实验七SDS-PAGE测定蛋白质的分ppt课件

1、实验七实验七 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 测定蛋白质分子量测定蛋白质分子量一、实验目的一、实验目的学习学习SDS-PAGE测定蛋白质分子量的原理测定蛋白质分子量的原理掌握垂直板电泳的操作方法掌握垂直板电泳的操作方法 聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(acrylamide，简称，简称Acr)和交联剂和交联剂N,N-甲叉双甲叉双丙烯酰胺丙烯酰胺(methylene-bisacrylamide,简称简称Bis)在催化剂和加速剂的作用下聚合并联成三维在催化剂和加速剂的作用下聚合并联成三维网状构造的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳网状构造的凝胶，以此凝胶为支持物

2、的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis，简称，简称PAGE)。 二、实验原理 SDS即十二烷基硫酸钠是阴离子去污剂，与大多即十二烷基硫酸钠是阴离子去污剂，与大多数蛋白质平均结合比为数蛋白质平均结合比为1.4g SDS/g蛋白质。由于蛋白质。由于SDS带有大量负电荷，当其与蛋白质结合时，所带有大量负电荷，当其与蛋白质结合时，所带的负电荷大大超越了天然蛋白质原有的负电荷，带的负电荷大大超越了天然蛋白质原有的负电荷，因此消除或掩盖了不同种类蛋白质间原有电荷的因此消除或掩盖了不同种类蛋白质间原有电荷的差别，使蛋白质均带有

3、一样密度的负电荷，因此差别，使蛋白质均带有一样密度的负电荷，因此可利用分子量差别将各种蛋白质分开。可利用分子量差别将各种蛋白质分开。 在蛋白质溶解液中，参与在蛋白质溶解液中，参与SDS和疏基乙醇，巯和疏基乙醇，巯基乙醇可使蛋白质分子中的二硫键复原，使多基乙醇可使蛋白质分子中的二硫键复原，使多肽分成单个亚单位。肽分成单个亚单位。SDS可使蛋白质的氢键、可使蛋白质的氢键、疏水键翻开，还引起蛋白质构象的改动。疏水键翻开，还引起蛋白质构象的改动。SDS-蛋白质复合物在水溶液中的外形近似雪茄形的蛋白质复合物在水溶液中的外形近似雪茄形的长椭圆棒。不同蛋白质长椭圆棒。不同蛋白质-SDS复合物的短轴一样复合物

4、的短轴一样 ，约约1.8nm，而长轴那么与蛋白质的，而长轴那么与蛋白质的Mr成正比。成正比。 蛋白质分子的迁移速度只取决于分子大小。分蛋白质分子的迁移速度只取决于分子大小。分子量在子量在15KD到到200KD之间时，之间时，lgMr=K-b*mR浓缩效应浓缩效应 1凝胶孔径的不延续性：在上述凝胶中，浓缩胶为大孔胶；分别胶为小孔胶。在电场作用下，样品颗粒在大孔胶中泳动的阻力小，挪动速度快；当进入小孔胶时，遭到的阻力大，挪动速度减慢。因此在两层凝胶交界处，样品迁移受阻而紧缩成很窄的区带。 2缓冲体系离子成分及pH值的不延续性： 浓缩胶pH6.8，Tris-Cl 0.5 mol/L；三羟甲基氨基甲烷

5、 分别胶pH8.8，Tris-Cl 1.5 mol/L 电极缓冲液pH=8.30，为Tirs-Gly缓冲液 浓缩胶，pH6.8，蛋白质分子的迁移率比Cl- 低，比Gly高。 3电位梯度不延续性：快离子电位梯度不延续性：快离子 Cl- 后面构成高电位梯度区，慢离子后面构成高电位梯度区，慢离子Gly前前面构成低电位梯度区，高电位梯度和低电面构成低电位梯度区，高电位梯度和低电位梯度之间的地方，构成一个稳定而不断位梯度之间的地方，构成一个稳定而不断向阳极挪动的界面，蛋白质分子在界面处向阳极挪动的界面，蛋白质分子在界面处浓缩成一个狭小的中间层。浓缩成一个狭小的中间层。 这种在电泳开场后产生的高电位梯度作

