植物热激反应及其信号转导途径

关于植物热激反应及其信号转导途径第1页，共81页，2022年，5月20日，2点1分，星期五

第八章植物热激反应及其信号转导途径第一节植物的热胁迫第2页，共81页，2022年，5月20日，2点1分，星期五第一节植物的热胁迫一、高温逆境与植物外观形态及生长发育的关系二、耐热性与细胞膜系统稳定性及植物器官结构、超微结构的关系三、高温对蛋白质代谢与保护酶系统的影响四、与植物耐热性相关的其它物质五、高温对光合、呼吸及蒸腾作用的影响第3页，共81页，2022年，5月20日，2点1分，星期五第一节植物的热胁迫

气候预测表明，温室效应将导致全球性气温上升，整个种植业面临高温挑战，因此有关植物抗热性的研究变得日趋重要。通常情况下，将由高温引起植物伤害的现象称为热害(heatinjury)。植物对高温胁迫的适应则称为抗热性(heatresistance)。但热害的温度很难定量，因为不同类型植物对高温的忍耐程度有很大差异。根据植物对温度的反应可分为如下几类：1）喜冷植物：如某些藻类、细菌和真菌，生长温度在零上低温(0～20℃)，当温度在15～20℃以上即受高温伤害；2）中生植物：如水生和阴生的高等植物，地衣和苔藓等，生长温度为10～30℃，超过35℃就会受伤；3）喜温植物：其中第4页，共81页，2022年，5月20日，2点1分，星期五

有些植物在45℃以上才受伤害，称为适度喜温植物，例如陆生高等植物，某些隐花植物；有些植物则在65～100℃才受害，称为极度喜温植物，如蓝绿藻、真菌和细菌等。发生热害的温度和作用时间有关，即致伤的高温和暴露的时间成反比，暴露时间愈短，植物可忍耐的温度愈高。下面主要介绍高温胁迫下植物体外观形态、细胞超微结构及生理生化方面发生的变化。

一、高温逆境与植物外观形态及生长发育的关系高温胁迫下，植物生长发育会受到不同程度的影响，外观主要体现在形态结构变化上。高温下，植物保持庞大的根系和活力，与植物的抗热第5页，共81页，2022年，5月20日，2点1分，星期五

性有较紧密的联系。Kuo等在大白菜上的研究发现耐热材科的根生长旺盛，而高温限制了热敏材科根系的生长，并且耐热材料在炎热的夏季形成叶球的能力与其根系生长良好有关．叶是光合作用主要器官，面高温下植物蒸腾失水也主要通过叶片进行。热胁迫常引起植物叶片茸毛、蜡质、角质层厚度、气孔数量和开度以及栅栏细胞的排列发生变化。在猕猴桃上发现，抗热品种热胁边下叶片和栅栏组织增厚，栅栏组织／海绵组织比值较高，避免了高温高热条件下水分的过皮蒸发。对于食用果实、种子的蔬菜作物来说，高温下配子体能保持正常的授扮受精能力，是植物具有较强抗性的一个重要指标。高温能增加第6页，共81页，2022年，5月20日，2点1分，星期五

花粉粒总数。而不耐热基因型较耐热基因型在高温下产生更多的“畸形”花粉粒，“畸形”花粉粒在花药开裂前已萌发，外形小，内含物少，用TTC染色已丧失活力。植物的外观形态也可作为鉴定植物耐热性的指标。二、耐热性与细胞膜系统稳定性及植物器官结构、超微结构的关系细胞膜系统是热损伤和抗热的中心，细胞膜的热稳定性反映了植物耐热能力。1977年Sullivan首次将电导法用于测定细胞膜热稳定性，此后该法被普遍应用。目前人们大多将细胞膜热稳定性和高温半致死温度、时间作为植物抗热性的鉴定指标。但也有不同的报道，如第7页，共81页，2022年，5月20日，2点1分，星期五

在对大白菜的研究中发现电导率与耐热性的关系并不显著；利用电导法测定黄瓜的耐热性存在滞后性。细胞膜稳定性与膜脂的脂肪酸饱和程度有关，植物体内脂肪酸的高度饱和有利于提高膜的相变温度。高温会加剧膜脂过氧化作用，甚至会损伤植物细胞膜系统，此过程的产物之一是丙二醛(MDA)，它常被作为膜脂过氧化作用的一个主要指标，但对其能否作为一项耐热性的筛选指标尚未达成一致意见。通过对高温下植物微观结构变化的观测，可以为耐热育种提供细胞学的理论依据。萝卜耐热品种比感热品种叶表皮气孔密度大，体积小，开度小，部分呈关闭状态，叶片厚，叶肉细胞第8页，共81页，2022年，5月20日，2点1分，星期五

排列紧密且很少出现质壁分离现象。耐热品种叶柄内维管束总面积是感热品种的1.5倍以上且有发达的形成层和厚壁组织，故其保水能力强。耐热品种叶片和栅栏组织较厚，栅栏组织/海绵组织比例及气孔密度较大。尽管甘蓝叶片的蜡粉密度及结构与它对光的反射有关，但对其抗热性无影响，通过扫描电镜观察到耐热品种叶片表面蜡粉晶粒致密，故认为耐热性可能与蜡粉晶粒的结构和数量有关，并进而影响结球能力。在对甘蓝的研究中发现高温下核膜、核仁、核质都会受到不同程度的破坏，特别是核仁逐渐消失，核内聚集很多染色较深的纤维状颗粒，细胞壁周围和叶绿体内也出现了这种第9页，共81页，2022年，5月20日，2点1分，星期五

