细胞培养准备工作

1、一：细胞培养实验室的设备 :1. 仪器 :(1) 倒置相差显微镜(2) CO2 培养箱(3) 电热干燥箱(4) 水纯化装置(5) 冰箱:普通冰箱(培养液，生理盐水，Hank'液,短期保存的组织标本)和-20C冰箱(保持生物活性及较长时 间存放的制剂如酶 ,血清等 )(6) 液氮容器 :储存细胞(7) 离心机 (4000rpm，1000rpm 即可及天平(8) 高压蒸气消毒气(9) 滤器:Zeiss滤器，玻璃滤器，微孔滤器等。(一次性滤器：12.00X 10)(10) 消毒培养液，(11) 血清(12) 消化用胰酶等。2培养用器皿 ：(1) 培养瓶：250ml, 100ml (4.50

2、X 20) ,25ml (3.50 X 10)(2) 培养皿：10cm,9cm (3.50X 10) ,6cm (2.50X 10) ,3.5cm(3) 多孔培养板：96 孔(16.50X 1), 24 孔(16.50X 3), 12 孔，6 孔，4 孔(4) 玻璃瓶： 1000ml,500ml,250ml,100ml,50ml,25ml,5ml(5) 吸管：刻度吸管(吸取，转移液体：1ml,2ml, 5ml,10ml)(3.00X 1 0)直头吸管 (吸取，转移 液体) 弯头尖吸管 (吹打，混匀，传代细胞)( 6 ) 加样器：微量加样器用于吸取，移动液体，滴加样品( 7) 其他用品：铝饭盒，

3、橡皮吸头，胶塞，注射器，烧杯，量筒，漏斗3器械：( 1 ) 手术刀( 2) 手术剪， 眼科剪( 18.50)( 3 ) 血管钳 ( 4) 眼科镊( 8.50)，小弯头镊( 5 ) 钟表镊二培养用品的清洗和消毒灭菌：1 各种类型毛刷 ,橡胶手套，消毒所用包装(牛皮纸，棉布，棉线等)2 洗衣粉，洗涤剂3 5稀盐酸 浸泡中和碱性物质4.清洁液(次强液：重铬酸钾120g，浓硫酸200ml，蒸馏水1000ml)需陶瓷或塑料器皿 5 消毒剂： 75酒精 或 0。 1新洁尔灭消毒皮肤， 无水乙醇 (用于酒精灯)6. 抗菌素： 青霉素，链霉素三：培养用液：1 .平衡盐溶液：D-HANKS 液(g/l )PH试

4、纸Nacl 8.00, kcl 0.40, Na2HPO4.H20 0.06, KH2PO4 0.06,NaHCO3 0.35,酚红 0.022. 合成培养基： M199 培养基或 DMEM 培养基( Gibico 公司 一袋 1000ml65.00,Hepes 25g120.00)DMEM 一袋，Hepes 3.57g,NaHCO3 2.2g,三蒸水 1000ml，青霉素 100u/ml,链霉素 100ug/ml ph=7.27.43. FBS胎牛血清(原代培养 20%传代培养10%) (100ml 200.00)四：组织块的分离方法：1. 剪切分离法：组织块在0.5mm22mm2内，大小影

5、响不大(可调整翻瓶时间以保证组织块贴壁)，关键在于组织块边缘整齐，光滑，要求取材迅速，动作轻柔，剥除外膜时用力适中避免机械损伤，将镊子夹过 处剪去，血管纵向剖开后平铺于平皿上，手术刀片无菌，洁净，锋利，垂直下刀，力求一次切断，不要 离开培养液操作，保持边缘湿润。2 消化分离法：探1)胰蛋白酶法：(25g 210.00)(2)胶原酶法：五：原代培养方法：1. 贴块法：在培养皿内将组织块剪成 1mm3左右的小块，剪时可滴加 12培养液，以保持湿润。将剪切好 的小块用吸管吸入培养瓶中，均匀摆置，每小块间距0.5cm左右。轻轻翻转培养瓶，使组织块朝上，向瓶内注入少许培养液，盖好瓶盖，将培养瓶倾斜放置在

