N-CWS对小鼠膀胱癌抑癌效应的影响--白细胞介素2水平及自

1、    N-CWS对小鼠膀胱癌抑癌效应的影响-白细胞介素2水平及自然杀伤细胞活性观察        摘要目的：探讨红色诺卡氏菌细胞壁骨架(Nocardia rubr a cell wall skeleton,N-CWS)对膀胱肿瘤的治疗效果及免疫学机制。方法：膀胱癌荷瘤鼠注射N-CWS，观察N-CWS的抑瘤效果及N-CWS对白细胞介素2(IL-2)水平和自然杀伤(NK)细胞活性的影响。结果：注射N-CWS的膀胱癌荷瘤鼠的抑瘤率为96.2%，其IL-2水平及NK细胞活性明显高于

2、肿瘤对照组。结论：N-CWS对膀胱癌具有明显的抑制作用，其机制可能是通过提高机体的IL-2水平和NK细胞活性促进机体的抗肿瘤免疫而实现的。关键词诺卡氏菌属膀胱肿瘤白细胞介素2杀伤细胞，天然免疫疗法 Effect of nocardia rubra cell wall skeleton on the acti vities of IL-2 and NK cell in syngenic mice bearing bladder carcinomaCui ZheLi LimingWu Mingminget alDepartment of Urology,the General Hospital,T

3、ianjin Medical University,Tianjin,300052AbstractPurpose：To investigate the effect and immunol ogical mechanism of nocardia rubra cell wall skeleton(N-CWS) on bladder carcino ma.Methods：The effects of N-CWS on bladder carcinoma and on the activities of interleukin-2(IL-2) and NK cell were studied in

4、syngenic mice bearing bladder carcinoma.Results：The tumor inhibiti on rate treated by N-CWS was 96.2%. The level of IL-2 and the activity of NK cell in the group treated by N-CWS were higher than those in control group.Conclusions：N-CWS had significant inhibitory effect on bladder carcinoma, which d

5、epended on the enhancement of immunological function against tumor owing to increasing the level of IL-2 and the activity of NK cell in the body.Key wordsNocardia rubraBladder tumorInterleukin-2 NK cellImmunotherapy红色诺卡氏菌细胞壁骨架(Nocardia rubra cell wall skelet on,N-CWS)是放线菌诺卡氏菌属红色诺卡氏菌的细胞壁提取物，文献报道N-CWS

6、可非特异性地刺激细胞免疫功能，提高巨噬细胞、NK细胞及杀伤性T细胞活性，并可促进多种细胞因子的分泌，参与抗肿瘤免疫过程1。本实验观察N-CWS对小鼠膀胱癌同系移植瘤的抑瘤作用及对荷瘤鼠脾淋巴细胞分泌白细胞介素2(IL-2)及自然杀伤(NK)细胞活性的影响，并探讨其抑瘤机制，现报告如下。1材料与方法实验动物及分组选择46周龄T739小鼠32只(购自中国医学科学院肿瘤研究所动物中心)，体重1823g，雌雄各半。将32只小鼠随机分为3组，N-CWS组与肿瘤对照组各12只，正常对照组8只。荷瘤鼠模型的制作可移植性小鼠膀胱癌瘤株BST7392由南京铁道医学院惠赠。取皮下接种1014d的荷瘤鼠1只，断椎处

7、死，无菌条件下剥离瘤块，取肿瘤边缘生长旺盛的瘤块，经研磨过筛加冷生理盐水制成单细胞悬液，调整细胞数为1.6×106/ml。N-CWS组和肿瘤对照组每只小鼠于腋窝皮下注射肿瘤细胞悬液1.6×104/0.1ml。N-CWS剂量及给药途径N-CWS组小鼠于接种肿瘤后7d及14d分别给药1次，在接种肿瘤的对侧腋窝皮下注射N-CWS50g/0.15mlN-CWS冻干粉剂以生理盐水溶解(福建省微生物研究所生产)。肿瘤对照组小鼠注射等量生理盐水。抑瘤效应观察接种肿瘤后20d处死小鼠，先取脾脏做免疫测定，再剥离肿瘤称瘤重。按下式计算抑瘤率及肿瘤消退率。抑瘤率=(1-实验组瘤重/对照组瘤重)