物质，这可能是细胞受高温胁迫的重要标志之一，同时他指出叶片中不同细胞器对高温的敏感程度不同。高温引起的植物体结构上的变化必然会使植物体的某些功能发生改变，从这些变化中找出与耐热性相关的结构特征，既可以为耐热育种提供理论依据又可以从生物物理学的角度来对植物耐热性进行深层次的探讨。但目前这方面的研究大多仅限于对高温逆境下植株结构变化的观察，而对于这些变化发生的原因及产生的后果均未见报道。第10页，共81页，2022年，5月20日，2点1分，星期五三、高温对蛋白质代谢与保护酶系统的影响高温胁迫使蛋白质降解，游离氨基酸含量增加，特别是引起脯氨酸大量积累。由于各种胁迫都可引起脯氨酸积累，所以有人认为可将其作为逆境胁迫的一个鉴定指标。高温胁迫引起的膜脂过氧化过程中O-２、H２O２等有毒物质的产生速度与保护酶系统在高温下的活性共同决定着植物的耐热性。热胁迫时过氧化物酶(POD)活性先下降后升高，且耐热品种无论在高温或是常温条件下POD活性均较感热品种高，这可能与POD具有很好的热稳定性有关。甘蓝的POD在38℃下热激10min仍能保持较高活性，在研究大白菜时发现热激后POD活性下降，过氧化氢酶第11页，共81页，2022年，5月20日，2点1分，星期五(CAT)活性提高，超氧化物歧化酶(SOD)活性先提高后下降。尽管SOD可清除Oˉ2，减轻膜脂过氧化对细胞内其它部位的伤害，但这种保护作用是有限的；抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性过低造成的H２O２过量积累，不仅抑制了SOD的活性，而且使膜脂过氧化，蛋白质交联，DNA降解。植物中的H２O２主要是由APX清除的，而CAT的作用不大，其原因可能是CAT酶促反应具有较高的Km值而无法使H２O２浓度降到不足以伤害细胞的阈值以下。从以上研究可知，高温条件下植物体内生化代谢变化复杂，常因研究者采用的材料、方法不同而得出不同的结果，这一现象还有待于进一步研究。第12页，共81页，2022年，5月20日，2点1分，星期五四、与植物耐热性相关的其它物质乙烯的产生可以提高植物对热胁迫的抵抗能力。高温胁迫可使辣椒中乙烯含量发生变化，花对乙烯的敏感性以及花内的乙烯含量与抗热性有关，但前者可能对异常落花的影响更大；脱落酸(ABA)在提高植物的抗性方面作用显著，但蔓生菜豆中高温胁迫与ABA并无相关性，同时他发现吲哚乙酸(IAA)从花芽内的输出量与植物耐热性有关，但ABA在高温条件下可使叶温升到抑制蒸腾作用的程度，从而加重高温伤害。水杨酸(SA)可抑制CAT的活性，使POD活性提高，促进SOD基因的表达。植物可以通过改变SA的含量来传递逆境信息，使未遭受逆境的部位获得第13页，共81页，2022年，5月20日，2点1分，星期五

抗性。泛肽可以通过产生热激蛋白(HSPs)对细胞进行保护，但在40℃以上高温条件下的蛋白质代谢过程中泛肽并没有参与。此外，由于多胺与植物逆境胁迫反应关系密切，高等植物也可通过多胺来调节一系列生理反应，以适应热胁迫，但这方面研究较少。激素等植物内源次生化合物在蔬菜作物抵御逆境胁迫中具有十分重要的作用，但由于其含量甚微，目前仍有许多问题尚待研究和探讨，尤其对其发生作用的分子机理应加以深入研究。第14页，共81页，2022年，5月20日，2点1分，星期五五、高温对光合、呼吸及蒸腾作用的影响高温会损伤叶绿体、线粒体的结构，使光合色素降解，抑制光合作用，促进呼吸作用。高温下气孔导度、气孔限制值、表观量子效率及羧化效率均下降，细胞间隙CO２浓度上升。由此可知，叶片光合机构遭破坏的非气孔因素是净光合速率降低的主要原因，而且，高温处理初期净光合率下降以气孔限制因素为主，随着时间的延长，则以非气孔限制为主。气孔开放被抑制可能是矿质元素间的拮抗作用所致。热激导致的净光合率下降的原因可能是光合磷酸化受阻，尽管RuBP羧化酶本身是热稳定的，但随光合磷酸化下降它对光能的活性也下降。第15页，共81页，2022年，5月20日，2点1分，星期五

同时，他认为光合器官的热稳定性与类囊体膜超微结构有关，甘蓝热敏品种在38～39℃高温胁迫下叶绿体膜断裂、解体，类囊体片层松散、排列紊乱、基质片层模糊不清，说明热胁迫下微观结构的稳定性同抗热性是密切相关的。番茄、茄子、马铃薯等在高温胁迫下光合系统I(PSI)发生不可逆性抑制，而光合系统II(PSII)对热胁迫有较强的抵抗力。高温胁迫对PS中心除了瞬时钝化作用外，还存在间接的、较为缓慢的钝化作用。其原因可能是高温胁迫激活了类囊体膜上的脂肪酶，使富含不饱和脂肪酸的类囊体膜脂降解，形成自由的不饱和脂肪酸，从而钝化反应中心。第16页，共81页，2022年，5月20日，2点1分，星期五

高温对光合、呼吸、蒸腾作用的影响目前已经基本清楚，且三者间存在着相互作用，但对于其作用机理仍存在争议，因为各种生理过程均涉及到复杂的生化变化，并与细胞及各种细胞器的物理结构的变化有关。从上述可以看出，高温对植物造成的伤害是多方面的，但最主要的是对胞内酶的破坏，造成细胞正常的代谢受阻，导致生长发育中止或者引起细胞死亡。但是植物体对高温胁迫的响应并不是完全被动的，会发生相应的适应反应来降低胁迫造成的伤害，以维持基本的生理代谢；甚至通过开启某些基因的表达对高温产生抗性。这一过程中最显著的生理变化是：第17页，共81页，2022年，5月20日，2点1分，星期五

正常的蛋白合成受到抑制，细胞转向合成热激蛋白。大量的研究工作业已证实主要的热激蛋白都具有“分子监护蛋白”(molecularchaperone，CPN)的功能，这从一个侧面解释了为什么热激蛋白的合成可以赋予生物体耐高温的能力，从另一角度讲，大部分监护蛋白具有热激诱导特征。因此热激蛋白和监护蛋白是从不同角度对同一类蛋白的描述。

Ritossa于1962年首先在果蝇中发现这种现象，十几年后Tissieres发现热激蛋白。现已证明，从细菌到人，所有生物都可对热激产生反应，而且除温度外，其它许多因子例如氨基酸类似物、高盐浓度、厌氧、水分胁迫、低温、第18页，共81页，2022年，5月20日，2点1分，星期五

重金属离子、亚砷酸盐、乙醇、营养饥饿、2,4-D、ABA等都可以诱导热激反应，合成的HSPs参与生物的许多代谢过程。目前对HSPs的功能、结构、基因表达的调控等都进行了许多研究，积累了大量的资料。第19页，共81页，2022年，5月20日，2点1分，星期五

