鸡志贺氏菌产超广谱β内酰胺酶(ESBLs)的分子进化

1、2期 胡功政等：鸡志贺氏菌产超广谱内酰胺酶（ESBLs）的分子进化597鸡志贺氏菌产超广谱内酰胺酶（ESBLs）的分子进化胡功政，孙亚伟，陈红英，司红彬，苑 丽，邓立新，莫 娟，李胜利（河南农业大学牧医工程学院，郑州 450002）摘要：【目的】检测鸡志贺氏菌分离株和诱导株所产ESBLs的基因型,探讨其产酶耐药的分子进化机制。【方法】对1株诱导和5株临床分离产ESBLs细菌分别用TEM、SHV、CTX-M 3种通用引物进行PCR扩增、基因克隆及测序分析，确定鸡福氏志贺氏菌ESBLs的基因型和基因亚型。【结果】5株临床福氏志贺氏菌质粒上具有相同的TEM序列和相同的SHV序列，TEM型序列与AY9

2、03309（TEM-116）序列相比发生了2个位点基因突变即G157A、C409T,其中409位点碱基突变为沉默突变，157位点碱基突变导致相应氨基酸序列53位发生突变Gly53Ser,此氨基酸突变为新的突变位点，所以该TEM型ESBLs是一种新的TEM亚型，暂命名为TEM-1V型;SHV型与AY826418（SHV-12）序列完全相同，为SHV-12型。头孢噻呋诱导标准福氏志贺氏菌，诱导10代时产生了TEM-1型内酰胺酶，诱导50代时产生了TEM-1V型ESBLs。【结论】临床分离鸡福氏志贺氏菌ESBLs的基因型为TEM-1V型和SHV-12型，鸡福氏志贺氏菌TEM-1V型ESBLs是由 T

3、EM-1型内酰胺酶直接进化而来。关键词：福氏志贺氏菌；ESBLs；基因型Molecular Evolution of the Extended Spectrum -lactamase (ESBLs) Produced by the Shigella Isolated from the FowlHU Gong-zheng, SUN Ya-wei, CHEN Hong-ying, SI Hong-bin, YUAN Li, DENG Li-xin, MO Juan, LI Sheng-li(College of Animal Husbandary and Veterinary Medicine E

4、ngerning, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002)Abstract: 【Objective】 The genotypes of ESBLs produced by Shigella flexneri were detected to elucidate the molecular evolution mechanism of the ESBLs production. 【Method】 Five clinically isolated and one induced Shigella flexneri were amplifie

5、d by PCR using the primers of TEM, SHV and CTX-M, respectively, their PCR products were cloned and then the cloned fragments were sequenced. The nucleotide sequence obtained were analyzed using DNASTAR software. The search for homologous sequences was done in the GenBank database using FAST software

6、. 【Result】 The same TEM- type and SHV- type sequences were noticed in the plasmids of the five Shigella flexneri isolates. The sequence of the TEM-type was characterized by two nucleotide mutations (G157A, C409T) compared with that of AY903309 (TEM-116). The mutation of nucleotide 409 was aslient mu

7、tation. The mutation of nucleotide 157 led to the mutation of amino acid (Gly53Ser). Because the mutation didn't appear in the published ESBLs sequences. Therefore, the detected TEM-type was a new genotype, named TEM-1V type. The sequence of SHV-type was the same as that of the AY826418 (SHV-12)

8、. The standard Shigella flexneri produced TEM-1 type -lactamase and TEM-1V type ESBLs, respectively, when it was induced to the tenth and fifth times by Ceftiofur. 【Conclusion】 The isolated Shigella flexneri harboreds TEM-1V type and SHV-12 type ESBLs and the produced TEM-1V type ESBLs evoluted dire

9、ctly from TEM-1 type -lactamase.Key words: Shigella flexneri; Eextend spectrum -lactamases; Genotype0 引言【研究意义】超广谱-内酰胺酶（ESBLs）由普通-内酰胺酶TEM-1、TEM-2和SHV-1经个别氨基酸突变形成1，目前已发现有300多种, 根据其质粒编码的基因和酶底物的不同，ESBLs基因型有TEM型、SHV型、CTX-M型、OXA型及其它型共5种，每个基因型又有很多亚型。细菌及其所受抗生素选择压力不同，其产生ESBLs的基因型、基因亚型亦不同。本试验对临床分离的5株福氏志贺氏菌进行E

