呋喃香豆素类化合物的合成及乙酰胆碱酯酶抑制活性研究

1、呋喃香豆素类化合物的合成及乙酰胆碱酯酶抑制活性研究邵嘉亮 沈琼 马林* (中山大学化学与化工学院，广州 51027)摘要 以间苯二酚为原料，合.成了一系列呋喃香豆素类化合物，并对其进行结构修饰，得到新的芳香亚胺苯并呋喃香豆素类化合物，对这一系列化合物进行生物活性测试，表明大部分化合物有很好的抗乙酰胆碱酯酶活性。关键词 呋喃香豆素, 芳香亚胺苯并呋喃香豆素衍生物，合成，乙酰胆碱酯酶抑制剂1 前言呋喃香豆素类化合物是一种具有很强的生理活性、药理活性及生物活性的天然产物。具有抗凝血、抗肿瘤，抗病毒，抗血管硬化，增强自身免疫能力、抗细胞增生、抗菌、抗艾滋病、抗疲劳及钙拮抗性等功效。天然存在呋喃香豆素有

2、线型和角型两种类型。临床上用于治疗白癞风、银屑病、皮肤癌、乳腺癌，以及一些免疫功能缺失的疾病：艾滋病、风湿病、红斑狼疮、心脏移植中的排斥性反应等。乙酰胆碱酯酶 (acetylcholinesterase, AChE, EC3 .1 .1 .7. ),主要的生物学功能是在胆碱能神经突触处通过快速水解神经递质乙酰胆碱 (ACh)，而中止神经冲动的传递。阿尔茨海默病（Alzheimers disease, AD, 又称早老性痴呆，presenile dementia），主要病理特征是大脑萎缩，脑组织内产生A蛋白沉淀物和神经原纤维缠结，导致乙酰胆碱分泌不足。抑制AD病人乙酰胆碱酯酶的活力，延长脑内乙酰

3、胆碱的存在时间，使乙酰胆碱在脑内的含量增加，是当前治疗AD有效的手段之一。根据AD的病理表现以及乙酰胆碱酯酶的三维结构模型，本文合成了一系列芳香亚胺苯并呋喃香豆素类化合物，并测定了它们对于乙酰胆碱酯酶的抑制活性，发现效果很好。2 实验部分2.1 仪器与试剂熔点用 X4显微熔点仪测定，温度计未校正；UV用岛津UV-250IPC型紫外光谱仪测定；IR用Bruker EQUINOX55一型仪测定，KBr压片；1HNMR、13CNMR及相关谱用USA Varian公司UNITYINOVA500型仪测定，TMS为内标；移液枪是法国GILSON公司产品，Orion Model 720A pH计，Gunt

4、w28 恒温水浴锅。所用试剂均为分析纯，柱层析和薄层层析用硅胶为青岛海洋化工厂产品。生化试剂乙酰胆碱酯酶(acetyl- cholinesterase,ACh E, EC3 . 1 . 1 . 7. )，硫代乙酰胆碱 (Acetylthiocholine) ，5, 5-二硫代双 (2 -硝基苯甲酸 ) (DTNB) 都是Sigma公司产品。2.2 芳香亚胺苯并呋喃香豆素类化合物的合成基金项目 中山大学化学与化工学院第四届创新化学实验基金项目（批准号：03019）资助第一作者 邵嘉亮（1981年出生），男，中山大学化学与化工学院化学专业2000级联系人 马林 Email：cesmal 7-羟基-

5、4-甲基香豆素（1） 在250mL三颈瓶中加入浓硫酸100mL（比重1.84），用冰盐浴使温度降至10以下，在搅拌下通过滴液漏斗慢慢加入11g（0.1mol）间苯二酚和0.12mol乙酰乙酸乙酯组成的混合液，滴加速度以使反应温度维持在10以下为准。滴加完毕后在室温下放置4个小时，在搅拌下加入到200g碎冰和300mL水组成的冰水混合物中，抽滤，收集沉淀，并用冰水洗三次。得到的沉淀物溶于0.5%NaOH溶液中（约500mL），滤去不溶物，滤液用浓H2SO4调至pH=3，抽滤并用冰水洗。最后用80%乙醇重结晶，得到化合物(1)，产率为80%。-氧化环己氧基）香豆素（2） 在250mL三颈瓶中加入6

