维拉帕米对三磷酸肌醇引起的大鼠肝细胞钙释放激活的钙电流的影响

1、    维拉帕米对三磷酸肌醇引起的大鼠肝细胞钙释放激活的钙电流的影响         摘要 目的：观察维拉帕米（verapamil,VP)对三磷酸肌醇（IP3)引起的大鼠肝 细胞钙释放激活的钙电流（ICRAC）的影响。方法：采用标准全 细胞膜片钳技术。结果：IP3激活的ICRAC的峰电流为（-0.26±0.08)nA(n=7); 5 mol/L维拉帕米对ICRAC的抑制率为30.9%±7.8%(从-0.25±0.10nA到- 0.17±

2、0.05nA,n=5,P<0.01)。结果：维拉帕米能有效抑制IP3 引起的ICRAC。关键词：钙通道；维拉帕米；膜片钳；肝脏中分类号：R333，4文献标识码：A文章编号：1000-6834(2000)03-0265-03EFFECTS OF VERAPAMIL ON CALCIUM RELEASE-ACTIVATED CALCIUM CURRENTS CAUSED BY 1,4,5-TRIPHOSPHATE IN RAT HEPATOCYTESCUI Hong1, CUI Gui-ying2, LIU Dong-ju1, TENG Rui-feng3, HAO Li-ying4, LI

3、 Jin-ming4(1.First department of general surgery, First clinical college； 2.Department of physiology；3.Department of general surgery, Third clinical college； 4.Department of pharmacology, China Medical University, Shenyang 110001)ABSTRACTAim and Methods:Whole-cell patch clamp techniue was employed t

4、o investiga te the influence of verapamil on calcium release-activated calcium currents(I CRAC) caused by 1,4,5-triphosphate (IP3) in rat hepatocytes. Result s: The peak amplitude of IP3-activated ICRAC was -0.26±0.08 nA( n=7); The inhibitory rate of 5 mol/L verapamil on ICRAC was 30.9±7.

5、8%(from -0.25±0.10 nA to -0. 17±0.05 nA, n=5, P<0.01). Conclusio n: The results showed that ICRAC was a calcium current activated by depletion of intracellular calcium stores caused by IP3. Verapamil could prote ct hepatocytes from calcium overload via the inhibition of ICRAC.KEY WORDS:

6、 calcium channel; verapamil; patch-cl amp;liver肝移植的关键是肝脏的保存，但低温、缺血、缺氧引起的细胞内钙超载导致细胞损伤和死亡 。钙拮抗剂能通过抑制肝细胞钙超载而保护细胞1。大鼠肝细胞由于缺乏电压依赖性钙电流，钙内流主要依靠受体调控的钙电流，即钙释放激活的钙电流(ICRAC) 2。1，4，5-三磷酸肌醇(IP3)是一种细胞内第二信使，它引起细胞内钙池释放钙离 子。通过钙释放激活的钙通道的钙跨膜内流在小脑浦氏细胞证明与磷酸苷的转化有关 3，但IP3在大鼠肝细胞钙内流的激活中的作用尚不清楚。本文旨在探讨 IP3对大 鼠肝细胞 ICRAC的激活的作用及

7、维拉帕米对ICRAC的影响。1材料与方法1.1溶液及药品Hanks液(mmol/L)：NaCl 137，KCl 54，CaCl2 10，MgCl2 10，NaH2PO4 05，Na2HPO4058，NaHCO3 416，glucose 55。去除Ca2+和 Mg 2+制成无钙镁Hanks液。KB液(mmol/L)：glutamic acid 70，taurine l5，KCl 130，KH 2PO4 10，HEPES 10，MgCl2 05，glucose 11，EGTA 0.5。细胞外液(mmol/L)：NaC l 140，KCl 28，Cal2 10,MgCl2 05，glucose 11

8、，HEPES 10。细胞内液(mmol/L): P otassium-Glutamate 145,NaCl 8,MgCl2 1，Mg-ATP 0.5，IP3 0.01,HEPES 10。以上 液体均调至pH72。维拉帕米(北京天丰制药厂)，IP3(Sigma)。12大鼠肝细胞的分离4雄性 Wistar大鼠(175±25)g(中国医科大学实验动物中心提供)。用乙醚吸入和苯巴比妥钠3 0 mg/kg腹腔注射麻醉。门静脉插管，切断肝上、肝下下腔静脉，切取肝脏置于4保存液中 。分三步灌流鼠肝，先用充氧的Hanks液于37灌流45 min，然后用无钙镁含胶原酶( 0.5 g/L)的Hanks液