10、SBLs基因型检测，同时以亚MIC头孢噻呋诱导的产ESBLs标准福氏志贺氏菌为对照，比较自然条件下及受控条件下ESBLs基因型差异，探讨鸡志贺氏菌对头孢噻呋等三代头孢耐药及其演进的分子机制，为兽医临床产ESBLs的细菌感染防治提供理论依据。【前人研究进展】（1）TEM型ESBLs研究进展：1984年，Medeiros等首次从一个名为Temoniera希腊病人体内的大肠杆菌中分离到内酰胺酶，并以病人的名字命名该类酶为TEM型。1988年，Sougakoff 等报道了第一个TEM型ESBLs即TEM-3型ESBLs。此后TEM型的ESBLs被世界各地陆续报道，现已成为ESBLs中最大的一类（150

11、种）。TEM型ESBLs最初仅存在大肠杆菌和肺炎克雷伯菌中，但由于耐药质粒的水平传播及耐药基因的转座、重组作用2，近年来在多种细菌中均可检出TEM型ESBLs。2004年，法国学者Champs等在对法国医院两年来收集的产ESBLs细菌检测中发现，TEM-3型ESBLs在10种细菌内同时存在3。（2）志贺氏菌ESBLs研究进展：1999年，印度学者Jasimuddin首次在痢疾志贺氏菌中检测到SHV-11-内酰胺酶，并对酶的水解特性进行了研究4。2000年Siu等从香港和上海分离的福氏志贺氏菌中检测到了OXA-30型-内酰胺酶，它与OXA-1发生了1个氨基酸突变，且编码该酶基因的转座子位于细菌的

12、染色体上5。2001年，法国学者Nicolas、韩国学者Hyunjoo分别在福氏、宋内志贺氏菌中检测到SHV-2型6，CTX-M-14型 ESBLs7。2003年韩国在宋内氏志贺氏菌中检测到TEM-52型ESBLs 8，随后又从志贺氏菌中检测到TEM-17、TEM-19、TEM-20，并指出志贺氏菌产ESBLs亚型的增多是由于ESBLs在细菌间的传播而造成的9。中国近年从鸡中分离出致病性志贺氏菌10，并从鸡志贺氏菌中检测到ESBLs，通过药敏试验及粗酶水解试验指出鸡产生的ESBLs对三代头孢有较强的水解作用，舒巴坦对酶的活性有抑制作用11。【本研究切入点】现已发现300多种ESBLs亚型，但志

13、贺氏菌 ESBLs的基因型研究迄今仅有10余篇报道，对鸡源福氏志贺氏菌ESBLs的基因型研究国内外尚未见报道。人医对所发现的志贺氏菌ESBLs亚型进行了氨基酸序列分析及酶水解能力测定，但没有对志贺氏菌ESBLs分子进化机制进行研究。【拟解决的关键问题】笔者实验室从病鸡中分离到6株产ESBLs的福氏志贺氏菌，其中1株的ESBLs经TEM型引物扩增、克隆、测序被命名为TEM-1V型，但对该菌株是否同时携带其它基因型未进行测定。本试验对其它5株临床志贺氏菌及头孢噻呋诱导产ESBLs的标准志贺氏菌，分别用TEM型、SHV型、CTX-M型3种通用引物进行扩增、克隆、测序分析，鉴定其基因型及基因亚型，同时

14、对人工药物诱导产生的ESBLs与细菌自然条件下产生的ESBLs基因型进行比较，探讨鸡福氏志贺氏菌ESBLs的分子进化机制。1 材料与方法1.1 试验时间、地点本试验于2005年1月2006年7月在河南省农业生物技术与工程技术重点开放实验室进行。1.2 试验材料分离产ESBLs鸡福氏志贺氏菌5株（经过法国生物梅里埃VTEK32全自动鉴定系统鉴定）：河南农业大学牧医工程学院药理室保存；标准福氏志贺氏菌1株：购自中国普通微生物菌种保存中心；质控菌：大肠杆菌ATCC25922购自中国普通微生物菌种保存中心；ESBLs阳性对照菌肺炎克雷伯菌ATCC700603 （SHV-18）、E coli. CF11