6、50mL干丙酮、0.02mol化合物（1）、50g无水K2CO3和0.05gKI。搅拌下慢慢升温，当丙酮回流时开始滴加含0.03mol 2-氯环己酮的丙酮溶液20mL，大约需要2个小时滴完。再反应10个小时后加入10g无水K2CO3，用TLC监控反应。当化合物（1）已经反应完全时停止反应，整个反应过程需时18个小时左右。冷却，过滤，弃去滤渣，蒸干滤液，用甲醇重结晶，得到化合物（2），产率为80。-1-苯并吡喃-2-酮（3） 在1000mL三颈瓶中加入32gNaOH（配成0.8mol/L溶液），搅拌，回流。在氮气保护下，加入0.01mol的化合物（2）。搅拌，回流，1.5个小时后停止反应，冷却，

7、将整个反应装置放在暗处，用2 mol/L的盐酸调节溶液的PH值，直到溶液有沉淀产生，抽滤，滤渣用甲醇重结晶，得到化合物（3），产率为95%。 在500mL三颈瓶中加入300mL甲苯和1g化合物（3），搅拌，回流，直到化合物（3）完全溶解。在氮气保护下加入3gDDQ，反应10分钟后加入Pd/C，搅拌回流4个小时，用TLC监控反应完全。趁热抽滤除去Pd/C，滤液浓缩后拌样，用石油醚：氯仿：乙酸乙酯9：1：1洗脱，蒸干洗脱液，用甲醇重结晶，得到化合物（4），产率为98%。 在50mL圆底烧瓶中加入15mL二甲苯和0.251g的化合物（4），剧烈搅拌，回流，待化合物（4）完全溶解后，加入Se

8、O20.3g，继续搅拌、回流20个小时。用薄层层析（TLC）监控反应完全，趁热抽滤，滤渣回收，滤液放置过夜让其自然结晶。抽滤，滤液回收，滤渣用二氯甲烷溶解，滤去杂质，滤液蒸干后得到化合物（5），产率为90%。 在50mL三颈瓶中，加入0.02g化合物（5）和12mL无水乙醇，搅拌下回流半小时后，在氮气保护下加入0.03g的经过纯化的芳胺，同时加入一滴乙酸，搅拌、回流2个小时后，冷却，放置过夜。抽滤，用无水乙醇洗三次，用丙酮重结晶，得到芳香亚胺苯并香豆素类化合物（6a6k）。2.3 芳香亚胺苯并呋喃香豆素类化合物对乙酰胆碱酯酶活性抑制分析取6支1.5mL装有840mL 0.1M pH=8.0的磷

9、酸盐缓冲溶液的梨型管，依次加入0，5，10，20，40，50m L 1.0mM的样品溶液，用DMSO补齐至50 L，加入50m L 4mg/mL 5,5-二硫代双（2-硝基苯甲酸）溶液和10m L乙酰胆碱酯酶溶液（0.1mg/ml），在37保温15min，立即加入50m L 2mg/mL硫代乙酰胆碱溶液，摇匀后测其在412nm处吸光度。参比用950m L 0.1M pH=8.0的磷酸盐缓冲溶液和50m L DMSO。以酶的相对活力对抑制剂浓度作图，根据抑制曲线求得各种化合物的IC50值（抑制酶活力50时的抑制剂浓度）。 取7支分别装有840、850、855、860、865、880、885m L

