蒲黄总黄酮抑制棕榈酸培养下C2C12骨骼肌细胞白细胞介素6的表达

1、蒲黄总黄酮抑制棕榈酸培养下C2C12骨骼肌细胞白细胞介素6的表达 09-08-13 16:46:00 编辑：studa20作者：娄少颖, 刘毅, 陈伟华, 应健, 何燕铭, 王文健【摘要】 目的：观察蒲黄总黄酮（Pollen Typhae total flavones，PTF）对棕榈酸培养下C2C12骨骼肌细胞白细胞介素6（interleukin6, IL6）表达的影响，探讨PTF改善骨骼肌胰岛素抵抗（insulin resistance, IR）的可能机制。方法：0.25 mmol/L棕榈酸培养建立骨骼肌细胞IR模型。根据处理方法不同，设对照组、模型组、核转录因子B（nuclear fact

2、orkappaB, NFB）抑制剂PDTC组、罗格列酮（rosiglitazone, ROS）组、ROSPDTC组、PTF组和PTFPDTC抑制剂组。处理16 h后，3H脱氧葡萄糖摄入法观察细胞对葡萄糖的转运率，实时定量多聚酶联反应检测IL6 mRNA的表达，酶联免疫吸附测定法检测细胞培养上清中IL6蛋白水平。结果：0.25 mmol/L棕榈酸培养16 h，C2C12细胞葡萄糖摄取率下降30.43%，IR模型建立；PTF可使IR模型细胞葡萄糖转运率增加32.39%，IL6 mRNA表达及细胞培养上清液中IL6蛋白水平均显著下降，差异有统计学意义（P0.05）；加入PDTC后，细胞IL6 mRN

3、A表达及细胞培养上清液中IL6蛋白水平上升（P0.05）。结论：PTF通过抑制NFB通路而抑制C2C12骨骼肌细胞IL6 mRNA表达及蛋白分泌，可能是其减轻骨骼肌炎症状态和改善IR的机制之一。 【关键词】 蒲黄总黄酮; 棕榈酸; 胰岛素抵抗; 白细胞介素6; C2C12细胞株Objective: To observe the effects of Pollen Typhae total flavones (PTF) on expression of interleukin6 (IL6) mRNA and protein secretion in C2C12 cell strain of sk

4、eletal muscle cells cultured with palmitate, and to explore the mechanism of PTF in relieving insulin resistance (IR).Methods: The IR of C2C12 cells was induced by coculturing with palmitate. The C2C12 cells were divided into normal control group, untreated group, PDTC (a nuclear factorkappaB inhibi

5、tor) treated group, rosiglitazone (ROS)treated group, ROS+ PDTC treated group, PTFtreated group and PTF+PDTCtreated group. Sixteen hours after culture, the transportation rate of glucose was observed by 3Hdeoxyglucose uptake method; IL6 mRNA expression in C2C12 cells was assayed by real time polymer

6、ase chain reaction (Realtime PCR), and level of IL6 protein secretion in culture supernatant was detected by enzyme linked immunosorbent assay.Results: Compared with the normal control group, the transportation rate of glucose of cells in untreated group was decreased 30.43% after 16hour palmitate c

7、ulture, and was increased 32.39% in the PTFtreated group. Compared with the untreated group, the levels of IL6 mRNA expression in cells and IL6 protein secretion in supernatant were significantly decreased in the PTFtreated group (P0.05). The levels of IL6 mRNA expression in cells and IL6 protein se

8、cretion in supernatant were increased in PTF+PDTCtreated group as compared with PFTtreated group (P0.05).Conclusion: PTF can inhibit the IL6 mRNA expression and IL6 protein secretion via nuclear factorkappaB pathway in C2C12 skeletal muscle cells, which may be one of its mechanisms in relieving infl

9、ammation conditions and insulin resistance in C2C12 skeletal muscle cells.Keywords: Pollen Typhae total flavones; palmitate; insulin resistance; interleukin6; C2C12 cell strain脂质在骨骼肌中蓄积是引起骨骼肌胰岛素抵抗（insulin resistance, IR）的重要原因1。近年来越来越多的证据表明炎症与骨骼肌IR关系密切2。脂质蓄积导致核转录因子B（nuclear factorkappaB, NFB）途径被激活，使白

10、细胞介素6（interleukin6, IL6）、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factoralpha, TNF）和IL1等相关细胞因子显著增加3, 4。中医药在改善炎症状态和骨骼肌IR等方面有较好的疗效。本研究通过观察蒲黄的主要成分蒲黄总黄酮（Pollen Typhae total flavones, PTF）对棕榈酸诱导的处于IR状态的C2C12骨骼肌细胞IL6的影响，探讨PTF改善骨骼肌IR的可能机制。1 材料与方法1.1 细胞培养和分化 小鼠C2C12骨骼肌细胞株购自美国菌种保藏中心（American Type Culture Collection, ATCC），用含10

11、小牛血清的高糖达尔伯克改良伊格尔培养基（Dulbeccos modified Eagles medium, DMEM）培养，每3 d传代1次。于90细胞融合时换用含2马血清的DMEM进行诱导，2 d换液1次，诱导分化47 d，待95细胞被诱导分化出现肌管时用于实验5。1.2 药物与试剂 PTF由上海信谊药业有限公司提供。棕榈酸、吡咯烷二硫代氨基甲酸盐（pyrrolidine dithiocarbamate，PDTC）由Sigma公司提供，罗格列酮（rosiglitazone, ROS，分子量473.52）粉剂由浙江天马制药有限公司提供；IL6酶联免疫吸附测定（enzyme linked imm