9、灌流1015 min,最后用无钙镁Hanks液灌洗1 min并迅速置入4 KB 液中，机械剥离肝被膜，搅打、分散，用105 m的筛网过滤，制成的肝细胞放在DMEM(Dulb eccos modified Eagle medium)于4冰箱中备用。13ICRAC的记录将适量细胞加入体积约15 ml平放于倒置显微镜上的细胞池中，静置10 min细胞贴壁后， 用细胞外液灌流，流速约25 mlmin。电极分两步拉制,电阻35 M，采用全细胞高阻抗封接技术。应用PCLAMP551程序(Axon Instrument，美国)通过AD/DA转换板(Digiata1 200，美国)支持Axopatch、1 D

10、(Axon Instrument，美国)进行刺激发放和信号采集，并存 储于IBM兼容机硬盘中。记录ICRAC时，保持电位在0 mV，指令电位-10080 mV，去 极化实验脉冲持续20 ms。14数据处理2结果在钳制电位0 mV，指令电位-10080 mV，去极化实验脉冲持续200 ms的条件下记录到I CRAC(1)。从I-V(电流-电压)关系曲线可见ICRAC的反转电位为10 mV左右。 在-100 mV时，ICRAC内向电流最大，约为(-026±008)nA,n=7)。在指令电位 -100 mV时，5 mol/L维拉帕米降低ICRAC309%±78(从-025

11、7;010 nA至-0 17±005 nA，P001，n=5)(2为其中一例)。     Fig.1 A:Ca2+ release-act ivated Ca2+ curents (ICRAC) in isolated rat hepatocytes induced by i nositol 1, 4, 5-triphosphate (IP3) 10 mol/L in the internal solution. B: Cu rrent-vol-tage (I-V) relationship of ICRAC. (Voltage ramps w

12、ere of 200 ms duration from holding potential 0 mV and applied every 5 s, covering a range o f -100 to +80 mV) 3讨论ICRAC的激活是细胞内钙库耗竭的结果，任何能引起细胞内钙库耗竭的因素均能 引起ICRAC的产生5。本组应用钙络合剂耗竭细胞内钙显著激活ICRA C，且研究表明三种钙通道阻滞剂维拉帕米、硝苯地平、地尔硫卓均显著抑制ICRAC ，其中维拉帕米作用最显著6。文献报道IP3激活小脑浦氏细胞的ICRA C，但它对肥大细胞ICRAC的激活无效。本文结果表明IP3能激活大鼠肝细胞的

13、I CRAC且维拉帕米显著抑制IP3激活的ICRAC。提示生理状态下钙通道阻滞剂可能 是通过抑制ICRAC使细胞内钙减少而具有肝细胞保护作用。     Fig.2 Effects of verapamil 5 mol/L on ICRAC induced by IP3CRAC obtained from records of A and B.()control, ()ve-rapamil.(*P <0.01, vs control) 细胞内钙库耗竭产生ICRAC的机制，目前认为是钙库耗竭产生的信号诱导I CR AC的激活，但这个信号迄今尚未证实。有

14、三种机制值得考虑：(1)细胞器跨膜蛋白与胞浆 钙通道的直接偶联；(2)通过酶反应的同族机制如细胞器酶引起的胞浆膜通道磷酸化或脱磷 酸化；(3)细胞器内一个未知的信号转导链产生的未知的信号分子的间接激活7。 第二种机制认为内储钙池激活时，有某种可溶性信使物质从钙池释放或合成后释放入胞浆， 再将信号传至质膜。直至目前己相继提出了十余种小分子物质起着信使的作用，如钙内流因 子(CIF)，酪氨酸激酶，cGMP,cAMP,IP3，IP4等，但至今无一被认可。本实验的结果可 以证实IP3可能作为一个信使在起作用。基金项目：国家自然科学基金资助课题（39400138）作者简介：崔宏（1963），男，辽宁省昌

15、县，讲师，博士，从事肝脏移植研究。崔宏(中国医科大学第一临床学院普外一科)崔桂英(生理教研室)刘东举(中国医科大学第一临床学院普外一科)滕瑞峰(第三临床学院普外科)郝丽英(药理教研室，沈阳10001)李金鸣(药理教研室，沈阳10001)参考文献1 Sippel H, Stauffert I, Estler G J. Protective effect of various calcium antagonists against an experimentally induced calcium overload in isola ted hepatocytesJ.Biochem Pharmac

16、ol, 1993,46(11):1937-1944.2 Hughes B P,Barritt G J. Inhibition of the liver cell receptor -activated Ca2+ inflow system by metal ion inhibitors of voltage operated Ca2+ channels but not by other inhibitors of Ca2+ inflowJ. Biochim Biophy s Acta, 1989,1013(3):197-205.3 Miyuki K,Nobuaki Mm,Katsuhiko M

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