10、 0.1M pH=8.0的磷酸盐缓冲溶液的梨型管，加入一定量的样品DMSO溶液，用DMSO补至DMSO占总体积5，加入50m L 4mg/mL 5,5-二硫代双（2-硝基苯甲酸）溶液和10m L乙酰胆碱酯酶溶液，在37保温15min，立即加入50、40、35、30、25、10、5m L 2mg/mL硫代乙酰胆碱溶液，摇匀后在412nm处测其吸光度的时间扫描曲线，曲线的斜率即为反应的初速度（V），然后以1/V对1/S作图，以不加抑制剂的为控制线。3 结果与讨论3.1 合成路线合成的一系列芳香亚胺苯并呋喃香豆素类化合物（6a-6k）如下：3.2 合成研究在由合成香豆素类化合物时，反应中必须严格控制

11、温度在0以下。而将反应物滴加至浓H2SO4的过程中，反应放出大量的热，故要在冰盐浴中进行。在中间体（2）的合成中，用二氯环己酮为原料，在反应混合物中加入少量KI，是利用碘离子高亲核性，以提高反应速率。反应中加入K2CO3的作用是将化合物（1）的七位羟基变成氧负离子，增强它的亲核性，以及除去产物中的HCl或HI，使平衡向产物方向移动，从而提高产率。在整个反应体系中要保持无水，故K2CO3还可以吸收反应过程中生成的水，用作溶剂的丙酮也应为无水丙酮，是由市售95%丙酮干燥后再蒸馏而得。在中间体（3）的合成中，关键地方是NaOH的浓度和反应的时间。NaOH溶液的浓度要在0.8mol/L左右，反应时间要

12、控制在2个小时。如果NaOH的浓度太高，反应时间太长，产率就会低，甚至得不到。在中间体（4）的合成中，用氮气保护时，应首先通入一段时间氮气，然后在加入DDQ后也要用氮气保护，否则DDQ会被氧化。加入Pd/C可使反应时间缩短，并使反应顺利进行。在中间体（5）的合成中，起氧化作用的是亚碲酸，因此溶剂应该含有一些水，使SeO2能在高温下与水作用生成亚碲酸。在目标化合物（6）的合成中，由于芳胺类化合物易被氧化，因此在反应前必须纯化，同时反应过程中应用氮气保护。3.3 化合物对乙酰胆碱酯酶的抑制活性分析Compd.IC50(mM )inhibitor typeCompd.IC50(mM )inhibit

13、or type231.773-6e4.254非竞争390.390-6f7.478竞争4144.144-6g74.661-555.518-6h48.494-6a18.634非竞争6i13.056非竞争6b12.956非竞争6j10.605非竞争6c30.085非竞争他克林2.826非竞争6d6.679非竞争表 化合物对乙酰胆碱酯酶的抑制活性IC50(mM )与抑制类型将上市药物（他克林）与合成的芳香亚胺苯并香豆素类化合物在同一条件下测定对乙酰胆碱酯酶抑制活性，发现他克林的IC50为2.826mM，而芳香亚胺苯并香豆素类化合物IC50在470mM之间。含有吸电子基团-COOH的两个化合物6g和6h

14、的IC50超过了40mM，说明吸电子基团会引起抑制活性降低。在含有供电子基团的化合物中，邻位含有供电子基团的抑制活性普遍要比对位的好，其中尤以含有OCH3 6e的活性最好。随着抑制剂的浓度增加，乙酰胆碱酯酶的活力减少，并且不同浓度抑制剂所得的Lineweaver-Burk 曲线也交在横轴同一点处，证明化合物是乙酰胆碱酯酶的非竞争性抑制剂(6f例外)。化合物6f是竞争型抑制剂，说明这个化合物是通过了AchE的谷内壁14个芳香族氨基酸残基组成的芳香峡谷，结合到酶的活性中心上，形成EI复合物。化合物6a、6b、6c、6d、6e、6i和6j都是非竞争型抑制剂，说明这七个化合物没有进入酶的活性中心，而是