8、×100%。肿瘤消退率=实验组肿瘤消退只数/实验组总只数×100%。IL-2及NK细胞活性测定标本采集：小鼠断椎处死后立即在75%乙醇中浸泡2min，然后在无菌条件下取小鼠脾脏，研磨后用15%胎牛血清-1640(FCS-1640)制成单细胞悬液，调整细胞浓度至5×106/ml，将细胞悬液加至24孔培养板中，每孔2ml。加入植物血凝素(PHA，100g/ml，10l/孔)用于测IL-2。将24孔板在37、5%CO2条件下孵育48h，取上清转入Eppendorf管中置冰箱内贮存备用。IL-2活性测定：HT-2细胞株为IL-2依赖细胞株，将HT-2细胞培养至对数生长期，

9、调整细胞数为1×105/ml，加入96孔细胞培养板，每孔加细胞悬液100l，分别加入待测样品及IL-2标准品各100l，在37、5%CO2条件下培养48h后加入四甲基偶氮唑(MTT，0.5mg/ml)50l/孔，培养4h，加入盐酸异丙醇(1300)，振荡，酶标仪测其OD值，波长为570nm，绘出标准曲线，求出样品IL-2含量。NK细胞活性测定：采用MTT法3。先培养K562细胞株，实验前36h常规传代，实验时配制1×105/ml细胞悬液，于96孔培养板加100l/孔。然后于每孔加小鼠脾细胞悬液100l/孔，使效靶比为501。每份样品设4个平行孔，同时设效应细胞及靶细胞对照孔

10、，于37、5%CO2孵育箱中培养20h，2000r/min离心10min，弃去上清，然后向反应板中加入MTT(5mg/ml)10l/孔，振荡5min后培养4h，再离心弃上清。加盐酸异丙醇(1300)100l/孔，振荡15min后在酶标仪上于570nm波长测OD值。按下列公式计算杀伤率。杀伤率(%)=1-OD(E+T)/ODT-ODE/ODT×100%。OD(E+T)指效应细胞+靶细胞孔OD值；ODE指效应细胞对照孔OD值；ODT指靶细胞对照孔OD值。统计学处理组间差异的显著性检验用方差分析及t检验。2结果N-CWS对荷瘤鼠的抑瘤效应肿瘤对照组12只小鼠接种肿瘤后均见肿瘤生长，无肿瘤消

11、退情况，而N-CWS组12只小鼠中有7只可见肿瘤生长，另外5只小鼠直至实验结束解剖检验无肉眼可见的瘤结生长。全部小鼠接种肿瘤后20d处死，剥离肿瘤称重，观察肿瘤生长情况，结果见表1。表1N-CWS组与肿瘤对照组肿瘤生长情况比较组别动物只数接种成瘤(只)肿瘤消退率(%)瘤重(g)抑瘤率(%)肿瘤对照组12120-N-CWS组127*     此组中有2只小鼠在实验结束前死亡未称重，瘤重为10只小鼠统计结果；*各组小鼠IL-2水平及NK细胞活性检测结果结果见表2。从表2显示，肿瘤对照组小鼠IL-2水平及NK细胞活性均明显低于正常对照组小鼠(P0.01)，提示

12、荷瘤鼠免疫功能受到抑制。N-CWS组IL-2水平及NK细胞活性则明显高于肿瘤对照组。表2各组小鼠IL-2水平与NK细胞活性比较组别动物只数IL-2水平(u/ml)NK细胞活性(%)正常对照组8肿瘤对照组8*N-CWS组12*     12只小鼠在实验结束前死亡4只，8只做免疫检测；*与正常对照组比较P0.01；3讨论N-CWS是由日本学者首先报道的一种非特异性免疫增强剂。1976年Azuma等4研究了8种诺卡氏菌制剂对肥大细胞瘤细胞介导的细胞毒效应，筛选结果认为N-CWS作用最强，Azuma等4还比较了N-CWS与卡介苗(BCG)的抑癌作用，结果显示3种

