人脱细胞羊膜负载大鼠骨髓间充质干细胞构建组织工程膀胱的研究(

1、人脱细胞羊膜负载大鼠骨髓间充质干细胞构建组织工程膀胱的研究(一)    作者：王振显 蔡文清 庞国勋 宋永周 陈康宁 孙福振 杨涛【摘要】 目的 探讨人脱细胞羊膜（Human acellular amniotic membrane ，HAAM）负载大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)进行膀胱替代修复的可能性。方法 用去污剂洗涤和酶消化方法制备HAAM。将大鼠MSCs在体外培养、扩增、传代。取第4代干细胞用1%二甲亚砜（DMSO）预诱导8 h，然后应用膀胱匀浆上清液诱导7 d。将诱导分化后的MSCs接种于HAAM表面进行短暂体外培养，获得组织工程膀胱。将雄性大

2、鼠60只随机分为3组，行半膀胱切除术，然后分别采用负载干细胞后的HAAM（A组）、HAAM（B组）以及单纯缝合（C组）的方法进行修补，每组20只。分别于术后2、4、8 w测定膀胱容量、进行膀胱造影并取材观察组织再生情况。结果 去污剂洗涤联合酶消化法能有效去除人羊膜中的细胞成分，光镜及电镜观察无细胞成分残留，细胞相容性好。大鼠膀胱重建术后，A、B两组与C组膀胱最大容量(Volmax)比较有极显著性差异（P0.01），而A、B两组之间膀胱最大容量比较无显著性差异（P0.05）。组织学观察，2 w时HAAM即已吸收降解，膀胱移行细胞和平滑肌细胞开始形成，A组吻合修补区较厚，平滑肌细胞规则且丰富。结论

3、 HAAM作为膀胱移植物进行膀胱修补吸收降解迅速，负载MSCs后构建的组织工程膀胱是理想的替代修补材料。 【关键词】 膀胱；移植；脱细胞羊膜；生物医学工程最早应用组织工程学原理进行组织工程膀胱构建的是Wake forest大学医学院再生医学研究所的Atala等人，他们于1998年进行了同种异体狗再造膀胱的实验研究1。目前组织工程学技术的研究主要集中在二个方面：支架材料的研究与开发；种子细胞的培养和植入受损的组织，使其功能得到恢复。膀胱无细胞基质和小肠黏膜下层是目前报道最多的组织工程膀胱支架材料。羊膜是一种天然高分子生物材料，来源广泛，不违背伦理。本研究采用化学去污剂和酶消化的方法去除新鲜羊膜中

4、的细胞成分，保留细胞外基质，制备人脱细胞羊膜（HAAM）作为支架材料，并以大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)为种子细胞构建了组织工程膀胱，探讨异种来源的HAAM作为生物支架材料构建组织工程膀胱的可行性。1 材料与方法1.1 实验材料46周龄100150 g健康清洁级SD大鼠2只，8周龄220250 g大鼠4只，雌雄不限。8周龄以上成年健壮雄性300500 g大鼠60只，由河北医科大学实验动物中心提供。LDMEM及0.25%胰蛋白酶（Sigma公司），胎牛血清（北京元亨圣马公司）、,PBS液，二甲基亚砜（DMSO，美国R&D公司），1% TritonX100,小鼠抗大鼠平滑肌肌动蛋白一抗，

5、山羊抗小鼠二抗。日本Olympus荧光倒置显微镜IX71和光学显微镜CX31。SHZ88台式水浴恒温震荡器（江苏太仓市实验设备厂）。1.2 种子细胞培养1.2.1 SD大鼠MSCs的分离与原代培养246周龄大鼠2只，无菌取其双侧股骨、胫骨和胸骨，用LDMEM培养基冲出骨髓于离心管中，吹打制成单细胞悬液，离心后用生长培养基重悬。将细胞接种于培养瓶中，37、5% CO2环境下常规培养。1.2.2 大鼠膀胱匀浆上清液对MSCs的诱导分化 8周龄大鼠4只，无菌取其膀胱，立即用PBS液冲洗，匀浆、离心，取上清液用0.2 m的针头滤器过滤。取第4代MSCs以2×104/ml密度接种于预置盖玻片的

6、6孔培养板中培养2 d，使细胞贴壁。吸出培养基，换入含有1% DMSO的培养基预诱导8 h，然后换入膀胱匀浆上清液与DMEM为11的混合培养基培养7 d。期间换液1次。1.2.3 培养细胞免疫细胞化学染色鉴定及纯度计算诱导分化的MSCs以平滑肌肌动蛋白（SMactin）抗体行免疫细胞染色，以未进行诱导的MSCs为阴性对照，进行同样的染色处理。光学显微镜下观察，随机选择10个镜野，计算纯度,纯度染色细胞数/细胞总数，取平均值。1.3 HAAM制备1.3.1 羊膜的选材严格遵循供体医学标准。在获取健康胎盘后，PBS液反复冲洗，钝性分离羊膜与绒毛膜组织，去除羊膜基底面残存的绒毛膜和血管组织，浸泡于以

7、0.01 mol/L PBS液稀释的1% TritonX100中，反复震荡摇晃24 h，然后置入1%胰蛋白酶中再震荡摇晃4 h取出，PBS冲洗。制备好的单层羊膜为白色半透明的薄膜，有一定弹性及韧性，厚约0.1 mm。由于其较薄，缺乏一定的张力，尚不能用于手术修补。将68片处理好的单层羊膜按彼此纤维方向垂直的位置重叠，以200 W的可见光照射3 h，从而使其交联成0.60.8 mm的较厚补片，张力大大增加，能耐受缝合牵拉的力量。以钴60射线照射20 min消毒（20 kGy）后备用。1.3.2 HAAM细胞毒性测定按照文献3要求制备HAAM浸提液；取诱导分化的MSCs按1×104细胞/