6、37度培养箱内。6小时后轻轻翻转培养瓶，静置培养。若组织块不易贴壁， 可预先在瓶壁涂薄层血清，胎汁。(10%胎牛血清，10%胎儿血清，0。03% L-谷氨酰氨。110mg/l丙酮酸钠，100U/ml青霉素，100ug/ml链霉素)贴块法具有获得平滑肌细胞纯度高，量多，操作简便的优点。但用贴块法易使平滑肌细胞胞质内肌丝丧失，亚细胞器增加。2. 酶解法：组织块剪成 12mm3,转入新鲜配置的0。2%1型或W型胶原酶消化液中，37C恒温摇床25r/min )消化，消化液混浊，尚存有较小组织块时，将消化液移入离心管内，收集细胞并用培养液轻轻吹打混匀。细胞计数(0。1 %台盼蓝)，50ml培养瓶接种约8

7、X 105活细胞。(沿动脉纵轴切开后，刮除内皮细胞撕下中膜的内2/3,注意不要混入内皮细胞，将组织块切成1-2mm2,放入加有3mg/ml胶原酶的无血清 M199培养基中，37C, 0.51.5h。离心去上清，重复上述消化步骤， 然后再离心(9000r,4min )，收集细胞，在 5%10%同种血清或胎牛血清的 M199培养基中调整细胞数， 然后转入3090mm培养皿中培养)酶解离法，由于酶的作用使细胞间失去连接，细胞内肌丝含量丰富，保持收缩型状态。3. 贴块+酶解法：对未消化完全的组织块采用贴块法接种瓶壁，先置培养箱2h使组织块干固，然后补加 培养液，37 C静置培养，3d后换液。4. 注意

8、： 种植组织块的数目，如 75cm2的长颈瓶组织块不得少于30个； 根据培养细胞的种属加入适量的不同血清，一般可加入牛血清，若小牛血清增殖效果差，应加胎牛血清(FBS),通常浓度为 10%20%六：传代培养：原代培养35d,需换液一次，去除飘浮的组织块和残留的血细胞。然后隔天换液。当内皮细胞长成单层，平滑肌细胞出现峰谷样特点时可传代。消化法传代。加入0.125%胰蛋白酶1ml，轻轻转动培养瓶，使胰酶充分接触细胞后去除大部分液体，镜下观察，35min后，细胞呈收缩状，弃尽消化液，DMEM培养液洗两遍，加10% FCS DMEM培养液，用弯头吸管轻轻均匀吹打细胞，使细胞自瓶壁脱落，镜 下观察细胞计

9、数，按 1 : 23比例传代。七：细胞系的维持：八：培养细胞的纯化：九：细胞冻存与复苏：十：培养细胞生长状况的观察：1. 肉眼观察培养液：颜色，透明度2. 相差显微镜下观察： 相差显微镜与倒置显微镜的区别光学倒置显微镜下观察：原代平滑肌细胞形状多样，一般常为梭形、带形、三角形或星形。贴块法培养，细胞可于2周后长成单层；而酶解离只需67天，镜下可见明显“峰-谷”样生长。透射电子显微镜下观察：贴块法，细胞多为合成型，肌丝减少，胞体缩小，细胞胞质内粗面内质网、游离核糖体、线粒体等亚细胞器逐渐增多。消化法，细胞初期表现为收缩型，细胞内核位于中心，胞质内含丰富的肌丝及致密度体。亚细胞器少，且位于细胞边缘

10、处，基底膜最初未见，后来逐渐形成。传代后，细胞逐渐转为合成型，胞体增大且变扁平，核增大，核小体数目增加，亚细胞器也增加，肌丝开始减少，占胞内35.4% 11.5%,甚至更少。在生化性质方面，收缩型细胞比合成型细胞的3 -极密度脂蛋白（B -VLDL）对其受体结合能力强，低密度脂蛋白（LDL）分解降低，即脂质容易在胞质沉着。此外，像基底膜中的肝素样物质、胆固醇代谢等也有改变。合成型细胞内色素 C氧化还原酶成倍增加，酸性磷酸酶亦呈34倍增加，说明这两类细胞不仅在形态学上，在生化、生理反应方面也发生了较大改变。3. 细胞生长状况的观察：细胞计数：计数板4. 细胞活力的检测方法：四唑盐（MTT ）比色试验(1):0.125%胰蛋白酶消化(2):力口 10% F