最新PCR技术的过程和意义

1、PCR技术的过程和意义一. PCR技术的基本原理类似于DA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核昔 酸引物。PCR是一种体外DNA扩增技术，是在模板DNA、引物和4种脱氧核昔酸存在的条件下，依赖于DNA聚合酶的酶促合反应，将待扩增的DNA片段与其两侧互补 的寡核昔酸链引物经“高温变性一一低温退火一-引物延伸三步反应的多次循 环，使DNA片段在数量上呈指数增加，从而在短时间内获得我们所需的大量的特 定基因片段。在环境检测中，靶核酸序列往往存在于一个复杂的混合物如细胞提取液中, 且含量很低，对于探测这种复杂群体中的特异微生物或某个基因，杂交就显得不 敏感。使用PCR技术可将靶序列放大

2、儿个数量级，再用探针杂交探测对被扩增序 列作定性或定量研究分析微生物群体结构。二. PCR技术的步骤PCR山变性一退火一延伸三个基本反应步骤构成: 1、模板DXA的变性模板DNA经加热至93C左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形 成的双链DXA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备;2、模板DXA与引物的退火(复性)模板DXA经加热变性成单链后，温度降至55C左右，引物与模板DNA单链 的互补序列配对结合;3、引物的延伸DNA模板一引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料,靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DM链互 补的

3、半保留复制链，重复循环变性一退火一延伸三过程，就可获得更多的“半保 留复制链”，而且这种新链乂可成为下次循环的模板。每完成一个循环需24 分钟，23小时就能将待扩日的基因扩增放大儿百万倍。到达平台期(Plateau) 所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。三. PCR技术的意义1、特异性强PCR反应的特异性决定因素为: 引物与模板DNA特异正确的结合: 碱基配对原则: Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性; 靶基因的特异性与保守性。其中引物与模板的正确结合是关键。引物与模板的结合及引物链的延伸是遵 循碱基配对原则的。聚合酶合成反应的忠实性及TaqDXA聚合酶耐高温性，使反 应中模板与引物的结合（

4、复性）可以在较奇的温度下进行，结合的特异性大大增 加，被扩增的靶基因片段也就能保持很高的正确度。再通过选择特异性和保守性 高的靶基因区，其特异性程度就更高。2、灵敬度高PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克（pg=10-12）量级的起始待测模板扩增到微克（U g=-6）水平。能从100万个细胞中检出一个靶细胞；在病的检测中，PCR的灵敬度可达3个RFU（空斑形成单位）：在细菌学中最小检 出率为3个细菌。3、简便、快速PCR反应用耐高温的Taq DNA聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在DNA扩增液和水浴锅上进行变性-退火-延伸反应，一般在24小时完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析，不

5、一定要用同位素，无放射性污染、易推广。4. 对标本的纯度要求低不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA粗制品及RXA均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等DM扩增检 测。四、PCR技术主要应用的领域1、核酸的基础研究：基因组克隆 2、不对称PCR制备单链DM用于DM测序 3、反向PCR测定未知DXA区域 4、反转录PCR （RT-PCR）用于检测细胞中基因表达水平、RNA病毒量以及直接克隆特定基因的cDXA5、荧光定量PCR用于对PCR产物实时监控 6、cDNA末端快速扩增技术 7、检测基因的表达 8、医学应用：检测细菌、病毒类疾病；诊断遗传疾病；诊断肿瘤

6、；应用于法医物证学。五、关于RT-PCR4月17 0,在北京检验检疫局承担的国家质检总局科技计划项U “禽流感 病WH7X9亚型双重荧光RT-PCR定型技术研究”鉴定会上，专家组一致认为：该 项U创新性地实现了对禽流感病毒H7N9亚型的一步快速定型，可在一次检测中 确认样品中是否存在H7N9亚型禽流感病毒或其他H7亚型和N9亚型的禽流感病 毒;在通用性、特异性、灵敏性上，技术优势突出。专家组同意项日成果通过鉴 定，并建议在进一步扩大和完善动物临床验证实验基础上，尽快推广应用。RT-PCR 为反转录 RCR (reverse transcription PCR)和实时 PCR (real tim

7、ePCR)共同的缩写。逆转录PCR,或者称反转录PCR(reverse transcription-PCR,RT-PCR),是聚合酶链式反应(PCR)的一种广泛应用的变形。在RT-PCR中，一条RNA链被逆转录成为互补DNA,再以此为模板通过PCR进行DNA扩增。RT-PCR技术灵敬而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平，细胞中RNA病毒的含量 和直接克隆特定基因的cDNA序列。作为模板的RXA可以是总RNA、mRNA或体外 转录的RXA产物。无论使用何种RNA,关键是确保RNA中无RNA酶和基因组DNA 的污染。利用RT-PCR技术，也许在不久的将来，H79的快速诊断将成为一个非常容易的

8、问题。中心小学四年级美术教学计划总体思路浙美版四年级下册美术教科书的编写，以国家一系列有关教育改革的文件, 特别是教育部基础教育课程改革纲要(试行)为指针,以教育部制定并颁发 的义务教育美术课程标准为主要依据，打破过去以美术学科知识、技能为主 要目标的教材体系结构，构建以促成美术素养的形成为核心，以探究性美术实践 活动为主线，以突岀美术教育视觉性、实践性、人文性、愉悦性的单元结构为基 收集于网络.如有g权请联系管理员删除本特征的美术教材新体系。本教材的编写注重学生审美感受和视觉经验的培养，强调学生创新意识和实 践能力的协调发展，以接近社会,贴近学生,学以致用为原则，选择符合四 年级小学生身心特

9、点的教学内容设计课题。全册共有19课分为10个隐性单元” 内容涵盖造型表现、 设计应用、 欣赏评述、综合探索4个 学习领域，其中造型表现及“设计，应用占有较大比重，欣赏评述 大多随堂教学，因而均分配在各课之中。本册单元和课节教学内容中，技能方面是按照由浅人深、循序渐进的原则排 列的，但是也有并列的内容。因此教师在安扫E教学时，课序可根据季节、学校及 学生的实际情况而作一定的调整。课时数只是一种建议,教师在教学时亦可根据 学生的实际水平和教学条件作适当调整。二教学方法了解了本册教材教学内容安排的总体思路，接下来最要紧的就是如何教学。 那么如何以新课倉1念指导本册教学?编者认为在教学中必须注意以下

10、几个方 面：1 .注重审美能力的培养。在教学中,应创造条件,多给学生感悟优秀美术作品的机会,引导学生展开 想象，进行比较。例如在上第9课奇妙的点彩时，先让学生先欣赏点彩名家 作品。教师不要急于用简单的讲解代替学生对点彩作品的观察、理解、感悟,而 应当让学生对艺术家如何通过奇妙的点彩方法描绘景物进行t匕较、讨论，从而引 导他们感受艺术表现的美，了解点彩画法的不同表现形式及其美感，并让他们多 谈谈自己的感受，努力提高审美情趣。2 .重视创新精神和实践能力的培养。学生创新思维苗子一定是在让其不断地探索和实践中成长和发展起来的。因 此，激发学生的创新精神和培养学生的实践能力是紧密联系的。那么,应该如何做呢？首先，要帮助学生获得亲身体验,形成喜爰质疑、乐于探究、努力求知的心 理倾向,激发创新的欲望。例如第5课时钟造型设计应抓住”时钟造型设计 除了新颖、