己烯雌酚人工抗原的合成及其抗体制备

1、己烯雌酚人工抗原的合成及其抗体制备陈德坤1,郑增忍2,曲志娜2,雷莉辉1,张佩君3(11西北农林科技大学动物科技学院,陕西杨凌712100;21农业部动物检疫所,山东青岛266032;31陕西省教育学院生物系,陕西西安710003摘要:以己烯雌酚(D ES 、琥珀酸酐和牛血清白蛋白(BSA 等为主要原料,采用混合酸酐反应,首先合成己烯雌酚半琥珀酸酯(D ES 2H S ,经质谱分析鉴定后,再将D ES 2H S 结合到BSA 上,并用SD S 2PA GE 对D ES 2H S 2BSA 进行测定。以D ES 2H S 2BSA 免疫家兔6次,用琼脂双扩散试验测定抗体。试验结果表明,高分辨质谱

2、测得合成的D ES 2H S 分子量为368;BSA 2H S 2D ES 的SD S 2PA GE 图谱经相关软件分析表明,单个BSA 上结合有32个D ES 2H S ;琼脂扩散试验结果证实,免疫兔血清中含有抗D ES 的抗体。本试验为下一步研制D ES 残留免疫检测试剂盒及抗D ES 单抗奠定了基础。关键词:己烯雌酚;琥珀酸酐;牛血清白蛋白;混合酸酐反应;抗D ES 抗体中图分类号:S 852143文献标识码:A 文章编号:100524545(20040420364203己烯雌酚(D ES 是一种人工合成的雌激素,在医学临床上普遍用于妇科病的治疗,而且还被用作动物饲料添加剂,以促进动物生

3、长,提高产量1,2。国内外大量研究表明3,己烯雌酚可以破坏机体遗传物质,导致基因突变而引发机体肿瘤。因此,国内外所颁布的食品安全法均规定,动物性产品及食品中不得检出己烯雌酚。目前,国外已经建立了成熟的己烯雌酚残留免疫检测方法,并有相关的诊断试剂盒。目前,国内检测己烯雌酚主要采用高效液相色谱(H PL C 法或气相色谱2质谱(GC 2M S 法。为开发研制具有我国自主知识产权的药物残留(包括己烯雌酚免疫检测试剂盒,达到能够对批量样品进行快速、准确检测的目的,特进行了本研究。1材料与方法111主要试剂和仪器己烯雌酚,纯度99%,美国Sigm a 公司产品;琥珀酸酐,上海化学试剂公司;氯甲酸异丁酯,

4、CP ,上海飞详化工厂;三正丁胺,CP ,北京化工厂进口分装;牛血清白蛋白(BSA ,华美生物工程公司;其他试剂均为A R 级。Z AB 2H S 仪器、FT 2M S A PXX 仪器、凝胶成像系统(UV P B i o i m aging System 及其分析软件(lab w o rk s 410I m age A c 2qu isiti on and A nalysis Softw are 。112试验动物成年健康家兔,体质量215kg 左右,购自青岛医学院试验动物中心。113己烯雌酚半琥珀酸酯(D ES -HS 的合成D ES 2H S 的合成路线如下:HOCC 2H 6C C 2H

5、 6OH +O C OCH 2COC H 2HOCC 2H 6C C 2H 6OC OCH 2CH 2C OOH 收稿日期:2003212222作者简介:陈德坤(19642,男,副教授,博士。将70m g D ES 溶于5mL 吡啶中,搅拌至完全溶解,再加入琥珀酸酐25m g ,置于通风橱中,在室温下搅拌48h 。反应完成后,将反应液移入30mL 冰蒸馏水与5mL 浓盐酸组成的混合液中静置过夜,抽滤析出的沉淀,并以蒸馏水洗至pH 515左右,真空干燥,得粗产品。将所得粗产品加入丙酮溶解后,拌入等量的硅胶,室温下晾干,用200300目硅胶柱层析分离,用TL C 监测,收集R f =0109(展开

6、剂,石油醚丙酮=31的点合并,常温下干燥,即得D ES 2H S 纯品。对该物质进行高分辨质谱测定。114D ES -HS -BSA 的合成将D ES 2H S 2BSA 50m g 溶于二氧六环中,置4下10m in ,然后加入20L 三正丁胺,混匀,再加入15L 氯甲酸异丁酯,4条件下搅拌30m in ,此为甲液。另取150m g BSA 溶于20mL 的70%二氧六环水溶液中,此为乙液。将甲液与乙液合并,4下搅拌过夜,将反应液流水透析2h ,然后换成平衡盐溶液继续透析48h 。浓缩透析液,冷冻干燥。用5%的积层胶和10%的分离胶对D ES 2H S 2BSA 进行SD S 2PA GE