第八章植物热激反应及其信号转导途径第一节植物的热胁迫第二节植物的热激蛋白家族第20页，共81页，2022年，5月20日，2点1分，星期五第二节植物的热激蛋白家族一、HSPs的分类和定位二、热激反应的特点三、热激蛋白的功能第21页，共81页，2022年，5月20日，2点1分，星期五第二节植物的热激蛋白家族在高于正常生长温度5℃以上时，生物体大部分正常蛋白质的合成和mRNA的转录被抑制，同时迅速合成一些新的蛋白质称之为热激蛋白(heatshockproteins，HSPs)，这种现象叫做热激反应(heatshockresponse，HSR)。一、HSPs的分类和定位按照SDS电泳的表观分子量大小可以把植物HSPs分为五大类：HSP110，HSP90，HSP70，HSP60以及小分子量热激蛋白smHSPs。第22页，共81页，2022年，5月20日，2点1分，星期五HSP60以上的又统称HMWHSPs(highmolecularweightHSPs)或laHSPs(largeHSPs)。smHSPs包括细胞质Ⅰ类smHSPs、细胞质Ⅱ类smHSPs、叶绿体smHSPs、线粒体smHSPs和内膜smHSPs等。除热激外，正常生活的细胞中也有HSPs，这类HSPs是组成型表达的，称为HSC(heatshockcognateprotein)。HSC和诱导型HSP在结构和功能上都很难区分，统称HSP。Ubi(Ubiquitin，遍在蛋白)是一种依赖ATP促进细胞蛋白质水解的小分子量热激蛋白。PDI(proteindisulphide2isomerase，蛋白质二硫键异构酶)也被认为是一种热激蛋白。每一类HSPs在结构上都具有不同程度的保守性，它们第23页，共81页，2022年，5月20日，2点1分，星期五

在生物体正常的生理代谢或胁迫响应中担负不同的功能。一种植物体一般含有几类HSPs，但在胁迫条件下可能只有一种HSPs起主导作用。目前发现热激蛋白定位于细胞的多种细胞器，包括细胞质、叶绿体、线粒体和内膜系统。二、热激反应的特点（一）HSPs的保守性

HSP是目前发现的最保守的蛋白质之一。首先，亲缘关系很远的原核生物和真核生物，他们的HSP有很高的同源性，例如真核生物HSP70s和大肠杆菌的HSP70即DnaK蛋白的同源性大于65%。其次，不同物种相同细胞器如细胞质HSP70之间的同源性比同一物种不同细胞器第24页，共81页，2022年，5月20日，2点1分，星期五

的HSP70之间的同源性高，玉米、矮牵牛、拟南芥、大豆、豌豆、绿藻等细胞质HSP70氨基酸的同源性达75.0%，但如和番茄HSP70(定位于内质网)一起比较，则同源性只有54.9%。同样，豌豆、大豆、拟南芥、小麦4种细胞质I类smHSPs氨基酸之间的同源性也较高，为68.2%～85.1%。这似乎反应了不同细胞器HSP70之间很早的分歧(divergence)。第三，同种植物不同类型的HSPs的同源性较低，例如豌豆HSP18.1、HSP17.7、HSP22.7和HSP21分别属于不同类型，它们之间的同源性低于50%。HSPs的高度保守性说明他们在生物生命活动中具有重要的作用。第25页，共81页，2022年，5月20日，2点1分，星期五（二）热激反应的短时性

Northern杂交分析表明，热激时3～5min就可检测到大豆幼苗HSPmRNAs的积累，1～2h达到高峰，6h后显著下降，12h就检测不出了。放射性标记显示，氨基酸渗入HSPs在4h达到高峰，随后下降。但28℃和40℃加入Aze(三甲叉亚胺甲酸，氨基酸类似物)12h后HSPs合成仍不变，似乎Aze和高温诱导HSP合成的机理不同。植物HSP110比其它HSPs合成的时间更短，主要在热激的第一小时合成。第26页，共81页，2022年，5月20日，2点1分，星期五（三）热激蛋白的多样性

HSPs的种类很多，分子量从15kD～110kD或更高，定位于多种细胞器。如前所述，通常根据分子量的大小分为laHSPs和smHSPs两类。laHSPs在动物中较多，而植物中较少，大多数植物常见的laHSPs为68、70、83、92kD等。此外，分子量更大的如番茄的HSP95、大麦的HSP99、小麦的HSP103、棉花的HSP100、烟草的HSP100和120、以及大豆的HSP110等。植物热激蛋白的显著特点是smHSPs相当多，如大豆有27种分子量在15～25kD之间的smHSPs，其中6种是增加合成，21种是诱导合成。已研究过的植物大多smHSPs都在20种左右。第27页，共81页，2022年，5月20日，2点1分，星期五三、热激蛋白的功能（一）热激蛋白具有分子伴侣作用分子伴侣(molecularchaperones)是指与新生肽链的折叠，寡聚蛋白质的组装和蛋白质的跨膜运输有关的一类特殊蛋白质分子。HSP60最早被称为分子伴侣，目前已经证明HSP90、HSP70、smHSPs都具有分子伴侣作用。哺乳动物HSP90具有改变或保持蛋白质构象的作用，主要在于使甾类激素受体保持一种特殊的构象，以便接受合适的受体信号。所有HSP70都和ATP结合，可以用ATP亲和层析分离，具有微弱的ATP酶活性。HSP70最保守的区域在N末端(1～305AA)，也是和ATP结合的部位。推测HSP70第28页，共81页，2022年，5月20日，2点1分，星期五

在依赖ATP的蛋白质的折叠和装配中起作用。酵母和HSP70即SSA蛋白可以促进跨内质网和线粒体膜运输。体外装配的内质网和线粒体蛋白运输系统加入HSP70或HSC70则运输能力增强，其原因是HSP70使新生蛋白质处于非折叠状态或保持适合运输的形式。HSC70和新生肽结合，促进许多蛋白质的正确折叠。热激诱导的HSP70的量比细胞中原有的少得多。热激时HSP70和热变性蛋白结合，当热激恢复时，通过水解ATP促使蛋白质的折叠和组装，从而恢复活性。所有高等真核生物高温胁迫时产生的HSP70主要定位于核仁，恢复时再从新分布于细胞质中。第29页，共81页，2022年，5月20日，2点1分，星期五

