纳豆芽孢杆菌液体发酵生产_聚谷氨酸(1)

1、纳豆芽孢杆菌液体发酵生产-聚谷氨酸刘常金1,郑焕兰1,姜川2,杨婷 1,赵琤1(1.天津科技大学食品工程与生物技术学院,泰达BIO-X系统生物技术研究中心,天津 300457(2.天津城市建设学院环境与市政工程系,天津 300384摘要:本研究采用单因素实验和正交实验优化了纳豆芽孢杆菌(Bacillus subtilis natto液体发酵生产-聚谷氨酸的发酵培养基和发酵条件。结果表明,在25 g/L葡萄糖为碳源,15 g/L蛋白胨为氮源,谷氨酸钠添加量20 g/L的基础上,纳豆杆菌在pH为7.5,接种量为2%,摇床转速为150r/min, 装液量为50mL/250mL三角瓶的条件下液体发酵4

2、8 h,发酵液的-PGA产量达到11.97 g/L。产物水解后,经液相色谱检验,初步确定产物为-聚谷氨酸。利用SDS一PAGE电泳对发酵产物的分子量进行了测定,结果表明其并非是单一分子量的-PGA,而是多种不同分子量的混合体。关键词:纳豆芽孢杆菌;液体发酵;-聚谷氨酸;HPLC;SDS-PAGE中图分类号:Q814.1;文献标识码:B;文章篇号:1673-9078(200908-0935-05Production of -Poly Glutamic acid via Liquid Fermentation by Bacillus subtilis nattoLIU Chang-jin1, ZH

3、ENG Huan-lan1, JIANG Chuan2, YANG Ting1, ZHAO Cheng1(1.TEDA BIO-X Center for Systems Biotechnology, College of Food Engineering and Biotechnology,Tianjin University of Science & Technology, Tianjin 300457,China(2.Department of Environmental and Municipal Engineering, TianjinInstitute of Urban Co

4、nstruction, Tianjin 300384, ChinaAbstract: The optimum liquid fermentation technology of -Poly Glutamic acid(produced by Bacillus subtilis natto was obtained through single factor and orthogonal experiments. The results showed that the yield of was 11.97g/L under the following optimum conditions: gl

5、ucose content 2.5%, peptone content 1.5%, monosodium glutamate content 2%, pH 7.5, fermentation time 48 hours, the shaking speed 150 rpm and sample volume 50 mL in 250 mL shaking flask. The hydrolysate of the product was analyzed by HPLC and determined as -PGA. SDS-PAGE showed that the hydolysate wa

6、s the mixture of -PGA with different molecular weights.Key words: Bacillus subtilis natto; Liquid femertation;-Poly Glutamic acid;HPLC; SDS-PAGE-多聚谷氨酸Poly-glutmic acid,-PGA是一种高分子氨基酸聚合物,最早于1913年在炭疽芽孢杆菌的细胞荚膜中发现。多聚谷氨酸(以下简称-PGA是由L-谷氨酸和L-谷氨酸或D-谷氨酸单体之间通过氨基和羧基形成肽键之后生成的聚酰胺1,2,3,其分子式如下: 作为一种高分子量的聚合物,-PGA的分子链

7、上有大量游离羧基,使其具有一般聚羧酸的性质,因此其有很强的吸水性。此外-PGA还具有增稠、乳化、凝胶、成膜、保温、缓释、助溶和黏接等功能4,5。本文对用纳豆杆菌液体发酵生产-PGA的发酵条件的优化,分离收稿日期:2009-04-02作者简介:刘常金,食品工程与生物技术学院生物技术系主任 纯化及其结构初步分析。1 材料与方法1.1 菌株纳豆芽孢杆菌(Bacillus subtilis natto(本实验室保存,从日本纳豆中分离得到。1.2 试剂所用试剂为均为国产或进口分析纯。1.3 培养基斜面培养基(g/L:蛋白胨10,NaCl 10,酵母提取物5,琼脂粉20,pH 7.0。种子培养基(g/L:

