HeLa细胞中HCV NS5A的表达对干扰素敏感病毒VSV复制的影响

1、HeLa细胞中HCV NS5A的表达对干扰素敏感病毒VSV复制的影响 作者：廖继佩，薛，尹文，雷迎峰，吕欣，杨敬，徐志凯【关键词】 丙型肝炎病毒Effect of HCV NS5A expression in HeLa cells on interferon sensitive virus VSV replication【Abstract】 AIM: To demonstrate the effect of HCV NS5A expression on vesicular stomatitis virus （VSV） replication. METHODS: Stably transfect

2、ed cells were cultured per well in a 6well tissue culture plate and cultured for 24 h. Human recombinant IFN2a was then added at various concentrations for 24 h to induce the IFN antiviral state. Infection with VSV was then performed and supernatants were harvested at various time points after infec

3、tion. Changes in infectious virus yields were measured by a standard virus plaque assay in Vero cells. RESULTS: When the IFN concentration was 1105 U/L, HeLaNS5A cells infected with VSV had more obvious cytopathic effect compared with that of HeLaNS5AISDR cells. In the various concentration treatmen

4、ts of IFN, the virus titers in the supernatant of HeLaNS5A cells were about 2 to 5 times those of HeLaNS5AISDR cells (P0.05). CONCLUSION: NS5A expression rescues VSV replication during IFN treatment and this effect is dependent on the putative interferonsensitivity determining region (ISDR). This ef

5、fect will be helpful to demonstrate that HCV can naturally evade the IFNinduced antiviral response in persistently infected patients.【Keywords】 hepatitis C virus; nonstructural protein 5A; interferonsensitivity determining region; vesicular stomatitis virus; plaqueforming unit【摘要】 目的：研究丙型肝炎病毒（HCV）NS

6、5A的表达对水泡性口炎病毒(VSV)复制的影响. 方法：将稳定转染的HeLaNS5A和HeLaNS5AISDR细胞在6孔培养板中培养24 h后，加入人基因工程2a型干扰素(rHuIFN2a)至所需浓度. 培养24 h后加入VSV，继续培养相应时间. 取培养上清液，按10-1稀释，50 L稀释液加入含Vero细胞的24孔培养板中. 每孔加入含100 mL/L小牛血清 的DMEM7.5 g/L羧甲基纤维素钠(CMC) 1 mL. 继续培养48 h后移走培养液，结晶紫染色，自来水轻柔洗净，记录噬斑形成单位(PFU). 结果：干扰素(IFN)浓度为1105 U/L，VSV对HeLaNS5A细胞的致病变

7、作用要比对HeLaNS5AISDR细胞的致病作用更明显. 在整个IFN浓度处理中，HeLaNS5A细胞培养液中的病毒滴度是HeLaNS5AISDR细胞培养液中的病毒滴度的25倍(P0.05). 结论：NS5A能增强IFN敏感病毒的复制，HCV NS5A内的ISDR可能是造成IFN对HCV患者治疗效果的因素.【关键词】 丙型肝炎病毒;非结构蛋白5A;干扰素敏感决定区;水泡性? （HeLa细胞中HCV NS5A的表达对干扰素敏感病毒VSV复制的影响 谘撞?空斑形成单位0引言干扰素(interferon,IFN)是目前治疗丙型肝炎最有效的药物，但治愈率不到30%. 有人认为，NS5A内存在干扰素敏感

8、决定区(interferonsensitivity determining region, ISDR)，影响IFN的抗病毒疗效. 在临床研究中，丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV) NS5A对IFN抗病毒治疗具有固有抗性的观点仍有争论. NS5A可利用所谓的ISDR外的序列来干扰或逃避IFN诱导的抗病毒效应,宿主介导的压力选择主要作用在NS5A的C端1，但是Mangoni等2认为ISDR的上游变异性与IFN治疗应答有关. 另外，NS5A可能与2,5寡腺苷酸合成酶(25OAS)相互作用，以ISDR非依赖机制抑制IFN的抗病毒活性3. 为了进一步探明HCV NS5A中是否存在