15、24（TEM-24）购自北京大学医学部。1.3 试验方法 标准福氏志贺氏菌诱导及酶检测 利用广东环凯微生物科技公司产的GN增菌液，以亚MIC的头孢噻呋连续诱导标准福氏志贺氏菌，每10代用试管2倍稀释法测定最小抑菌浓度（MIC）（细菌接种量为对数生长期细菌105CFU/ml），用Nitrocefin纸片检测内酰胺酶，同时用北京天坛药物生物技术开发公司产的头孢曲松纸片（CRO）、头孢噻肟纸片（CTX）、头孢他啶纸片（CAZ）、氨曲南（AZT）纸片（均为30 g/片）初筛ESBLs；当符合NCCLS（2004，M100-S14）初筛标准判为可疑产ESBLs菌时，每5代再利用头孢他啶/克拉维酸纸片（C

16、AZ/CLV）、头孢噻肟/克拉维酸纸片（CTX/CLV）（均为30/10 g）做确证试验12，检测是否产生ESBLs。 PCR扩增（1）细菌质粒DNA的提取 取5株临床产ESBLs菌株、标准福氏志贺氏菌株（未诱导）、诱导产内酰胺菌株及诱导产ESBLs菌株共8株细菌，用美国Promega公司质粒小样快速提取试剂盒分别提取质粒DNA。（2）引物 参照GenBank已发表的TEM、SHV、CTX-M基因序列，分别设计TEM、SHV、CTX-M通用引物，TEM引物：上游5-GGGGATGAGTATTCAAC ATTTCC-3，下游5-GGGCAGTTACCAATGCTTAAT CA-3；SHV引物：上

17、游5-GGTTATGCGTTATAT TCG CCTGTG-3，下游5-TTAGCGTTGCCAGTGCTCGAT CA-3；CTX-M引物：上游5-GGG CTGAGATGGTGA CAAAGAG-3，下游5-CGTGCGAGTTCGATTTATTC AAC-3，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，扩增长度为861 bp。（3）扩增、纯化 用东胜创新生物科技有限公司PTC-200型PCR仪扩增，50 l反应体系为：25 l Premix EX Taq酶，模板DNA3 l，上下游引物各1 l，去离子水20 l，反应参数94预热5 min，94变性1 min，54退火30 s，72延伸1 m

18、in，循环30次，72延伸10 min，4预冷3 min，设一空白对照。PCR扩增产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，紫外投射仪下观察结果并用凝胶成像系统摄相。用美国V-GENE生物技术有限公司凝胶回收试剂盒回收PCR产物，纯化的PCR产物于-20条件下贮存。 连接、转化 纯化后的PCR产物用美国Promega公司的PGEM-T Easy 载体连接，连接体系为：PGEM-T Easy 0.5 l、2×Rapid Ligation Buffer 5 l、去离子水0.5 l、T4 DNA连接酶0.5 l、PCR回收纯化产物3.5 l 4连接过夜，参照文献13将各含42 l X-g

19、al、IPTG涂在加有氨苄西林（60 g/100 ml）LB固体培养基板1 h，再取转化产物和大肠杆菌JM109感受态细胞混匀后涂在板上过夜培养筛选。 重组质粒双酶切鉴定、测序 挑取培养白斑于加有氨苄的LB液体培养基内摇菌培养12 h，用试剂盒抽提重组质粒，所提质粒经0.8%琼脂糖凝胶电泳（溴化乙锭染色），紫外投射仪下观察结果，确认质粒存在后用大连宝生物公司生产的EcoR双酶切。双酶切反应总体积为20 l，反应体系如下：重组质粒6 l，水8 l，10×buffer：4 l，E coli.：2 l，37酶切3.5 h，经0.8%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，紫外投射仪下观察结果并用凝胶

20、成像系统摄相。鉴定确认后，菌液送大连宝生物公司测序。 序列分析 所测序列用DNASTAR软件进行分析，并在NCBI数据库中用BLAST工具进行同源序列比较。 2 结果与分析2.1 诱导福氏志贺氏菌ESBLs检测标准福氏志贺氏菌诱导至10代时，其菌株可使Nitrocefin纸片变红，说明产生了内酰胺酶；当诱导至40代时，其对CRO、CAZ、CTX、AZT的抑菌圈直径分别为14、16、17、14 mm，均符合初筛标准，表明40代诱导菌株为产ESBLs酶可疑菌株。当诱导至50代时，诱导菌对CTX、CTX/CLV、CAZ、CAZ/CLV的抑菌圈直径分别为15、20、15、17 mm，其中CTX与CTX