6、用这种在电泳开场后产生的高电位梯度作用于蛋白和甘氨酸慢离子加速前进，追逐快于蛋白和甘氨酸慢离子加速前进，追逐快离子。本来夹在快慢离子之间的蛋白区带，离子。本来夹在快慢离子之间的蛋白区带，在这个追逐中被逐渐地紧缩聚集成一条更在这个追逐中被逐渐地紧缩聚集成一条更为狭窄的区带。为狭窄的区带。 蛋白质离子进入分别胶后，条件有很大变化。由于蛋白质离子进入分别胶后，条件有很大变化。由于其其pH 升高升高(电泳进展时常超越电泳进展时常超越9.0)，使，使Gly 解离成负解离成负离子的效应添加；同时因凝胶的浓度升高，蛋白质的离子的效应添加；同时因凝胶的浓度升高，蛋白质的泳动遭到影响，迁移率急剧下降。此两项变化

7、，使泳动遭到影响，迁移率急剧下降。此两项变化，使Gly 的挪动超越蛋白质，上述的高电压梯度不复存在，的挪动超越蛋白质，上述的高电压梯度不复存在，蛋白质便在一个较均一的蛋白质便在一个较均一的pH 和电压梯度环境中，按和电压梯度环境中，按其分子的大小挪动。其分子的大小挪动。分别胶的孔径有一定的大小，对不同相对分子质量分别胶的孔径有一定的大小，对不同相对分子质量的蛋白质来说，经过时遭到的阻滞程度不同，即使净的蛋白质来说，经过时遭到的阻滞程度不同，即使净电荷相等的颗粒，也会由于这种分子筛的效应，把不电荷相等的颗粒，也会由于这种分子筛的效应，把不同大小的蛋白质相互分开。同大小的蛋白质相互分开。 分子筛效

8、应分子筛效应 在在pH8.9的分别胶中，各种带净电荷不同的的分别胶中，各种带净电荷不同的蛋白质有不同的迁移率。净电荷多，那么蛋白质有不同的迁移率。净电荷多，那么迁移快；迁移快； 反之，那么慢。反之，那么慢。 SDS-蛋白质复合物电荷密度一样，静电荷蛋白质复合物电荷密度一样，静电荷量与蛋白质分子量成相关。量与蛋白质分子量成相关。电荷效应电荷效应三、实验试剂三、实验试剂 低分子量规范蛋白protein marker： 兔磷酸化酶B MW=94000 牛血洁白蛋白 MW=66200 兔肌动蛋白 MW=45000 牛碳酸酐酶 MW=33000 蛋白A MW=26000 胰蛋白酶抑制剂 MW=20000

9、 鸡蛋清溶菌酶 MW=14400 (1) 单体母液单体母液 30%丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺混合溶液丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺混合溶液 210%SDS 31.0mol/L pH8.8 Tris-HCl缓冲液缓冲液 41.0mol/LpH6.8Tris-HCl缓冲液缓冲液 510%过硫酸铵过硫酸铵(APS)现配现用现配现用 作用：提供引发丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合的自在基作用：提供引发丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合的自在基 6TEMED四甲基乙二胺四甲基乙二胺 作用：加速过硫酸铵构成自在基作用：加速过硫酸铵构成自在基 (7) 2样品缓冲液样品缓冲液 SDS、 甘油、巯基乙醇、溴酚兰甘油、巯基乙醇、溴酚兰 (