9、影响IFN治疗的结构域，在已经成功构建的稳定转染HeLaNS5A和HeLaNS5AISDR细胞系的基础上，我们利用对IFN敏感的病毒水泡性口炎病毒(vesicular stomatitis virus, VSV)，在IFN存在的条件下通过对比分析VSV在这两株细胞系中复制的差异，探讨HCV NS5AISDR与IFN疗效的相关性.1材料和方法稳定转染的HeLaNS5A和HeLaNS5AISDR细胞系由第四军医大学基础部微生物学教研室构建; VSV病毒由第四军医大学生物技术中心提供(51010 PFU/L); Vero细胞由本室保存; 胰蛋白酶购于宝生物工程(大连)有限公司; DMEM和HEPES

10、购自Invitrogen公司; 结晶紫购自湖南化学试剂公司; 羧甲基纤维素钠(CMC，中等黏度，分析纯)购自天津市科密化学试剂开发中心; 小牛血清购于中美合资兰州民海生物工程有限公司; 人基因工程2a型干扰素(rHuIFN2a)购自第四军医大学生物技术中心(1107 U/支).称取1.5 g CMC，溶于100 mL三蒸水中，高压灭菌. 将配好的100 mL 2DMEM移入盛有100 mL 15 g/L CMC的玻璃瓶中混匀，然后加入22 mL小牛血清，此即为含100 mg/L小牛血清的DMEM7.5 g/L CMC溶液. 称取5 g结晶紫，溶于100 mL无水乙醇，此即为50 g/L结晶紫贮

11、存液. 待使用时移取50 g/L结晶紫贮存液8 mL，8.5 g/L NaCl 30 mL，甲醛2 mL，混匀后即为10 g/L结晶紫染色液. 将IFN加入培养上清液至终浓度为1105 U/L，培养24 h后，按感染复数(MOI)=1加入相应体积的VSV病毒贮存液. 继续培养36 h后在倒置显微镜下观察VSV对稳定转染的HeLaNS5A和HeLaNS5AISDR细胞形态的影响. 在6孔培养板中每孔加入稳定转染的HeLaNS5A和HeLaNS5AISDR细胞5105个. 培养24 h后，加入rHuIFN2a(0，2104，1105，3105，6105，1106 U/L). 培养24 h后按MOI

12、=1加入VSV，继续培养24 h和36 h. 取培养上清液稀释成10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7，取50 L稀释液加入24孔培养板中，每一处理均做3个平行孔. 其中，24孔培养板中每孔已加入5104个Vero细胞，并已培养了24 h. 将24孔培养板中放入37,50 mL/L CO2的孵箱中以利于VSV吸附在Vero细胞上，平衡吸附1 h后，将上层液移走，每孔加入100 mL/L小牛血清DMEM7.5 g/L CMC 1 mL. 继续培养48 h. 将24孔培养板中的培养液小心移走，PBS洗2次，10 g/L结晶紫染色20 min，弃染色液，用自来水轻柔洗净

13、，颜色较浅或白色的即为PFU，记录PFU值. 在6孔培养板中加入HeLaNS5A和HeLaNS5AISDR细胞5105个，每一种细胞各3孔. 在37/50 mL/L CO2的孵箱中培养24 h后，每一孔中加入IFN至终浓度为105 U/L，再继续培养24 h后，按MOI为0.1，1和10加入VSV，继续培养48 h，然后按1.2.4中的方法测定PFU值.统计学处理：数据用xs表示，采用SPSS软件(10.0版)行t检验，方差不齐组取t检验结果.2结果IFN浓度为1105 U/L时，HCV NS5A和NS5AISDR的表达对VSV复制产生不同影响，从而影响稳定转染的HeLaNS5A细胞和HeLa