线粒体HSP60主要参与核编码的运输入线粒体的蛋白质的加工、定位和装配。研究表明HSP60影响线粒体膜上F12-ATP酶复合体的装配和线粒体蛋白FieskeFe/S和cytob2的正确加工和定位。在酵母中进一步研究了HSP60和新运进的线粒体未装配的蛋白质的相互作用模式：首先未折叠的蛋白质和高分子量的HSP60连接，蛋白质的折叠在复合体的表面进行并需要ATP，然后在另外线粒体蛋白组分(很可能是GroES同源物)参与下并水解ATP把折叠的蛋白质释放出来。叶绿体HSP60同源物最初称为Rubisco连接蛋白，由核基因编码，在非热激条件下含量很高，目前尚未有热激诱导其表达的报道。第30页，共81页，2022年，5月20日，2点1分，星期五

豌豆离体HSP60由分子量约61kD和60kD的两种亚基组成720kD的复合体，主要参与Rubisco全酶的装配。植物Rubisco全酶由2类16个亚基组成：8个由叶绿体基因编码的大亚基和8个由核基因编码的小亚基，新合成的大亚基首先和HSP60结合才能装配成全酶。应用突变体研究证明GroEL参与细胞蛋白质的折叠和装配。酵母HSP60基因位点缺失(defectivelocus)条件致死突变体的线粒体蛋白不能正确装配。在热激和热激恢复时，15～18kD的HSPs在细胞质和细胞器之间穿梭(shuttle)，起着分子伴侣的作用，具有保护细胞不受高温伤害，修补被损伤的蛋白质的作用。第31页，共81页，2022年，5月20日，2点1分，星期五（二）热激蛋白与生物的耐热性许多研究表明smHSPs的表达和耐热性有关。热激条件下，大豆中I类smHSPs的含量可达到总细胞蛋白的1%以上，并且和耐热性的获得一致。用生物工程技术使拟南芥的热激转录因子表达，并诱导细胞质I类smHSPs组成型表达，同时耐热力提高。热激时，大豆、酵母、番茄及其它植物形成热激颗粒(heatshockgranules，HSGs)。热激下大豆细胞形成高度有序的结构复合体，至少由15种15～18kD的I类smHSPs组成。尽管水稻、豌豆、绿豆合成的smHSPs的数量不同，pI和分子量不一样，但都形成大小相近的270～第32页，共81页，2022年，5月20日，2点1分，星期五310kD的复合体。这种复合体有高度的热稳定性、不受高盐浓度和去垢剂的影响，和耐热性有密切关系。

HSPs的抗热性和细胞内的可溶性蛋白质的稳定有关。大豆、绿豆和水稻细胞内富含smHSPs的组分具有维持蛋白质热稳定的作用，而且不同种类的植物含HSPs组分的这种热稳定作用可以互相替代。从大豆富含HSPs的组分中除去15～18kD的HSPs，则热稳定性丧失，加入纯化的280kD的I类smHSPs复合体，这种保护作用又恢复。HSPs是热激时形成约40nm的大颗粒结构的前体颗粒的组成部分，这些颗粒由5～10%HSP70和50～80%的smHSPs组成。大豆幼苗的HSGs密度约1.20～1.21g/cm3。高温热激时第33页，共81页，2022年，5月20日，2点1分，星期五

形成HSGs颗粒，在非热激条件下(28℃时)，亚砷酸盐或氨基酸类似物诱导HSPs合成的同时，也形成I类smHSPs复合物。当热激恢复时，细胞质中的HSGs(含有变性或凝聚蛋白，热激时形成)解聚成280kD的I类smHSPs复合物，这种凝集与解聚和酵母HSP104的情况相似，使热失活蛋白从不溶性凝聚体中恢复活性。含有HSPs的离体线粒体在热激时可进行氧化磷酸化，定位于内膜、线粒体的smHSPs有保护其免受热伤害的作用。变性/凝聚蛋白周围常有线粒体，表明凝聚蛋白的解聚可能受线粒体提供的能量调节，同时HSP的从新定位也需要能量。值得注意的是离体I类smHSPs的分子伴侣活性不依赖能量。酵母第34页，共81页，2022年，5月20日，2点1分，星期五HSP90s包括HSP82和HSC82，如两种基因都突变则是致死的，任意一种发生突变在高温时生长受到破坏，表明HSC在热激时也有保护作用。酵母HSP104缺失突变体不能形成耐热性，其实HSP在耐热性方面的作用的遗传学证据首先来自酵母HSP104。(三)热激蛋白在植物种子发育中的作用

HSPs在种子发育中的作用日益受到重视。发育小麦种子中分离的HSC70是BiP同源物。BiP在所有植物中含量丰富，受热激诱导不明显，主要受营养(葡萄糖饥饿)调节，和内质网上的束缚核糖体合成蛋白质有密切关系，可能参与种子贮藏蛋白的合成。碗豆种子在发育过程中，第35页，共81页，2022年，5月20日，2点1分，星期五I类和II类smHSPs受发育调控，干种子中也检测到HSP17.4和HSP17.6，在小麦胚中也发现有发育依赖的HSPs，它们可能与种子耐脱水性、胚发育、休眠、萌发、耐热性、寿命形成及维持都有密切关系。（四）热激蛋白在植物减数分裂中的作用和雌性组织不同，成熟花粉没有热激反应。玉米受精时对热敏感，高温时导致减产，部分原因可能是成熟花粉不能合成HSPs。但也有一些研究表明玉米花粉萌发对高温敏感存在遗传差异。Frova等(1989)证明在花粉萌发过程中，合成HSP的能力是逐渐丧失的，单核花粉粒热激反应最强。Gagliardi等(1995)研究显示HSP合第36页，共81页，2022年，5月20日，2点1分，星期五

成能力逐渐丧失是由于没有HSPsmRNA的积累。所以，玉米花粉的热敏感性可能是从单核到双核花粉粒的转变开始，合成HSPs的能力逐渐下降，花粉成熟时完全丧失。从单核到双核花粉粒的转变是花粉发育的一个重要阶段，其特征是“早期”花粉基因表达关闭，“晚期”花粉基因开始表达(Magnard等，1996)，因此HSP合成能力的变化尤为值得注意。人们在研究众多植物的HSPs时，发现雄性不育植株的热激反应更有其特殊的表现。雄性不育株对温度有剧烈的反应，热激(40℃)可诱导雄性不育态在当代就转变为雄性可育态。对其HSPs的电泳分析表明，逐渐升温到46～49℃第37页，共81页，2022年，5月20日，2点1分，星期五