15、与酶的其他部位相结合来抑制酶的活性。m的测定图硫代乙酰胆碱的 Lineweaver-Burk图对于一个酶反应来说，Km值是酶学研究的一个重要数据，它反应了酶同底物的亲和力大小。由上图可以看出，硫代乙酰胆碱与乙酰胆碱酯酶反应的Km值为1.88mM。Km越小，即达到最大酶促反应速度一半所需要的底物浓度越小，由此表明乙酰胆碱酯酶与底物硫代乙酰胆碱的亲和力大。i的测定图 二次作图法确定化合物6e的抑制常数以6e为例，将Lineweaver-Burk图中不同Io下所做直线的斜率对相应的Io进行二次作图后，仍然得到一条直线，该直线的横轴截距就是Ki。各个化合物的抑制常数具体见表22。化合物6a6b6c6d

16、6e6f6i6kKi(m M)47.4818.8472.6236.6819.6622.2514.6915.31表 化合物对乙酰胆碱酯酶的抑制常数Ki抑制常数Ki是表征抑制剂对酶促反应抑制效率的重要参数，从上表可以看出，Ki的值14-72mM之间，表明抑制剂和酶的亲和力都比较大，结合都比较好，因此抑制性强。化合物原化合物IC50(m M)固定他克林(m L)协同后IC50(m M)0.1mM他克林IC50(m M)固定化合物(m L)协同后他克林IC50(m M)6a18.6345-9.15086.6696b12.956522.1029.150512.0016d6.67955.7609.1505

17、4.3506e4.254517.3009.15055.6606f7.7485-9.150105.9406i13.05659.1519.150104.1206j10.6055-9.150105.930表 化合物与他克林协同后对乙酰胆碱酯酶的抑制活性IC50值由于上市药物他克林是乙酰胆碱酯酶的非竞争性抑制剂，而我们合成的芳香亚胺苯并香豆素类化合物大多数也是非竞争性抑制剂，他们之间可以产生协同抑制作用。表表明，固定他克林的量后，测定芳香亚胺苯并香豆素类化合物的IC50，结果显示在他克林的协同抑制下，IC50降低有6d和6i；固定化合物的量后，测定他克林的IC50，结果显示在化合物6a、6d、6e、6

18、f、6i和6j的协同抑制下，IC50有所降低。综合两个表看出，化合物6d和 6i和他克林的协同抑制效果最好，有进一步作为研制前药的价值。对合成的一系列的芳香亚胺苯并香豆素类化合物观察其抑制细胞增生，抗肿瘤活性，与DNA结合的能力（通过UV、CD、荧光等手段）。致谢 本研究是在马林教授，沈琼师姐以及庞朝乐师兄的悉心指导和帮助下完成的，他们对科学严谨的态度和孜孜不倦的精神使我受益菲浅，在此对他们表示衷心的感谢。参 考 文 献2 Junko Maruyana. Studies on Stable Diazoalkanes as Potential Fluorogenic Reagents. I. 7

19、-Substituted 4-Diazomethylocoumarins. Chem. Pharm. Bull. 21(9)3014-2023(1983)3 Li Huang, Yoshiki Kashiwada, L.Mark Cosentino. et al. Anti-AIDS Agents.15. Synthesis and Anti-HIV Activity of dihydroseselins and Related Analogs. J.Med. Chem. 1994,37,3947-3955.4董悦生, 郑智慧, 张谦等. 微生物来源的乙酰胆碱酯酶抑制剂N98-1021A的研究

20、. 中国抗生素杂志, 2002, 27(5):260-2635 Sussmann J L., Havel M., Frolow F., et al. Atomic structure of acetylcholinesterase from Torpedo californica:A prototypic acetylcholine-binding protein. Science, 1 991, 235:8726 Plgar L., Hulasz P. Current problems in mecha-nistic studies of serine and cysteine proteinases. Biochem. J., 1982 ,207:1-10.7 Sussman J L, Hare M, Frolow F. et al., Atomic structure of acetycholinesterase from Torpedocalifornica, aproto typic acetylcholine binding protein. Science, 1991, 253(50222): 872-879.8 朱维良, 蒋华良. 用量子化学方法研究石杉碱甲及石杉碱甲-乙酰胆碱酯酶复合物. 第三届中国新医药博士论坛论文集, 上海,