7、鉴定,通过紫外凝胶成像系统分析软件分析得出D ES 2H S 2BSA 的分子量,以此为依据推算单个BSA 上结合D ES 2H S 的数目。115D ES -HS -OVA (卵清蛋白的合成参照方法114进行。116动物免疫试验用无菌生理盐水溶解D ES 2H S 2BSA 后,与等量的弗氏完全佐剂混合,在混合振荡器上充分振荡,使其完全乳化,D ES 2H S 2BSA 的最终含量为1g L 。在家兔脊椎两侧交叉选取68个点,做皮下注射免疫,免疫剂量为2mL只。2025d ,进行第2次免疫,免疫途径及免疫剂量同第1次,佐剂为弗氏不完全佐剂。以后,每隔15d 加强免疫1次,免疫剂量均为上次的2

8、倍,免疫途径为皮下注射,免疫时不使用弗氏佐剂。免疫共进行6次,最后1次免疫后10d ,经心脏无菌采血,分离免疫血清。117抗D ES 抗体的测定按照常规的琼脂双扩散试验进行。在1%琼脂糖凝胶上打出梅花孔,挑去孔中琼脂块,用015%融化琼脂封底。向中央孔加入分离的免疫兔血清,周围孔分别加D ES 2H S 2BSA 、OVA 、D ES 2H S 2OVA ,在37感作2448h 后,将琼脂糖凝胶用生理盐水漂洗24h ,用011%考马斯亮蓝染液染色,经脱色后,对琼扩试验结果照相。2结果 2.1D ES -HS 的高分辨质谱测定结果FAB M S 测定结果为,M +368(63(M +N a +3

9、91(17,351(M 2OH (16,307(M 2OH 2CO 2(6(图1。HRM S 分析,C 22H 24O 5+N H 4计算值为38611962,实测值为38611959,误差017ppm ,在10ppm 范围内。结果表明,新合成的D ES 2H S 的分子量为386。 图1D ES 2H S 的质谱测定结果 2.2D ES -HS -BSA 的S D S -PAGE 结果为进一步证实BSA分子上确实挂载了D ES 半抗原,并计算出每个BSA 分子上所结合的半抗原数目,对D ES 2H S 2BSA 进行了SD S 2PA GE (图2。电泳图谱显示出BSA 的泳动速度大于D E

10、S 2H S 2BSA ,说明D ES 2H S 2BSA 的分子量大于BSA ,证明D ES 2H S 已经结合在BSA 上。通过紫外凝胶成像系统分析软件分析得出,D ES 2H S 2BSA 的相对分子质量为77950,BSA 的相对分子质量为66200,每个BSA 分子上结合的半抗原数目为(77950-6620036832。 图2D ES 2H S 2BSA 的SD S 2PA GE 结果11M arker ;21BSA 标准品;31D ES 2H S 2BSA2.3抗D ES -HS 抗体的测定结果以D ES 2H S 2BSA 免疫家兔,家兔不仅产生针对D ES 2H S 的抗体,还

11、产生针对BSA 表面功能抗原决定簇的抗体,这是琼扩试验中免疫血清孔和D ES 2H S 2BSA 孔之间形成的沉淀线比较粗的原因(图3。由于BSA 和OVA 无共同的抗原性4,因此OVA 孔和中央孔之间无沉淀线形成。D ES 2H S 2OVA 孔和中央孔之间形成1条细而清晰的沉淀线,并且该沉淀线与免疫血清孔和D ES 2H S 2BSA 孔之间形成的沉淀线完全融合,说明免疫血清中确实含有抗D ES 2H S 的抗体。图3抗D ES 抗体的琼扩试验结果中央孔1免疫血清;1,3孔.D ES 2H S 2BSA ;4,5孔.D ES 2H S 2OVA ;2,6孔.OVA3讨论小分子药物残留是影响

12、动物性食品安全的关键因素之一。对这类小分子残留的常规检测方法主要有液相色谱法、气相色谱法等。这类方法灵敏度高、准确,但比较耗时,且需要的仪器昂贵,难以进行大批量样品的检测。为满足实践中批量样品残留检测的需要,近年来相继研制出了多种用于小分子药物残留检测的免疫试剂盒,如盐酸克伦特罗、氯霉素等免疫检测试剂盒。国内尚未见己烯雌酚残留免疫检测试剂盒研制的报道。本研究制备出的抗己烯雌酚抗体,为下一步研制己烯雌酚残留免疫检测试剂盒奠定了基础。半抗原本身无免疫原性,只有当其与载体结合后,才能够获得免疫原性。对于没有氨基或羧基基团的半抗原,必须进行适当的化学修饰,在其上加载1个含有氨基或羧基的基团,才可以将其

13、连接到载体上。己烯雌酚便属于此类半抗原。对己烯雌酚进行化学修饰应当尽可能不影响己烯雌酚的结构和构型,否则免疫动物制备出的抗体可能与己烯雌酚本身的亲和力较差,或与其他物质发生交叉反应的几率较高。考虑到己烯雌酚本身属于小分子,所以在加载功能性羧基基团时,我们使用的是丁二酸酐,只与己烯雌酚一侧的酚羟基反应,形成己烯雌酚半琥珀酸。这样,不仅最大限度地减少了对己烯雌酚本身结构和构型的影响,而且形成的己烯雌酚半琥珀酸有一个较长的“臂”,与载体结合后有利于淋巴细胞的免疫识别。据报道5,当1个载体结合2535个半抗原分子时,免疫动物相对容易产生抗体。本试验以含有32个D ES 的BSA 2H S 2D ES