14、NS5AISDR细胞形态. 由VSV对HeLaNS5A细胞的致病变作用比对HeLaNS5AISDR细胞的致病变作用更明显. 这种现象在36 h时较为明显(Fig 1).将VSV按0.1，1和10的MOI加入预先用1105 U/L IFN处理过的稳定转染HeLaNS5A和HeLaNS5AISDR细胞，培养24 h后HeLaNS5A细胞培养液中的VSV病毒滴度均显著高于HeLaNS5AISDR细胞培养液中的VSV病毒滴度(P0.05, Fig 2). 可见，不同感染复数时NS5A的表达均有利于VSV的复制.随着IFN浓度的增加，HeLaNS5A和HeLaNS5AISDR细胞培养液中的VSV病毒滴度

15、均逐渐减少，并且HeLaNS5A细胞培养液中的病毒滴度约是HeLaNS5AISDR细胞培养液中的病毒滴度的25倍(P0.05, Tab 1).表1HCV NS5A和NS5AISDR增强IFN敏感病毒的复制（略）3讨论IFN浓度增加后，HeLaNS5A细胞培养液中的病毒滴度升至HeLaNS5AISDR细胞培养液中的病毒 滴度的25倍. 提示全长NS5A的表达均有利于VSV的复制. 可见，NS5A可部分妨碍IFN抗VSV的活性，这一效应呈ISDR依赖性. 因此，存在于HCV NS5A内的ISDR，可能是造成IFN对HCV患者治疗效果存在明显差异的原因之一. 另外，随着IFN浓度的增加，HeLaNS

16、5A和HeLaNS5AISDR细胞培养液中的VSV病毒滴度均逐渐减少，这与IFN的抗病毒效应呈剂量依赖性相关. PKR，25寡腺苷酸合成酶/RNase L和Mx蛋白是IFN诱导的抗病毒效应的主要介质，在抗特定病毒攻击时所占比例不同，这将影响着HCV单一蛋白如NS5A在增强病毒活性的作用大小. 然而，Podevin等4认为，PKR并不调控NS5A对IFN抗病毒活性的抑制作用. NS5A可能通过与腺病毒E1A蛋白一样的方式干扰STAT/JAK途径而阻断了IFN信号转导5. 另外，NS5A与Grb2的结合可能亦为HCV通过下调IFN基因的表达而诱导或维系IFN抗性6. NS5A也可降低IFN对某些基

17、因的诱导作用，包括OASp697，这为NS5A介导的IFN抗性提供了另一种机制. 由此可知，NS5A可能通过与其他抗病毒相关的蛋白质相互作用而组成复杂的网络系统，妨碍IFN的抗病毒效应. 当然，本研究中ISDR是否也以上述NS5A的相同机制削弱IFN的抗病毒作用，粄HeLa细胞中HCV NS5A的表达对干扰素敏感病毒VSV复制的影响(3)欢迎您访问范,文,家褂写院蟮纳钊胙芯?当今临床研究中HCV NS5A蛋白在介导IFN抗性中的作用仍是有争议的领域. 因此，稳定表达NS5A的人细胞系的构建有重要意义. 这一系统将有助于研究来自临床病例样本的NS5A蛋白抗IFN活性的机制. 另外，由于HCV的耐

18、药性涉及到HCV的几种蛋白，研究这些蛋白有助于研究体外药物联合应用和抗药性机制.【参考文献】1 Nousbaum JB, Polyak SJ, Ray SC, et al. Prospective characterization of fulllength hepatitis C virus NS5A quasispecies during induction and combination antiviral therapy J. J Virol, 2000; 74(19): 9028-9038.2 Mangoni ED, Forton DM, Ruggiero G, et al. Hep

19、atitis C virus E2 and NS5A region variability during sequential treatment with two interferon preparations J. J Med Virol, 2003; 70:62-73.3 Taguchi T, NaganoFujii M, Akutsu M, et al. Hepatitis C virus NS5A protein interacts with 2,5oligoadenylate synthetase and inhibits antiviral activity of IFN in an IFN sensitivitydetermining regionindependent manner J. J Gen Virol, 2004; 85: 959-969.4 Podevin P, Sabile A, Gajardo R, et al. Expression of hepatitis C virus NS5A natural mutants in a hepatocytic cell line inhibits the antiviral effect