8、蛋白胨10,NaCl 10,酵母提取物5。发酵基础培养基(g/L:葡萄糖20,蛋白胨10,谷氨酸钠20,Na2HPO4 1,NaH2PO4 1,MgSO4 0.5,pH 7.0。1.4 液体种子制备及摇瓶培养935将斜面生长的菌种用接种环接入到含50 mL种子培养基的250 mL的三角瓶中,摇床转速为120 r/min, 37 培养20 h后在以一定接种量接入到不同组成的发酵培养基中振荡培养。1.5 发酵液黏度的确定将发酵液离心去除菌体后,用NDJ-79型旋转式黏度计检测发酵液的黏度值。同样,将提取物用一定量蒸馏水稀释后检测黏度。黏度单位为mPas。1.6 -PGA产量的确定称重法。1.7 生

9、物量测定方法6分光光度测定法。1.8 分析方法1.8.1 培养条件优化首先采用单因素实验,初选各因素的合理范围。在此基础上,采用正交实验优化单因素实验。实验因素主要包括:发酵总时间、pH值、味精添加量、摇床转速和装液量等。1.8.2 -PGA水解后的高效液相分析1.8.2.1 水解条件取0.02 g样品,放入水解管中,加入10 mL 6 mol/L 的HCl,通入氮气,维持10 min后封口。110 水解24 h,冷却后移至10 mL容量瓶中。用超纯水洗涤3次,定容、过滤后取滤液分析氨基酸含量。1.8.2.2 衍生方法衍生剂:2,4-二硝基氟苯;衍生缓冲液:42 g/L Na2CO3;定容缓冲

10、液:3.4 g KH2PO4加入到145.5 mL 0.1 mol/L NaOH,用水定溶至500mL。10 L样品+150 L衍生缓冲剂+150 L衍生剂+690 L定容缓冲液,混匀,60 保温1 h,0.45 m膜过滤后备用。液相色谱条件:Agilent 1100高效液相色谱仪, Agilent TC-Cl8色谱柱(4.6 mm×250 mm,流动相A: V(乙腈:V(水=1:1,流动相B:NaAc-HAc (pH 6.4,柱温:30 ,流速0.8 mL/min,紫外检测器,波长:200 nm,进样量20 L。1.8.3 发酵产物分子量的测定SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-P

11、AGE:Bio-Rad 蛋白质电泳仪,10%分离胶,5%浓缩胶。0.1%的考马斯亮兰染色液染色1h,5%的甲醇和7%的冰醋酸与水混合液脱色过夜。2 结果与分析2.1 发酵条件对-PGA产量的影响2.1.1 培养温度的确定在装液量50 mL/250 mL三角瓶、pH7.0、发酵时间48h、2%接种量、120 r/min振荡培养的条件下,考察培养温度分别为25 、30 、35 、37 、40 、42 时对-PGA粗品产量的影响,结见图1。 图1 培养温度对-PGA产量的影响Fig.1 Effect of temperature on yield of -PGA如图1所示:纳豆菌在37的条件下,生物

12、量和-PGA粗品的产量达到最高值,这说明在此温度下菌体生长过程中起作用的酶系和-PGA合成酶系活力都很高。故确定37为最适培养温度。2.1.2 总发酵时间的确定在2.1.1的基础上,考察不同发酵时间对-PGA 粗品产量的影响。发酵结果见图2。 图2 总发酵时间对-PGA产量的影响 Fig.2 Effect of total fermentation time on yield of -PGA 如图2所示,发酵前48 h发酵粗提物产量不断增加,48h后提取物不断减少,说明48 h后发酵液中的菌体已经开始分解目标产物,所以实验取发酵48 h作为最佳发酵时间,进行-PGA的发酵生产。2.1.3 初始