14、免疫家兔,用琼脂双扩散试验进行的特异性抗体检测也证实了这一点。Rom bau ts 等6报道,D ES 也能够与2乙基溴化丁酸盐反应,产物为D ES 22乙基溴化丁酸。他们通过2乙基溴化丁酸盐与己烯雌酚一侧的酚羟基发生化学反应,在己烯雌酚上加上一个“臂”长为4个碳原子的带有羧基的基团,从而使经过化学修饰的己烯雌酚能够与载体结合。但是他们制备的经过化学修饰的己烯雌酚极不稳定,且难以提纯。本试验制备的D ES 2H S 稳定性较强,也能够提纯,这不仅有利于对D ES 2H S 进行分析鉴定,同时对于下一步将D ES 2H S 顺利地结合到BSA 上十分重要。本研究制备抗己烯雌酚抗体,不仅为建立己烯

15、雌酚残留的免疫学检测方法打下了良好基础,也为进一步研制抗己烯雌酚单抗提供了很好的手段。(本研究在进行己烯雌酚化学修饰的工作中,得到兰州大学化学系田暄教授的大力协助,并承蒙田暄教授对质谱结果进行分析判定,在此表示衷心感谢参考文献:1冯红旗,李洪玲,杨如镜,等.12例T urner 综合征内分泌激素的观察J .中国优生与遗传杂志,1999,7(2:54255.2杨胜林,蒋诚绩.己烯雌酚对山羊育肥增重效果的研究J .当代畜牧,2001,(2:31232.3N ielsem M ,B j rnsd ttir S ,H yer P E ,et al .O ntogeny of oestro 2gen r

16、ecep to r a in gonads and sex ducts of fetal and new bo rn m ice J .J R ep rod Fertil ,2000,118:1952204.4Dong M in ,L I Guofu ,L i J in ,et al .I mm uno logical detecti on of ar 2butin J .T singhua Sci T echno l ,1999,4(3:3112316.5姜玲,章文才,柯云,等.抗槲皮素抗体的研制J .免疫学杂志,2000,16(5:3832386.6Rom bauts P ,P ierde

17、t A ,Jouquey A .Study on the antiserum ofD iethylstilbestro l J .R A cad Sci Ser D ,1973,277:192121924.Syn thesis of D iethylstilbestrol and the Prepara tion of Its An tibodyCH EN D e 2kun 1,ZH EN G Zeng 2ren 2,QU Zh i 2na 2,L E IL i 2hu i 1,ZHAN G Pei 2jun 3(1.Colleg e ofA n i m a l H usband ry and

18、 V eterina ry S cience ,N orthw estern S ci 2T ech U n iversity of A g ricu ltu re and F orest ,Y ang ling ,S haanx i 712100,Ch ina ;2.Q ua ran tine Institu te of A g ricu ltu ra l M in istry ,Q ing d ao 266032,Ch ina ;3.B iology D ep a rt m en t of S haanx i E d uca tiona l Institu te ,X i an 71000

19、3,Ch ina Abstract :D iethylstilbestro l hem isuccinate (D ES 2H S w ere syn thesized and coup led to bovine serum album in (BSA w ithm ixed 2anhydride m ethod ,and the pu rified D ES 2H S w ere iden tified by h igh m ass spectra (HRM S ,and the BSA 2H S 2D ES w ereiden tified by SD S 2PA GE .BSA 2H

20、S 2D ES w ere in jected to b ig ear rabb its 6ti m es in certain in terval.A n tibody to diethylstilbestro l w ere determ ined by agar diffu si on test .T he resu lts show ed that the mo lecu lar w eigh t of syn thesized D ES 2H S in 36811959,and the num ber of D ES 2H S coup led to each BSA mo lecu

21、 le is 32.T he an tibody to diethylstilbestro l does ex ist in the i m m un ized rab 2b it serum .It w as demon strated that artificial i m m unogen of diethylstilbestro l cou ld be syn thesized by m ixed 2anhydride m ethod and the specificity of the po lyclonal an ti 2diethylstilbestro l an tibodie

22、s cou ld be p roduced .Key words :diethylstilbestro l ;succin ic anhydride ;bovine serum album in (BSA ;m ixed 2anhydride m ethod ;an ti 2diethyl 2stilbestro l an tibodies半胱胺对成年鹅血浆中几种激素及胆固醇水平的影响艾晓杰1,郑元林2,刘根桃2,陈伟华2,韩正康2(11上海交通大学农业与生物学院动物科学系,上海201101;21南京农业大学农业部动物生理生化重点实验室,江苏南京210095摘要:以14只装有超静脉瘘管的成年杂交鹅(川白太湖,圈养,自身对照。试验期于日粮中一次性添喂半胱胺(按每千克体质量100m g ,经瘘管采取对照期和处理后第1、3、5、7天的血样,用R I A 双抗法和分光光度法分别测定激素和胆固醇的含量。试验期各天,生长抑素的含量较对照期的(11890110g L