12、unosorbent assay, ELISA）试剂盒由RD公司提供；3H脱氧葡萄糖由北京原子高科有限公司提供；TRIzol试剂由美国Invitrogen公司提供；BIO RAD Icycler 5色荧光定量聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR）仪、Icycler version3.1.7050荧光定量分析软件均由BIO RAD公司提供。1.3 实验药品配制 PTF的配制：取PTF 16 mg加入2 ml ddH2O中，溶解后配成8 g/L的原液，0.22 m过滤器抽滤除菌；ROS的配制：取ROS 47.352 mg加入5 ml DMSO中，溶解后配成2

13、104 mol/L的原液，0.22 m过滤器抽滤除菌。20 储存备用，临用前稀释。1.4 细胞分组和干预 在6孔或12孔板中培养和分化骨骼肌细胞，待细胞分化成熟之后，分组如下：正常对照组、模型组、模型PDTC（5 mmol/L）组、PTF组、PTFPDTC组、ROS组和ROSPDTC组。正常对照组含1牛血清白蛋白（bovine serum albumin, BSA）的DMEM培养，模型组细胞予含0.25 mmol/L棕榈酸和1 BSA的DMEM培养，在模型组基础上，PTF组加入0.5 g/L PTF，ROS组加入5 mol/L ROS，PDTC组加入PDTC，PTFPDTC组和ROSPDTC组

14、分别再加入2种相应药物，干预16 h。16 h后检测葡萄糖转运率，转运率下降率有统计学意义，提示IR模型建立成功5，可供实验用。1.5 葡萄糖摄取实验 IR模型细胞接种于24孔板，以克林二氏磷酸盐缓冲液（KrebsRinger phosphate buffer, KRPB）冲洗3次，再以含1 nmol/L胰岛素的KRPB洗3次，再以含100 nmol/L胰岛素的KRPB 37 孵育30 min； 加入1 ml含0.5 Ci/m1 3H脱氧葡萄糖，37 孵育20 min，以冰预冷的含10 mmol/L葡萄糖的PBS快速冲洗3次中止反应。加入1 ml 0.1 mol/L氢氧化钠作用2 h，取细胞裂

15、解液，液闪计数其每分钟衰变数6。1.6 实时定量PCR检测IL6 mRNA表达 （1）各组细胞药物干预16 h，吸去上清，分别收集各组细胞，按照Trizol试剂说明书方法提取细胞总RNA，以紫外分光光度计260 nm和280 nm波长测定RNA吸光度(absorbance, A)，用A260/A280比值确定RNA浓度；然后每个样本取2 g RNA，在RNA酶抑制剂以及反转录酶(MMLV)作用下将RNA逆转录为cDNA，20 保存备用。（2）IL6 上游引物：5CTG CAA GAG ACT TCC ATC CAG TT3，解链温度（melting temperature, Tm）58 ；下游

16、引物：5GAA GTA GGG AAG GCC GTG G3， Tm 59 ；探针：fam5CCT TCT TGG GAC TGA TGC TGG TGA CA3tamara，Tm 69 。内参甘油醛3磷酸脱氢酶（glyceraldehyde3phosphate dehydrogenase, GAPDH）上游引物：5GAC AAC TTT GGT ATC GTG GAA GG3，Tm 60 ；下游引物：5CCA GTA GAG GCA GGG ATG ATG T3， Tm 60 ；探针：fam5CTC ATG ACC ACA GTC CAT GCC ATC ACT3tamara，Tm 70 。

17、IL6扩增长度70 bp，内参GAPDH扩增长度140 bp；IL6及内参的引物均由上海生物工程技术服务有限公司合成。（3）荧光定量反应体系及反应条件：预混合的PCR反应液（荧光定量Master MIX）27.5 l，上、下游引物各0.6 l，探针0.3 l，模板（100 ng）1 l。扩增条件：95 3 min，95 20 s，60 20 s，扩增50个循环。（4）绘制曲线和分析结果：根据各样本的荧光定量PCR扩增曲线图，采用BIO RAD公司的Icycler Version 3.1.7050荧光定量分析软件，分析PCR过程中各检测样本的CT（cycle threshold）值。利用已知起始

18、拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表CT值，根据未知样品的CT值，从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。1.7 ELISA检测细胞培养上清中IL6蛋白浓度 准备好洗涤缓冲液和IL6标准品，所有样品和标准品做双份重复；将100 l标准品或样品，加入包被抗体的微孔板合适位置的微孔内；50 l生物素标记的抗IL6抗体加入包被抗体的微孔板的微孔内，轻摇板架，混匀，加盖，37 孵育120 min；洗涤微孔板；在每孔内加入100 l酶结合物，轻敲微孔板，使内容物充分混合，加盖，37 孵育60 min；在第2次孵育结束前15 min之内与底物溶液混合；按照上述方法重复洗板

19、；在每孔内加底物100 l，加盖，37 下孵育15 min；在每孔内加终止液100 l，轻敲微孔板，使内容物充分混合；在30 min内，用酶标仪在450 nm处测出光密度（optical density, OD）值。然后根据IL6标准品的浓度（ng/L）和其在450 nm处的OD值平均值绘制标准曲线。根据各样品的OD值分别计算出相应的样品浓度。1.8 统计学方法 采用Stata 7.0软件统计包进行数据处理。计量资料数据以xs表示，组间比较采用检验，计数资料采用检验。2 结果2.1 PTF对IR模型葡萄糖转运的影响 0.25 mmol/L棕榈酸培养骨骼肌细胞16 h，葡萄糖转运率明显下降，为正常对照组的69.57%（P0.05），根据Reaven等7提出的IR经典定义，并参考文献5，我们认为骨骼肌细胞IR模型建立成功。PTF组C2C12