13、pH的确定在2.1.2的基础上,考察发酵基础培养不同pH值(3.011.0对-PGA粗品产量的影响,结果见图3。发酵过程中培养基pH接近中性,聚谷氨酸因侧链具有游离的羧基而带有负电荷,并作为菌株荚膜的主要成分分泌至胞外,因而菌体表面带负电荷,由于同性电荷相斥,菌体不易聚集,而稳定悬浮于发酵液中。同时-PGA具有较高的分子量,在胞外不断积累使发酵液具有很高的黏度,从图3的三次平行实验可知,纳豆菌在pH 7.58.5的范围内黏度最大,说明此936937pH 范围内发酵液的黏性最高,发酵粗提物含量也相应最高。选择pH7.5为实验时的液体发酵pH 值。图3 初始pH 对发酵液黏度的影响Fig.3 Ef

14、fect of initiative pH on fermentation viscosity2.1.4 接种量的确定在2.1.3的基础上,考察接种量分别为1%、2%、3%、4%、5%、6%时对-PGA 产量的影响,见图4。 图4 接种量对-PGA 产量的影响 Fig.4 Effect of inoculums size on yield of -PGA由图4可知,接种量为2%时-PGA 的产量最高,高于这个接种量则导致菌体生长过快、基质缺乏或溶氧不足而造成-PGA 的产量下降;低于这个接种量由于发酵的适应期延长,同样造成-PGA 的产量下降。故确定2%为最佳接种量。 2.1.5 摇床转速的确

15、定摇床转速可以在一定程度上控制溶解氧的水平。在2.1.4实验的基础上,考察摇床转速分别为0 r/min 、70 r/min 、120 r/min 、150 r/min 、180 r/min 、200 r/min 时对-PGA 产量的影响,结果见图5。 图5 摇床转速对-PGA 产量的影响 Fig.5 Effect of shaking speed on yield of -PGA 由图5可知,转速为150 r/min 时,-PGA 的产量最高,故确定150 r/min 为最佳转速。 2.1.6 装液量的确定在2.1.5 的基础上,考察250 mL 三角瓶装液量分别为20 mL 、30 mL 、

16、40 mL 、50 mL 、60 mL 、70 mL 、80 mL 、90 mL 时对-PGA 产量的影响,结果见图6。由图6可知,装液量为50 mL 时,-PGA 的产量最高,故确定实验最适装液量为50 mL/250mL 三角瓶。 图6 装液量对-PGA 产量的影响 Fig.6 Effect of loading amount on yield of -PGA2.2 培养基组成对-PGA 产量的影响2.2.1 碳源对-PGA 产量的影响在不改变发酵基础培养基其他条件的情况下,选择葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、柠檬酸、可溶性淀粉、甘油为不同碳源代替基础培养基中碳源进行发酵产酶试验,结果见图7。

17、图7 不同碳源对-PGA 产量的影响 Fig.7 Effect of carbon source on yield of -PGA如图7所示,葡萄糖、蔗糖的发酵效果比其它碳源要好,而在这两种碳源中,葡萄糖的发酵效果比蔗糖的稍好,选择葡萄糖作为发酵生产的最佳碳源。 2.2.2 氮源对-PGA 产量的影响以葡萄糖为碳源,考察6种无机氮和3种有机氮分别做氮源时对-PGA 产量的影响,结果如图8。从图8知,添加蛋白胨的菌体生长状况最好,发酵产物的产量最高,故确定其为最适宜的氮源。 938图8不同氮源对-PGA 产量的影响 Fig.8 Effect of nitrogen source on yield

18、 of -PGA2.2.3 不同葡萄糖、蛋白胨和谷氨酸钠浓度对-PGA 产量的影响根据营养需求的不同,可将-PGA 生产菌分为两大类:谷氨酸依赖型和非谷氨酸依赖型。文献报道的生产实用菌一般都是谷氨酸依赖菌。如图9,在培养基中添加2.5%的-谷氨酸钠的-PGA 产量明显高于未添加谷氨酸钠的对照组。单因素实验结果表明葡萄糖和蛋白胨的最佳添加量为2%和1.5%。 图9 三种因素不同浓度条件下的-PGA产量 Fig.9 Effects of concentrations of three factors on yield of-PGA2.2.4 正交试验根据单因素试验结果,选取培养基中葡萄糖、蛋白胨和