温度区间，高粱(3197A)雄性不育株幼穗的蛋白质电泳图谱中，出现特异性HSP80，可育的保持系高粱(3197B)没有。表明此蛋白质与雄性不育有关。高粱不育系花粉母细胞线粒体中缺少HSP70，当温度升高(40～45℃)后，线粒体中出现了HSP70，线粒体数目增加了8倍(与可育系相近)，保证了花粉发育的能量供应，不育系由不育变成了可育，这说明高粱不育系线粒体中缺少HSP70很可能是造成雄性不育的原因。热激处理能使水稻珍汕97A不育系与其珍汕97B保持系花药Pox和Est的表达发生改变，导致不育系和保持系这两种同工酶组成上的原有差异缩小。蛋白质SDS图谱表明，热激(30℃)第38页，共81页，2022年，5月20日，2点1分，星期五

处理的温敏不育水稻二九青S花药蛋白质组分，比原种二九青少了3条区带；安农S21水稻比25℃处理者少了1条区带。可以认为，温敏雄性核不育水稻二九青S和安农S21的花粉败育，可能与这些HSPs组分不能转译有关。热激(38℃)处理的温敏雄性核不育水稻培矮64S花药中的Pox同工酶和Est同工酶比常规稻湘晚籼二号各增加了1条热激酶带，其花药中可溶性蛋白质组分比常规稻湘晚籼二号少了3条蛋白质区带。由此看来，植物雄性不育的育性转变现象，以及不育系对热激的反应，可能存在某种特殊的联系。其机理还有待于从发育生理和分子生物学方面作更深入的研究。第39页，共81页，2022年，5月20日，2点1分，星期五（五）热激蛋白与植物的抗冷性冷胁迫可以诱导植物HSC70mRNA和特异蛋白质合成，但也有耐冷性和非耐冷性植物都有HSP70的积累的报道。高温热激和化学物质处理可增强冷敏感植物和组织的耐冷性已有不少报道。HSP和耐冷性具有直接关系。热激(40℃，3h)诱导绿豆下胚轴HSP70和HSP79从头合成，减轻随后的冷胁迫(2.5℃)对膜的损丧，使溶质渗漏减少，增强了组织的抗冷性。在2.5℃下6～9d，热激诱导的耐冷性消失，同时HSP70和HSP79也降至对照(20℃)水平。如绿熟(maturegreen)的番茄在36、38或40℃的培养箱中放置3d后，在2℃下贮藏21d未发生冷害，但未经热处理的果实却表现出的第40页，共81页，2022年，5月20日，2点1分，星期五

严重冷害症状。。38℃热处理3d不但减轻了冷害，并且从低温放回常温后果实仍能正常转红成熟，而对照果实冷害严重，不能正常成熟。用39～45℃的热水处理绿熟番茄1h也能有效减轻冷害。再如油梨在37～38℃下处理17～18h显著增强了抗冷性。在38℃下处理3、6、12h以及40℃处理0.5h后，可明显减轻油梨在2℃贮藏期间的冷害；而且具有延迟成熟，延长贮后货架寿命的效果。还在许多其它采后果蔬上观察到类似效果，如热水处理柑橘，热空气或热水处理芒果，热空气或热水处理黄瓜，热空气处理甜椒，热空气处理柿子等均可有效地减轻冷害的发生。研究表明，热激处理对植物第41页，共81页，2022年，5月20日，2点1分，星期五

组织的影响是多方面的。在生理上，热处理减少乙烯释放量，这与热处理降低1-胺基环丙烷-1-羧酸(1-aminocyclopropane-1-carboxylate，ACC)氧化酶基因的表达水平并抑制ACC合成酶和ACC氧化酶活性有关。热处理期间，果实内源乙烯释放量减少的同时，对外源乙烯的敏感性也降低。这表明高温使乙烯受体失活，从而阻碍了乙烯的信号转导。热处理还减少离子渗漏，这与其对膜脂成分的影响有关。苹果经38℃处理4d再在0℃贮藏4个月后，质膜的磷脂含量和脂肪酸不饱和程度高于未经热处理的果实。此外，热处理还减慢果实软化和果胶可溶化的速度，因为热处理影响多聚半乳糖第42页，共81页，2022年，5月20日，2点1分，星期五

醛酸酶(PG酶)和半乳糖苷酶的活性。另外，热处理还引起膜系统超微结构的变化，包括核仁，线粒体，核糖体，以及细胞核和内质网。热处理减轻植物冷害的效应可能与上述的某些生理反应或超微结构的变化有关。但是，进一步的研究表明，这些反应和变化与热激过程中新蛋白的合成有关。比如，40℃处理可降低离体绿豆下胚轴的溶质渗漏，增强其抗冷性；但热激处理时加入50mmol/L的亚胺环己酮(cycloheximide，CHX)可抵消热处理的效应。这说明，热激处理降低膜透性，提高组织抗冷性，与热激诱导蛋白质合成有关。因此，深入了解HSP及其与抗冷性的关系，是全面理解植物抗冷机理的一个重要方面。第43页，共81页，2022年，5月20日，2点1分，星期五

第八章植物热激反应及其信号转导途径第一节植物的热胁迫第二节植物的热激蛋白家族第三节热激反应的信号转导第44页，共81页，2022年，5月20日，2点1分，星期五第三节热激反应的信号转导一、热激信号转导途径上游的Ca2+-CaM信号系统二、信号转导途径下游的热激基因表达第45页，共81页，2022年，5月20日，2点1分，星期五第三节热激反应的信号转导

热刺激能诱导机体产生热激响应。在热激基因(编码热激蛋白的基因，heatshockgene，HSgene)表达之前许多信号转导组分已经发生了改变。已有一些直接或间接的证据表明Ca2+及CaM参与了植物HSR的信号转导。真核生物中热激基因的表达被热激转录因子(heatshocktranscriptionfactor，HSF)所介导。热胁迫时，HSF被激活并结合到热激元件(heatshockelement，HSE)上。本文主要介绍与植物热激信号转导途径(包括基因调控过程)中上游的Ca2+＿CaM信号系统及下游的热激基因表达调控。第46页，共81页，2022年，5月20日，2点1分，星期五一、热激信号转导途径上游的Ca2+-CaM信号系统

