泛素化蛋白检测方法

1、泛素化蛋白检测方法蛋白质泛素化简介蛋白质泛素化修饰过程在人体免疫系统调节过程中起到了关键性的作用. 与 磷酸化修饰过程一样,泛素化修饰过程也是一种可逆的共价修饰过程, 它能够调 节被修饰蛋白的稳定性、功能活性状态以及细胞内定位等情况.泛素蛋白是一个由76个氨基酸残基组成的非常保守的多肽,它能在E1、E2、 E3酶等一系列酶促反响催化下与细胞内靶蛋白上的一个或多个赖氨酸残基发生 共价连接.泛素蛋白本身也含有7个赖氨酸残基,因此它们之间也可以通过这些 位点互相连接,形成多泛素蛋白链polyubiquitin chain.目前研究显示,如 果多泛素蛋白链与被修饰蛋白上的第 48位赖氨酸残基相连,会介

2、导靶蛋白进入 蛋白酶体而被降解；如果与被修饰蛋白上其它位点,比方第63位赖氨酸残基相连,那么靶蛋白可以发挥信号通路功能而不会被降解.与磷酸化修饰途径一样,泛素化修饰途径也是可逆的,即可以通过去泛素化 酶DUB将泛素蛋白修饰物去除掉.靶蛋白经泛素化途径修饰之后,连接在靶 蛋白上的泛素蛋白单体或多聚体可以被各种泛素蛋白结合结构域UBD所识别和结合.人类蛋白质组中含有两种 E1酶、50种E2酶、600种E3酶、90种DUB 酶和20种UBD这说明泛素修饰途径在细胞调才$中起到了多么重要的作用.E3酶是泛素修饰途径中决定底物特异性的关键酶,它可以分为两大类,即含有HECT 结构域的E3酶和其它含有RI

3、NG结构域或RING样结构域比方U-box或PH印 构域的E3酶.这两种E3酶都在免疫调控过程中起到了关键性的作用.蛋白质泛素化的检测方法研究蛋白质的泛素化首先需要明确的三个根本点：哪些蛋白发生了泛素化； 发生了泛素化的蛋白质,具体是哪个位点的赖氨酸残基发生了泛素化；进行定量.明确了上述几点后,进一步需要弄清楚的是,我们感兴趣的泛素化蛋白,是 如何发生泛素化的,影响这一泛素化过程的关键分子是什么？或者说这一过程中 的E3酶是什么？然后需要研究的是,这一蛋白质发生泛素化之后可以产生那些分子效应？对下游的信号通路有什么影响？研究上述内容的实验方法和实验流程：方法一： western blot an

4、d strip通过WB佥测所有发生泛素化的蛋白条带,拍照后,将膜 strip o然后与特 定蛋白的抗体和特定泛素化位点的抗体反响,显色拍照.通过阳性条带的 比照来初步判断某一特定蛋白的特定位点发生了泛素化.【具体实验流程附后】方法二： western blot and immunoprecipitations通过免疫共沉淀方法将某一特定蛋白以及与其结合的蛋白别离出来.别离 出来的蛋白再进行SDSt泳和western blot分析.【具体实验流程附后】. 这一方法可以明确具体哪个蛋白的哪个赖氨酸残基发生了泛素化修饰.方法三：in vitro ubiquitination assay将要研究的目的

5、基因转染293细胞,使其大量表达.24h后提取并别离目的 蛋白.在体外反响buffer中将我们要研究的蛋白A 被泛素化的那个蛋白 与 UBE1 UbeH13-Uev 1 a heterodimer complex , HA-ubiquitin 以及我 们要研究的蛋白B 引起蛋白A泛素化的蛋白,共同进行孵育.将孵育后 的产物进行IP和W盼析.【具体实验流程附后】.这一方法可以明确引起 哪个蛋白是引起某蛋白发生泛素化修饰的E3连接酶.方法四：in vitro ubiquitin-binding assay将我们要研究的蛋白被泛素化的蛋白基因转染293细胞,大量表达后提纯.或者直接提取内源性蛋白.在

6、体外与 K63- or K48-linked ubiquitin chain petides孵育,然后通过SDS电泳并用泛素化抗体进行检测.这一方 法可以明确要研究的蛋白哪个赖氨酸残基容易发生泛素化.方法一：WB strip实验流程提取组织/细胞的总蛋白口使用总泛素化抗体检测所有发生了泛素化的蛋白此时可以观察到发生了泛素化的蛋白主要分布在哪些分子量区间用特定蛋白的抗体与膜反响显色用Ub K63抗体与膜反响显色Merge如果总的泛素化蛋白的条带,与特定蛋白的条带,以 及K63位点泛素化条带发生了重合,此时可以初步推测,特定蛋白的第 63位赖氨酸残基发生了泛素化方法二： Western blot and immunoprecipitations提取组织/细胞总蛋白用琼脂糖珠或磁珠包被的特异蛋白抗体,将与该蛋白结合的所有蛋白别离出来口SDS电泳JJ用泛素化抗体进行反响Stripping the口用特异抗体进行反响方法三：in vitro ubiquitination assay将要研究的蛋白基因转染293细胞使其大量表达提取蛋白,通过免疫共沉淀方法别离目的蛋白将可能发生相互作用的两种蛋白与UB