19、谷氨酸钠这三个主要因素进行三水平正交试验(见表1。从表1知,在选定的因素水平内,对液体发酵-PGA 影响的主次顺序为:谷氨酸钠>葡萄糖>蛋白胨。8号试验组合-PGA 产量最高,再结合单因素实验的结果,因此,确定该菌的最佳发酵工艺为:葡萄糖25g/L ,蛋白胨15g/L ,谷氨酸钠20g/L 。 2.3 -PGA 的分离提纯液体发酵完后,发酵液在4000 r/min 离心10 min ,收集上清液,加34倍体积的预冷乙醇沉淀-PGA ,4 冰箱过夜,10000 r/min 离心20 min ,收集沉淀,冻干得到粗制品-PGA 。为了提纯-PGA ,将乙醇沉淀的-PGA 再溶于生理盐水

20、中,经14000 Da 透析除盐,再调pH 到23进行等电沉淀,4 下10000 r/min 离心20 min ,沉淀冻干得到精制-PGA 产品。表1 正交实验设计及实验结果 Table 1 Design and results of orthogonal testNo.Glucose (g/LPeptone (g/LMonosodium glutamate(g/LError item-PGA (g/L1 15 10 20 1 10.712 15 15 25 2 11.003 15 20 30 3 10.214 20 10 25 3 10.97 5 20 15 30 1 9.186 20 20

21、 20 2 10.057 25 10 30 2 9.158 25 15 20 3 11.979 25 20 2510.96K110.64010.27710.910 10.283 K210.06710.71710.977 10.067 K310.69310.4079.513 11.050 R 0.626 0.4401.4640.983 图10 谷氨酸标准品的HPLC图Fig.10 HPLC chromatogram of pure glutamic acid2.4 发酵产物的HPLC 分析 图11 发酵产物水解液的HPLC图Fig.11 HPLC chromatogram of hydrolys

22、ate of fermentationproduct将-PGA 水解后进行高效液相色谱分析。由图11发酵产物水解样品左侧第3个峰的出峰时间为6.10 min ,与图10的L-谷氨酸标准品的出峰时间一致,可以表明水解产物是L-谷氨酸。右侧为衍生剂峰。 2.5 SDS-PAGA 测定发酵产物的分子量从图12可知,发酵产物不是单一分子量的-PGA ,而是多种不同分子量的混合体。 图12 发酵产物的SDS一PAGA电泳Fig.12 SDS-PAGE of fermentation product3 结论本实验对纳豆杆菌生产-PGA的液体发酵工艺进行优化。在25g/L葡萄糖为碳源,15g/L蛋白胨为氮源

23、,谷氨酸钠添加量20g/L的基础上,纳豆杆菌在pH为7.5,接种量为2%,摇床转速为150 r/min,装液量为50mL/250mL三角瓶的条件下液体发酵48 h,发酵液的-PGA产量达到11.97 g/L。产物水解后,经液相色谱检验,初步确定产物为-聚谷氨酸。利用SDS一PAGE电泳对发酵产物的分子量进行了测定,结果表明其并非是单一分子量的-PGA,而是多种不同分子量的混合体。可以把它降解到一定分子量的范围,以满足对-PGA不同应用产品的研究开发。参考文献1桑莉,徐虹,李晖等.-聚谷氨酸产生菌的筛选及发酵条件J.过程工程学报.,2004年,4(5:462-4662王圣磊.产生-聚谷氨酸发酵的

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25、 of poly(-glutamic acid PolymerJ.Bulletin,1994,32:127-1326梁淑娃,黄晓曼,夏枫耿等.纳豆激酶液体深层发酵技术的研究J.现代食品科技,2007,23(6:1-3(上接第931页11NicolaVolpi, Francesca Maccari. Purification andcharacterization of hyaluronic acid from the mollusc bivalveMytilus galloprovincialisJ. Biochimie,2003,85:619-625 12Mohamad Warda, Eman M. Gouda, Toshihiko Toid, et al.Isolation andcharacterization of raw heparin from dromedaryintestine: evaluation of a new source of pharmaceuticalheparinJ. Comp