Ca2+是植物细胞中被证实的胞内信使之一，Ca2+＿CaM信号系统调控胞内许多生理过程。目前已知许多种胁迫刺激都可引起Ca2+和CaM水平的升高。近些年来，Ca2+-CaM信号系统在热激信号转导中的作用也越来越多地受到人们的重视。尽管热激后完整的上游信号转导途径目前还不清楚，但已有一些直接或间接的证据表明Ca2+和CaM可能是热激信号转导途径中的主要上游组分。（一）热激时胞内Ca2+、CaM浓度及CaM基因表达的变化第47页，共81页，2022年，5月20日，2点1分，星期五

在果蝇、中国仓鼠、HeLa(子宫颈癌组织细胞株)等细胞中，热激诱导胞质Ca2+浓度升高。随后，植物方面的研究也证明了这一点。例如热激时悬浮培养的梨细胞或原生质体对Ca2+的吸收大大增加；用荧光染料方法测定到热激能使豌豆叶原生质体胞质Ca2+浓度增加4倍；热激时胞质中Ca2+水平迅速而短暂地升高。用质膜钙通道阻断剂LaCl3和内质网钙通道阻断剂新霉素处理均可明显抑制热激后胞质Ca2+浓度的升高，表明热激既动员质外体中的钙向胞质中流动又可动员胞内钙库内质网中的钙向胞质中流动。叶绿体中的Ca2+浓度在热激时没有明显的变化。单一的热刺激可引起一个不应期，在不应期内，另加一次热刺激不能引起胞质Ca2+水平的升高。第48页，共81页，2022年，5月20日，2点1分，星期五

然而在这段不应期内，烟草植株对机械刺激和冷刺激仍然能够做出Ca2+浓度升高的响应。这种现象可能说明由热激引起的Ca2+流动是专一的，或者表明不应期是由于在热刺激的感受或信号转导方面存在暂时的障碍。热激在使植物胞质Ca2+浓度升高的同时，也使细胞中CaM浓度升高。例如，对玉米所做的实验表明，热激时CaM水平增加，并且这种增加是依赖Ca2+的。对小麦悬浮细胞或幼苗以34℃热激处理可引起CaM的积累，而Ca2+螯合剂EGTA对CaM的积累具有抑制作用。热激也可诱导TCH基因(编码CaM同源蛋白)的表达。我们进一步以小麦CaM122基因为探针，通过Northern杂交方法第49页，共81页，2022年，5月20日，2点1分，星期五

表明，小麦幼苗经37℃热激10min，CaMmRNA的表达已明显高于基础表达，20min达到最高值，30min后开始下降，最终回到基础水平。这一工作进一步说明，热激时CaM活性的增加可能不仅是因为Ca2+

激活CaM，而且还由于促进CaM基因的表达。（二）Ca2+及CaM对热激基因表达的影响在动物中，Ca2+能激活HSF与DNA的结合能力，并可促进热激基因的转录和蛋白质的合成。植物方面Ca2+对热激基因表达影响的报告很少，仅Trofimova等在甜菜上观察到，CaCl2和钙载体A23187预处理可促进HSP的合成，而EGTA则抑制HSP的合成，即在蛋白合成水平上表明了Ca2+的影响。在转录水平上研究，观察到CaCl2和第50页，共81页，2022年，5月20日，2点1分，星期五A23187可促进Hsp26及Hsp70的mRNA合成；相反，用EGTA、质膜Ca2+通道阻断剂LaCl3和异博定处理则抑制小麦Hsp26及Hsp70的mRNA合成。此外，以番茄为材料的研究还表明Ca2+可提高HSF与DNA的结合能力。初步表明，Ca2+可能在HSF激活、热激基因转录和HSP合成这三种不同水平上参与植物热激基因表达的调节。

Ca2+是否通过CaM进一步调节热激基因表达此前在动植物中均未见报告。本实验室用CaM的拮抗剂CPZ、TFP预处理小麦种子和幼苗后，观察到34℃热激时HSP的合成明显减少；进而发现CPZ和另一种CaM的拮抗剂W7也可降低37℃热激第51页，共81页，2022年，5月20日，2点1分，星期五

时hsp26、hsp70基因的转录水平；CaM还可提高HSF与DNA的结合能力。小麦幼苗在经热激10min后CaM基因表达已明显高于基础表达，而热激20min后hsp26基因才开始有少量表达，表明热诱导的CaM基因的转录先于hsp26基因的转录；但是如果只热激5min，然后给予一定的恢复时间，则hsp26基因也可以表达，说明hsp26基因转录其实并不需要持续20min的热刺激，较短时间(5min)的热刺激即能启动胞内某一关键因子，随后引起一系列生理生化反应(在恢复时间内完成)，到20min时才导致基因的转录。以小麦叶鞘表皮为材料，利用钙离子荧光指示剂fluo23第52页，共81页，2022年，5月20日，2点1分，星期五AM染色，通过激光共聚焦显微技术，观察到热激处理过程中胞质Ca2+浓度快速升高，1.5min时Ca2+浓度开始上升，4min时已达到最高值。在22℃下用CaCl2和A23187处理小麦幼芽，看到可增加CaM基因的转录水平，表明Ca2+不仅可激活CaM，而且还可促进CaM基因的表达。因此我们认为Ca2+可能是短暂热激启动的胞内关键因子，热激后胞质Ca2+浓度升高既激活已有的CaM，也引起CaM基因表达量的提高，形成更多的CaM，从而激活热激基因的转录。（三）CaM与HSP结合

90年代以来，动物方面不断有CaM与HSP结合的报告。Evans等(1990)首先发现在Ca2+存在时，第53页，共81页，2022年，5月20日，2点1分，星期五Hsp90、Hsp70、Hsp68、Hsp32、Hsp26等与CaM-琼脂糖柱结合，而已结合的HSP可被含W7的缓冲液洗脱下来，说明CaM能与一些HSP结合，这些结合是依赖Ca2+的。Stevenson和Calderwood(1990)证明大鼠细胞Hsc70能与CaM结合，并发现Hsc70内有一段21个氨基酸组成的CaM结合序列。植物方面，关于CaM能与HSP结合的研究至今仅有两例报告。Lu等(1995)报告，从热激后悬浮培养的烟草细胞cDNA表达文库中筛选到一个编码与CaM结合的HSP的cDNA，该cDNA编码分子量为50kD的蛋白，用凝胶覆盖技术证明这个蛋白可与35S标记的CaM结合。以玉米为材料的研究表明，热激蛋白家族中最重要的成员之一，纯化的细胞质Hsc70能与CaM第54页，共81页，2022年，5月20日，2点1分，星期五