21、/CLV抑菌圈直径差为5 mm，说明诱导菌产生了ESBLs。2.2 ESBLs片段扩增用所设计引物对产ESBLs的诱导菌及临床分离福氏志贺氏菌质粒DNA分别进行扩增，结果经琼脂糖电泳检测，5株临床福氏志贺氏菌PCR产物中都同时出现TEM型和SHV型目的条带，诱导产ESBLs的福氏志贺氏菌PCR产物中仅出现TEM型目的条带，6株志贺氏菌均未出现CTX-M型目的条带，结果见图1、图2。另外用3种引物对标准福氏志贺氏菌和诱导产内酰胺酶菌质粒分别进行扩增，用TEM引物可扩出阳性条带，SHV、CTX-M引物未扩出阳性条带。1.分子质量标准；2.TEM-24阳性对照；37. 临床分离福氏志贺氏菌；8.诱导

22、福氏志贺氏菌；9.ATCC25922阴性对照1. Marker; 2. Positive control (TEM-24); 3 to 7. The PCR products of the Shigella flexneri clinical isolates; 8. The PCR products of the induced Shigella flexneri; 9. Negative control (ATCC25922)图1 TEM型电泳图Fig. 1 Agarose gel electrophoresis of the TEM-type ESBLs2.3 重组质粒的酶切分析 重组质

23、粒经EcoR酶切3.5 h后电泳鉴定，5株临床志贺氏菌、标准志贺氏菌、诱导产内酰胺酶菌和诱导产ESBLs菌都切出目的条带，其转化阳性菌均送大连保生物公司测序。1. 分子质量标准；2. SHV-18阳性对照；37. 临床分离福氏志贺氏菌1. Marker; 2. Positive control(SHV-18); 3 to 7. The PCR products of the Shigella flexneri clinical isolates图2 SHV型电泳图Fig. 2 Agarose gel electrophoresis of the SHV-type ESBLs2.4 测序分析 经

24、测序，5株产ESBLs临床福氏志贺氏菌的TEM及SHV型都为861 bp，通过DNASTAR软件分析，并与NCBI数据库中已注册的ESBLs基因序列比较，5株临床分离福氏志贺氏菌具有相同的TEM型序列和相同的SHV型序列，其中TEM型的碱基序列与序列号为AY903309（TEM-116）的序列同源性最高并与之发生两处基因突变G157A和C409T，409位碱基突变是沉默突变，157位的碱基突变导致相应氨基酸发生改变即Gly53Ser，该位点突变在目前已发表的TEM型ESBLs氨基酸序列上都未曾出现，暂命名为TEM-1V型（GenBank号DQ211973）。SHV型与NCBI数据库中已注册的A

25、Y826418（SHV-12）序列完全相同，其GenBank号为EF125011。标准福氏志贺氏菌、诱导产内酰胺酶菌及诱导产ESBLs菌，3个菌的质粒上都存在TEM型同源序列，3个序列经DNASTAR分析，诱导产内酰胺酶菌TEM序列（GenBank号为EF125012）与标准菌TEM序列比较，发生一处位点碱基突变A787G，该位点突变使相应氨基酸发生突变Thr263Ala；诱导产ESBLs菌质粒上TEM型序列与内酰胺酶菌TEM序列比较，发生4处基因突变G157A、A250G、C409T、T551C，其中409位突变是沉默突变，157、250、551 这3个位点突变使相应氨基酸发生突变即Gly5

26、3Ser、Ile84Val、Val184Ala，且该TEM型碱基序列与临床分离福氏志贺氏菌质粒上所携带的TEM型序列完全相同，也为TEM-1V型。3 讨论1997年，瑞士Magdalena等首次报导了SHV-1214，随后韩国、西班牙、荷兰先后在人、狗、禽致病菌中发现SHV-121517。2002年，中国首次报道在肠杆菌中检出SHV-1218。本文临床福氏志贺氏菌ESBLs的SHV型碱基序列与AY826418（SHV-12）序列完全相同，所以SHV亚型为SHV-12。而与SHV-1（序列号AY826416）相比发生了4处碱基突变A104T、C528T、A712G、A715G，其中528位的碱基

27、突变是沉默突变，104、712、715 3位点的碱基突变使相应氨基酸序列发生突变即Gln35Leu、Ser238Gly、Lys239Glu。该序列氨基酸突变与国内外报道一致，但对于产ESBLs的志贺氏菌来讲，本试验所检测的SHV-12是首次在志贺氏菌中检出。2004年Seok等首次报道TEM-116型，其氨基酸序列与TEM-1氨基酸序列相比84、184位点发生了突变，同时推测TEM-116是从TEM-1直接进化而来19。2005年，乌拉圭学者Rafael等在致病型大肠杆菌中同时检出TEM-116型和PER-2 ESBLs 20。本文诱导及分离福氏志贺氏菌TEM型ESBLs序列经NCBI数据库内

