水分 配系数 挥发度 气/血分 配系数分散度纯度/杂质途径时间/频率溶剂稀释度交叉暴露物种,品系个体因素性别年龄生理状态营养/习惯疾病51八八. .实验动物的染毒和处置实验动物的染毒和处置n雌雄分开饲养 57天的检疫（适应环境） 标记和分组。n实验动物分组的原则 要求所有的动物分配到各剂量组和对照组的机会均等，避免主观选择倾向，减少偏性，以保证结果的准确可靠。n正确的分组方法：随机分组(一)动物实验前的准备52(二)染毒途径n选择原则： 应尽可能模拟人在接

22、触该受试物的方式n途径：经口、经呼吸道、经皮及注射途径1.经口(胃肠道)染毒：灌胃、喂饲和吞咽胶囊2.经呼吸道染毒：吸入染毒（静式、动式）和气管内注入3.经皮肤染毒：备皮4.注射染毒：肌肉、皮下和静脉滴注（ip）53（1）经口(胃肠道)染毒n灌胃、喂饲和吞咽胶囊 喂饲：5%54(二)染毒途径n选择原则： 应尽可能模拟人在接触该受试物的方式n途径：经口、经呼吸道、经皮及注射途径1.经口(胃肠道)染毒：灌胃、喂饲和吞咽胶囊2.经呼吸道染毒：吸入染毒（静式、动式）和气管内注入3.经皮肤染毒：备皮4.注射染毒：肌肉、皮下和静脉滴注（ip）55（2）经呼吸道染毒：56(二)染毒途径n选择原则： 应尽可能

23、模拟人在接触该受试物的方式n途径：经口、经呼吸道、经皮及注射途径n经口(胃肠道)染毒：n经呼吸道染毒：n经皮肤染毒：备皮1.注射染毒57环境条件环境条件(气温,气湿等)暴露暴露药物药物机体机体 毒效应毒效应化学结构理化性质 水溶性 脂/水分 配系数 挥发度 气/血分 配系数分散度纯度/杂质途径时间/频率溶剂稀释度交叉暴露物种,品系个体因素性别年龄生理状态营养/习惯疾病58药物的联合作用n一种药物对机体的毒性作用，可以由于同时或先后接触另一种药物而使其所表现的联合毒性比任一单一药物的毒性增强或减弱，毒理学将两种或两种以上的药物对机体的交互作用称为联合作用(joint action)。59类型n相

24、加作用(additional joint action)n协同作用(synergistic effect)n加强作用(potentiation joint action)n拮抗作用(antagonistic joint action)n独立作用(independent effect ) 60环境条件环境条件(气温,气湿等)暴露暴露药物药物机体机体 毒效应毒效应化学结构理化性质 水溶性 脂/水分 配系数 挥发度 气/血分 配系数分散度纯度/杂质途径时间/频率溶剂稀释度交叉暴露物种,品系个体因素性别年龄生理状态营养/习惯疾病各种毒性反应死亡各种血相、生化、病理改变61(三)实验动物处死及生物标本采集1.实验动物处死方法2.血液采集3.尿液采集4.病理解剖和标本留取5.大体解剖 在实验动物处死后半小时内进行，解剖方法采用胸腔、腹腔脏器联合取出法。应观察有关脏器的外形和表面情况、颜色、边界和大小、质地、切面。对指定的脏器称重，并计算脏器系数。62病理解剖标准操作程序(大体解剖)动物固定在解剖板上，解剖颈部(颌下腺、腮腺、局部淋巴结等)取一侧乳腺及腹部皮肤；开腹并扩展切口( 胰、脾、生殖器官、肾、肾上腺、直肠、胃、十二指肠、空肠、回肠、肠系膜淋巴结、肝脏等 )开