结合，并且玉米Hsc70中也有一个非常保守的21个氨基酸组成的CaM结合序列(序列同源性达86%)。这种高度的保守性意味着这一CaM结合序列可能在完整的Hsc70中具有重要的功能，从而首次在植物中证实Hsc70是CaM的靶蛋白，为进一步研究CaM调节热激基因表达的方式和途径提供了重要的线索。（四）Ca2+和CaM在植物耐热性获得中的作用在玉米和转基因烟草中以幼苗生活力(TTC法)以及细胞膜稳定性作为耐热性研究的2个指标所做的研究中观察到，CaCl2

预处理明显增加幼苗的耐热性，而MgCl2处理无此作用。相反，EGTA、LaCl3或异博定处理均妨碍了热诱导的第55页，共81页，2022年，5月20日，2点1分，星期五

耐热性的获得。W7预处理玉米幼苗明显妨碍了热诱导的耐热性的获得。热激通过诱导热激蛋白的合成使生物获得耐热性，Ca2+-CaM信号系统与热激诱导的耐热性获得的关系表明Ca2+-CaM信号系统可促进热激蛋白的表达。总之，多方面的研究表明，Ca2+-CaM介导的信号转导途径参与热激反应的调控。IP3/DG、cAMP和pH与热激反应的关系问题在动物和微生物方面有一些研究，但植物方面还未见报告。Stevenson等(1986)用中国仓鼠实验观察到，45℃热激可诱导IP3水平迅速而明显的升高，随后紧跟着一个持续时间较长的胞外Ca2+内流，同时发现Ca2+内流与膜上磷脂酸(PA)的积累呈正相关，由此提出了一个热激引起胞内游离Ca2+水平升高的第56页，共81页，2022年，5月20日，2点1分，星期五一个可能的机制：热信号首先刺激膜上的受体改变构象，受体与G蛋白结合并激活G蛋白，后者激活磷脂酶，在磷脂酶作用下，PIP2分解为IP3和DG。IP3刺激胞内钙库释放Ca2+

，而DG转化成PA，后者活化膜上的Ca2+通道，使胞外Ca2+进入胞内。第57页，共81页，2022年，5月20日，2点1分，星期五二、信号转导途径下游的热激基因表达在细胞内有一种转录调节因子在热激条件下可激活热激基因的表达，被称为热激转录因子(HSF)。在热激基因中，启动子中有一小段特异的DNA序列，是HSF的结合位点，称为热激元件(HSE)，HSF与HSE结合激活热激基因的表达。热激基因表达的调节包括选择性转录和选择性翻译，以前者为主。（一）热激基因启动子植物与其它真核生物一样，热激专一的mRNA的快速积累主要是由于转录速度的提高。实验表明，热激基因启动子中，TATAbox、HSE及其它一些元件，在热激基因的充分转录激活中都有不同程度的作用。第58页，共81页，2022年，5月20日，2点1分，星期五HSE在热激基因表达中起重要作用。大多数真核生物的热激基因5'端非翻译区的几百个碱基对内都存在多个HSE。真核生物HSE共有序列(核心重复单位)为5'-nGAAn-3'。在植物中，最适的HSE共有序列为5'-aGAAg-3'。HSE是HSF结合位点，HSF三聚体要能有效结合到DNA上至少需要2～3个HSE的核心重复单位，形成5'-nGAAnnTTCnnGAAn-3'。然而，并非总是形成这种标准的结合位点，天然存在的热激基因启动子中，经常是中心有2个完整的核心重复单位，两侧各与一个不完整的核心重复单位相邻，构成2个HSF三聚体的结合位点(如：5'-CTnGAAnnTTCnAG-3')植物中HSE对热激依赖的转录调节的重要性已经通过转基因实验证实。第59页，共81页，2022年，5月20日，2点1分，星期五

在转基因烟草中的大豆Gmhsp17.3-B基因5'端做一系列启动子缺失处理，发现-155与-298之间有多个HSE，其中-181至-154这段DNA对诱导基因转录起决定性作用。

HSE包括近TATAbox的HSE和远上游的HSE。TATAbox上游约20个bp处常存在2个部分重叠的HSE。另外，缺失分析实验表明，在近TATAbox域内可能存在2个包含HSE的位点(位点1和位点2)。位点1与HSF的结合能力较强，而位点2与HSF的结合能力较弱。实验表明，在远上游的不同位置也可能存在HSE，但远上游HSE的作用似乎较小。第60页，共81页，2022年，5月20日，2点1分，星期五（二）热激转录因子在所有已研究的植物中，都存在多种类型的HSF，如番茄和玉米中存在3种HSF，拟南芥中有4种，大豆中有6种，烟草中有2种。植物HSF的分子量在31.2至57.5kD之间。HSF蛋白质家族至少存在3类成员：HSF1、HSF2、HSF3。不同种类的HSF成员可同时在细胞中存在，经免疫反应得知，3类HSF免疫原性不同，表明它们在功能上可能存在差异。实验表明，不同种类的HSF受到激活的信号不同，但其中的机制还有待研究。以人类为材料的研究表明，HSF1是胁迫诱导的热激基因转录的中介子，它显示了一种热激诱导的DNA结合活性、寡聚化和核定位特性。尽管HSF2对典型的胁迫刺激不起反应，但在第61页，共81页，2022年，5月20日，2点1分，星期五

某个特定的发育阶段，它结合DNA的能力能够专一地激活，表明HSF2可能在发育过程中热激蛋白产生时起调节作用。目前发育过程中热激蛋白表达的研究受到人们越来越多的重视HSF3可能代表一种特定细胞中的HSF1的变异。在番茄中，热激时3种HSF基因的激活程度不同(0～5倍)，并且具有启动子专一性，也表明这3种HSF功能上的差异。总之，不同种类HSF可能在细胞不同部位、不同发育阶段行使不同的功能，细节有待进一步研究。所有已研究的HSF都包含以下几个重要的结构域：DNA结合域、寡聚域、核定位信号、C-端的7元重复域及激活域(图8-1)。其中DNA结合域第62页，共81页，2022年，5月20日，2点1分，星期五