28、BLAST同源性比较，发现该序列与TEM-116有99.8%的同源性，其氨基酸序列在53位发生了突变即SerGly，此突变为新的突变点，与笔者先前检测的1株志贺氏菌ESBLs基因型相同，但该氨基酸突变对酶的水解能力影响即该基因型ESBLs的酶底物特性，尚需进一步研究。标准福氏志贺氏菌用头孢噻呋诱导可产生TEM型ESBLs，且标准未诱导株质粒上也存在TEM型相近序列，说明福氏志贺氏菌本身具有TEM型ESBLs的大部分基因序列。本试验的测序结果表明，当标准福氏志贺氏菌TEM型相似氨基酸序列上263位的丙氨酸变为苏氨酸时，诱导菌产生普通内酰胺酶，该酶TEM型序列与TEM-1（AY302260）比较发

29、生两处基因突变T234C和T402G，两位点突变都是沉默突变，即氨基酸序列相同，所以诱导产内酰胺酶TEM型序列为TEM-1型。而诱导菌产生的TEM型ESBLs序列与TEM-1比较发生4处基因突变G157A、A250G、C409T、T551C，其中409位突变是沉默突变，157、250、551这3个位点突变使相应氨基酸发生突变即Gly53Ser、Ile84Val、Val184Ala。证明诱导产TEM-1型内酰胺酶菌株在药物的持续压力下突变为产TEM-1V型ESBLs菌株，说明TEM-1普通内酰胺酶可直接进化为TEM-1V型ESBLs，这是鸡福氏志贺氏菌对头孢噻呋耐药及其演进的分子机制。近年来随着

30、头孢类药物在临床上的广泛使用，同株细菌表达多种亚型ESBLs现象不断被发现。2002年，波兰人Anna等在两株沙门氏菌中检出CTX-M-3型ESBLs，其中1株同时携带TEM-1b型内酰胺酶，另1株携带SHV-2a型ESBLs21。同年Cao等在越南2株临床肺炎克雷伯氏菌中同时检测到4种酶CTX-M-14/17、VEB-1、SHV-12和TEM-122。2003年，Corinne等在1株临床肺炎克雷伯氏菌中检出TEM-15和SHV-4，在另1株肺炎克雷伯氏菌中检出TEM-15和SHV-4423。2005年，西班牙学者从病畜体内检测到多种类型的ESBLs且多株菌上同时存在两种ESBLs，文中指出

31、CTX-M-14型ESBLs是最主要的类型24。同年Do´ra Szabo´等在1株大肠杆菌中同时检测到SHV-7型和SHV-30型ESBLs25。2005年，Jacob等报道在7株临床分离菌质粒上同时发现TEM-1和SHV-12，并指出携带TEM-1的质粒在细菌间的传播过程中获取了SHV-12序列2。本试验中临床福氏志贺氏菌均分离自1日龄应用头孢噻呋预防注射（鸡苗源自有连续2 年以上头孢噻呋应用史的孵化厂）后的49日龄病死鸡（23日龄开始发病），其质粒上同时携带SHV-12型和TEM-1V型ESBLs，而用头孢噻呋诱导产ESBLs的标准志贺氏菌质粒上仅携带TEM-1V型，

32、说明SHV-12型可能是临床志贺氏菌从其它产ESBLs的细菌中通过转座或重组作用而获得的外源基因。4 结论临床分离鸡福氏志贺氏菌ESBLs的基因型为TEM-1V型和SHV-12型，其中TEM-1V型为新的ESBLs亚型，SHV-12型与临床上已报道的其它细菌产生的SHV-12型完全相同，但对于产ESBLs的志贺氏菌来讲，SHV-12是一种新的ESBLs亚型。头孢噻呋诱导标准福氏志贺氏菌至10代时，产生的内酰胺酶基因型为TEM-1型，诱导至50代时，产生的ESBLs基因型为TEM-1V型。其ESBLs序列与临床产ESBLs福氏志贺氏菌的序列完全相同，说明临床鸡福氏志贺氏菌在药物的选择压力下可由T

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