10、8) 2电极缓冲液母液电极缓冲液母液pH8.3 Tris，Gly，SDS (9) 染色液考马斯亮蓝染料染色液考马斯亮蓝染料 (10) 脱色液脱色液 甲醇、冰醋酸甲醇、冰醋酸 水溶液水溶液 四、实验步骤四、实验步骤 1.将玻璃板洗净晾干将玻璃板洗净晾干, 预备预备2个干净的烧杯个干净的烧杯 2.把玻璃板在灌胶支架上固定好把玻璃板在灌胶支架上固定好3.配好分别胶配好分别胶12ml,用小烧杯延续平稳参与，用小烧杯延续平稳参与，至凹槽高度的大约至凹槽高度的大约7/10处，之后加处，之后加0.5cm高正丁高正丁醇或蒸馏水，静置醇或蒸馏水，静置50分钟分钟凝胶配制过程中，凝胶配制过程中，TEMED要在注胶

11、前再参要在注胶前再参与，否那么凝结后无法注胶与，否那么凝结后无法注胶 12%的分别胶的分别胶12ml 胶浓度胶浓度1212单体母液单体母液mlml4.804.80去离子水去离子水mlml4.204.20分别胶缓分别胶缓冲液冲液mlml3.003.001010APSAPSll5050TEMED(TEMED(l)l)1818 醇封的目的是为了使分别胶上沿平直，并排醇封的目的是为了使分别胶上沿平直，并排除气泡。除气泡。 凝胶聚合好的标志是胶与醇层之间构成明晰凝胶聚合好的标志是胶与醇层之间构成明晰的界面。的界面。4.倒出正丁醇倒出正丁醇,用去离子水清洗用去离子水清洗,并用滤纸吸干，并用滤纸吸干，配好浓

12、缩胶配好浓缩胶5ml，参与浓缩胶，迅速插入，参与浓缩胶，迅速插入样梳，静置约样梳，静置约50分钟。分钟。 样梳需一次平稳插入。梳口处不得有气泡，样梳需一次平稳插入。梳口处不得有气泡，梳底需程度。梳底需程度。 5.0%的浓缩胶的浓缩胶5ml胶浓度胶浓度5单体母液单体母液ml0.75去离子水去离子水ml3.00浓缩胶缓冲液浓缩胶缓冲液ml1.2510APSl40TEMED(l)125.拔出样梳后，将玻板固定在电泳槽上，参与拔出样梳后，将玻板固定在电泳槽上，参与电极缓冲液，上槽缓冲液液面要高过点样孔，电极缓冲液，上槽缓冲液液面要高过点样孔，下槽要没过电极。下槽要没过电极。6.点样点样Marker和待

13、测蛋白样，参与等体积的和待测蛋白样，参与等体积的2样品缓冲液样品缓冲液 加样前，样品在沸水中加热加样前，样品在沸水中加热3分钟，以除掉分钟，以除掉亚稳态聚合。亚稳态聚合。 7.开场电泳，电压开场电泳，电压100V，溴酚蓝进入分别胶后改，溴酚蓝进入分别胶后改为为150V，距凝胶底边约，距凝胶底边约0.5cm时，停顿电泳。时，停顿电泳。8.凝胶板剥离与染色凝胶板剥离与染色 电泳终了后撬开玻板，将电泳终了后撬开玻板，将凝胶放在大平皿内，参与染色液，染色凝胶放在大平皿内，参与染色液，染色12-15min。剥胶时要小心剥胶时要小心,坚持胶完好无损。坚持胶完好无损。9.脱色：染色后的凝胶用蒸馏水漂洗，再用脱色脱色：染色后的凝胶用蒸馏水漂洗，再用脱色液脱色液脱色,每脱色每脱色15min后换一次脱色液，脱色后换一次脱色液，脱色3次。次。五、实验结果分析五、实验结果分析绘制规范曲线：绘制规范曲线：log Mr = K - bmRlog Mr = K - bmR 蛋白质区带中心至分别胶上沿间隔蛋白质区带中心至分别胶上沿间隔 相对迁移率相对迁移率= = 溴酚蓝至分别胶上沿间隔溴酚蓝至分别胶上沿间隔 以每个蛋白规范的分