13、剂量的N-CWS皆比对应剂量的BCG抑癌作用强。许多实验表明N-CWS对多种动物实验性肿瘤及人类肿瘤有明显的抑癌作用5，6。国内陈仕平等7通过用N-CWS膀胱灌注预防膀胱癌术后复发的临床观察，认为N-CWS的效应高于丝裂霉素C(MMC)，而副作用却明显减少。IL-2是T淋巴细胞产生抗肿瘤细胞毒活性的主要辅助因子，IL-2也可促进NK细胞增殖，增强NK细胞杀伤活性。此外，IL-2还可诱导LAK细胞发挥抗肿瘤效应。IL-2除对多种免疫效应细胞起调节作用外，还参与干扰素(IFN-)等多种细胞因子的相互诱生、受体调节或生物学活性彼此协同。NK细胞是机体抗肿瘤免疫的主要效应细胞之一，具有非特异性地杀伤肿

14、瘤细胞的作用。IL-2水平及NK细胞杀伤活性被广泛地用于反映机体免疫功能和抗肿瘤免疫水平。本实验采用同系移植膀胱癌小鼠模型，观察给予N-CWS对肿瘤的抑癌效应并检测IL-2水平及NK活性，结果显示肿瘤对照组小鼠IL-2水平及NK细胞杀伤活性明显低于正常小鼠，这是由于肿瘤对机体免疫抑制作用的影响，而N-CWS组小鼠IL-2水平及NK细胞杀伤活性则较肿瘤对照组高，而且N-CWS组小鼠肿瘤明显小于肿瘤对照组，有的甚至未见瘤结的生长，抑瘤率达96.2%，证实N-CWS可促进抗肿瘤免疫功能而发挥其抑癌效应。Yamakido等8观察接受N-CWS治疗的毒气作业工人的IL-2及淋巴细胞增长率均有明显的增加。

15、文献报道N-CWS除可提高多种细胞因子的水平之外，还对巨噬细胞、杀伤性T细胞、LAK细胞、NK细胞的杀伤活性有促进作用911。本实验结果显示给予N-CWS的小鼠NK细胞杀伤活性增强，但NK细胞是否在N-CWS增强肿瘤免疫的机制中起主要作用尚不能确定。一些学者认为，N-CWS可以提高NK细胞的杀伤活性以发挥其抗肿瘤效应，而Izumi等12认为N-CWS的抗癌效应主要是由巨噬细胞起作用，他们的根据是切除了脾脏的小鼠再给予N-CWS，N-CWS的抗癌效应消失；而T细胞或NK细胞缺失的小鼠给予N-CWS后抗癌效应则不消失。总之，N-CWS可促进多种细胞因子的分泌并可提高免疫活性细胞的杀伤活性，对多种动

16、物实验性肿瘤及人类肿瘤有抑癌效应，但究竟哪些因素起主要作用仍需进一步研究。(本研究IL-2水平及NK细胞活性的检测得到天津医科大学检验系免疫学教研室大力协助，特此致谢)资助项目：天津市21世纪青年科学基金资助项目作者单位：天津医科大学总医院泌尿外科(天津，300052)参考文献1王益寿主编.医用生物制品学.杭州：浙江科学技术出版社，1991.6426442蒋峰，周性明，张忠林.可抑制性小鼠膀胱癌模型的建立.中华泌尿外科杂志，1993，14：1841863张志强，田志刚，崔正言，等.MTT法检测NK和LAK活性的方法学探讨.中国实验临床免疫学杂志，1994，6：12144Azuma I,Tani

17、yama T,Yamawaki M,et al.Adjuvant and antitumor activities of nocardia cell wall skeletons.Gann,1976,67：7337365Kawase I,Uemiya M,Yoshimoto T,et al.Effect of nocardia rubra cell wall skeleton on T-cell-mediated cytotoxicity in mice bearing syngeneic sau coma.Cancer Res,1981,41,6606666王常惠，林宝英，王琳，等.N-CW

18、S治疗晚期肺癌胸水58例临床观察.福建医学院学报，1990，24：2312347陈仕平，许恩赐，林震，等.N-CWS膀胱灌注预防膀胱癌术后复发的远期疗效观察.中华泌尿外科杂志，1996，17：4124148Yamakido M,Yanagida J,Ishioka S,et al.Effects of nocardia cell wall skeleton on interteukin 2 production and lymphocyte proliferatin in former poison gas factory workers.Jpn J Cancer Res (Gann),1986,77：4064129Masuno T,Hayashi S,Ito M,et al.Mechanism(a) of in vitro macroph age activation with nocardia rubra cell wall skeleton：the effects on macrophage activating factor production by lymphocytes.Cancer Immunol Immunother,1