和寡聚域的主要结构是保守的，其它区域只是在亲缘关系相近的HSF中才表现出同源性。

DNA结合域(DNA-bindingdomain，DBD)是HSF分子中最保守的一个区域，由大约95个氨基酸组成，位于HSF的N端。该区域属于a+类的螺旋-转角-螺旋蛋白。空间构型是由3个a螺旋形成的螺旋2转角2螺旋区域和一个4条反向平行的折叠片层区域构成的一个致密的球形结构。在第3和第4折叠之间形成了一个柔性的暴露在溶剂中的环。植物的HSF缺乏这个环状结构。位于C-端的片层第4链是由一些非常保守的氨基酸残基组成，对HSF三聚体中DBD的定向有明显的作用，并有助于HSF与HSE的高度亲和。另外，已知螺旋3在与DNA结合时起识别作用。第63页，共81页，2022年，5月20日，2点1分，星期五

寡聚域(oligomerizationdomain，OD)是由2个疏水7肽重复区域A和B(HR-A/B)组成。它的功能是允许HSF形成同源三聚体构型。目前一些学者认为，OD的功能是由3股a-螺旋通过卷曲螺旋型a-螺旋(a-helicalcoiledcoil)结构使HSF形成同源三聚体形式。在HSF的C-端存在另一个疏水7肽重复(C-terminalheptadrepeats，HR-C)。这个区域与非热激条件下HSF三聚化的抑制有关。HR-C突变可导致一种组成型的HSF三聚化和DNA结合活性。HR-C在动物HSF中非常保守，而在植物和酵母中不保守。在正常生长条件下，HR-A/B和C之间通过分子内的卷曲螺旋型a-螺旋相互作用，抑制HSF三聚体的形成。第64页，共81页，2022年，5月20日，2点1分，星期五HSF携带两簇基本氨基酸序列，后者被认为起核定位信号(nuclearlocalizationsignal，NLS)的功能。一簇高度保守的氨基酸位于DBD的C-端(N端NLS)，另一簇位于HR-A/B的C-端(C-端NLS)。在以转基因烟草原生质体为材料进行的HSF功能研究中发现，番茄2种HSFN端的NLS与核转位无关，而C-端NLS对HSF的核转位更为重要。脊椎动物HSF的核转位需要两端的或只需要N端的NLS。HSF核转位是胁迫调节HSF活性的一个环节。高等真核生物HSF的激活域(activatordomain，AD)位于HSF分子的C-端。该区域氨基酸序列不很保守。人类和果蝇HSF的AD显示了第65页，共81页，2022年，5月20日，2点1分，星期五

有限的序列同一性，并富含酸性氨基酸，疏水性较强。番茄HSF的AD氨基酸序列分析表明，芳香族的、大的疏水性和酸性氨基酸残基可能在转录激活中起作用。番茄HSF的缺失分析表明，AD对转录激活具有重要作用。在3种番茄HSF中存在1至2个拷贝的色氨酸重复基元(Trpmotif)，认为它们起转录激活子(transcriptionalactivator)基元的作用，定位于一个富含负电荷的区域。在大豆GmHSF29和GmHSF34中，存在单一拷贝的Trp基元，而在GmHSF和GmHSF1中不存在Trp基元。大豆HSF中Trp基元的重要性还没有确定。第66页，共81页，2022年，5月20日，2点1分，星期五（三）热激基因表达的调控热激基因表达的调节主要是在转录水平上进行的。热激基因的转录需要HSF来介导。因此，HSF活性的调节是热激基因表达转录调节的中心机制。真核生物中，与胁迫时HSP表达相关的HSF1编码基因呈组成型表达，热激时激活已存在的HSF1库。热激基因表达的转录调节主要包括HSF的三聚化、HSF的核转位、HSF的磷酸化、HSP自身对HSF的反馈调节等几方面。

HSF三聚化是HSF激活的必要条件。HSF有无活性的单体和具有DNA结合活性的同源三聚体两种存在形式。热激以前，HSF处于钝化的单体状态，热激时，HSF发生从单体到三体的转变。第67页，共81页，2022年，5月20日，2点1分，星期五HSF的三体形式对HSE有高度的亲和性，可结合到HSE上，激活热激基因的转录。然而，热激后恢复时，HSF三聚体又发生解聚，重新回到钝化的单体状态(图8-1)。第68页，共81页，2022年，5月20日，2点1分，星期五图8-1热激因子结构及三聚化（李冰等，2002）

第69页，共81页，2022年，5月20日，2点1分，星期五HSF转位是胁迫激活HSF活性的一个环节。用HeLa细胞所做的研究表明，在无胁迫时，HSF1分散在细胞质和细胞核中，热胁迫时，HSF1主要分布于细胞核中。热激时可观察到HSF1在30s内迅速转移到核中并形成大的不规则的核颗粒(HSF1胁迫颗粒)，这种颗粒在3min内的大小、数目和荧光强度保持稳定。热激恢复时，HSF1胁迫颗粒消散，分散于核质中。HSF1的这种转位是迅速且可逆的。HSF1胁迫颗粒可能作为一种核单位对HSF1活性起时间调节和空间组织作用。植物方面与HeLa细胞的研究结果一致，番茄的2种HSF在无胁迫时分散存在于细胞质和细胞核中，热激时主要存在于细胞核中，而热激后恢复时相当一部分HSF又返回到细胞质中。第70页，共81页，2022年，5月20日，2点1分，星期五HSF活性也通过HSF的磷酸化来调节。最初的研究表明，HSF磷酸化后就具有活性，这一看法主要是基于酵母和人类HSF电泳迁移率在受到热激时变化这一事实提出的，以后又受到32P标记实验支持。但也有一些实验表明，HSF磷酸化后发生钝化。HSF的活性调节涉及3种蛋白激酶的依次激活，NADK、糖原合成酶激酶及蛋白激酶C，分别促进丝氨酸307、303和363位点的磷酸化，从而抑制HSF的活性。

HSF的磷酸化与其活性的关系可能是非常复杂的，在未受胁迫细胞中，HSF在丝氨酸和苏氨酸残基处磷酸化，热激时发生超磷酸化，而热激后恢复时又发生脱磷酸化。植物HSF的磷酸化第71页，共81页，2022年，5月20日，2点1分，星期五

已经在含有重组AtHSF1的拟南芥悬浮细胞提取液中得到证实。AtHSF1在丝氨酸残基处发生磷酸化，使它