8、孔接种于96孔板，正常培养基组为对照组，浸提液组为实验组；MTT法测定吸光度A值，计算细胞相对增殖率（RGR）,RGR实验组A值/对照组A值，并对材料毒性评分4。1.4 组织工程膀胱的构建1.4.1 MSCs接种诱导分化后的MSCs以2×104/ml密度接种于预置2 cm×2 cm HAAM的6孔培养板中后加培养基2 ml。置37、5%CO2培养箱内，在饱和湿度条件下复合培养。1.4.2 MSCs/HAAM复合物显微镜检查收获培养36 h的MSCs/HAAM复合物，HE染色光镜及扫描电镜检查。1.5 大鼠膀胱修复重建实验1.5.1 大鼠膀胱重建将60只兔随机分为3组，每组2

9、0只。麻醉后取下腹部正中切口，显露膀胱，游离膀胱周围组织，行半膀胱切除术，以婴幼儿输液器作为导尿管顺行置入，尿道外口处4号丝线妥善缝合固定尿管。A组以MSCs/HAAM复合物补片用50可吸收线缝合于膀胱缺损处，B组以单纯HAAM补片修补膀胱，C组不使用任何材料直接缝合。经尿管注水检查无漏尿。A、B两组以10丝线在吻合口前、后、左、右（浆膜面，避免穿透）各缝1针作为标记。C组吻合口上下端以10丝线缝合2针作为标记。尿管于术后7 d拔出。所有动物术后均肌肉注射青霉素抗感染3 d。1.5.2 术后膀胱检测分别于术后2、4、8 w时，每组取5只动物处死。处死前测定膀胱最大容积(Volmax)。方法是将

10、膀胱排空，用注射器经细尿管（婴幼儿输液器）向膀胱注入生理盐水，尿道外口有尿液滴出时注入的水量即为Volmax。解剖观察膀胱大体形态，并根据标记线取材固定，HE染色后光镜下观察组织学变化。第8周时各组动物进行膀胱造影后再进行前述处理。1.6 统计学方法数据采用x±s表示,组间比较采用t检验。2 结 果2.1 种子细胞培养原代培养的骨髓细胞成分复杂,形状不规则。79 d细胞长满瓶底，主要呈纺锤形细胞。诱导分化7 d后MSCs转变为梭形平滑肌样的细胞，融合后形成峰谷排列，部分细胞表现为SMactin染色阳性，胞浆呈现棕黄色。随机计数10个视野计算诱导分化率为（45.6±3.5）%

11、。未进行诱导的MSCs亦有少量细胞SMactin染色阳性（3.8±0.77）%。2.2 HAAM检测将经物理和酶处理的HAAM做HE染色，置光学显微镜下观察，可见大量浅红色胶原纤维未受损，无蓝染核物质，表面没有残留的细胞碎屑。扫描电镜下HAAM表面粗糙，一面为网状纤维结构，孔隙较多，大小不一。两面均无细胞残留(图1)。HAAM浸提液组细胞平均相对增殖率为88%，毒性评分为级（表1），证明所制备的HAAM组织相容性好，符合生物材料应用要求。表1 细胞相对增殖率和细胞毒性分级(略)2.3 组织工程膀胱构建复合培养36 h后HE染色观察可见HAAM材料上生长的细胞，部分融入支架材料内；扫描

12、电镜下可见MSCs生长良好，且有突起伸出固定于周围支架材料（图1）。2.4 大鼠重建膀胱的大体观察及容量测定A、B、C三组术后1 w内分别死亡5只、4只和1只，均死于尿外渗和膀胱周围感染。另外A、B两组均有一只动物有明显尿外渗（腹腔肿大），但未死亡，后尿外渗逐渐好转。术后2 w时重建膀胱被大网膜包绕，仔细分离后可见标记线内膀胱已愈合良好，但较薄，不能辨认出HAAM。4、8 w时仍可见局部黏连，A、B两组膀胱已达正常膀胱外观，C组膀胱明显缩小，局部黏连比A、B两组轻微。2 w时A组大鼠膀胱的Volmax为(1.21±0.60) ml，B组为(1.12±0.53) ml，两组比

13、较无统计学意义（P0.05），C组(0.75±0.41) ml,与A、B两组比较均有显著差别(P0.05)。随时间延长，4、8 w时大鼠的膀胱容量略有增加但两组仍无差别。8 w时膀胱造影见A、B两组重建的膀胱与正常膀胱相似，C组膀胱明显缩小（表2、图2）。2.5 重建膀胱的组织学观察A组和B组术后2 w时HAAM修复区已有上皮细胞和膀胱平滑肌细胞形成，但B组平滑肌和上皮层较薄，平滑肌不规则，A组则上皮层和平滑肌略厚，相对规则。两组均有嗜酸细胞和淋巴细胞等炎性细胞浸润（图3）；4和8 w时两组已经与正常膀胱组织无明显区别。C组2 w时切口区仅轻微炎性细胞浸润，无其他异常。表2 手术各组术后不同时间Volmax的测定结果（略）3 讨 论组织工程学是近年来新兴起的一门学科，受到了科学界的广泛关注。其核心是利用组织工程学技术与生命科学的成果，将活细胞与生物材料结合，修复、重建、维持、恢复或提高人体组织的功能5。组织工程的理想支架材料应该具备如下条件：有良好的组织相容性；生物可降解性；无免疫原性；具有多孔性和高空隙率，利于细胞的贴附和生长，诱导组织再生；可塑性；有一定机械强度。而HAAM作为一种天然细胞外基质生物材料，几乎具备以上各种生物特性，最有可能在组织体内完全再生，并可负载细胞生长。Meller