基因工程步骤

1、一、学习目标一、学习目标 简述基因工程原理及基本操作过程简述基因工程原理及基本操作过程二、学习重点和难点二、学习重点和难点1 1、基因工程基本操作程序的四个步骤（重点）、基因工程基本操作程序的四个步骤（重点）2 2、从基因文库中获取目的基因（难点）、从基因文库中获取目的基因（难点）3 3、利用、利用PCRPCR技术扩增目的基因（难点）技术扩增目的基因（难点） 1.21.2基因工程的基本操作程基因工程的基本操作程序序启动子启动子终止子终止子非编码区非编码区非编码区非编码区编码区编码区与与RNARNA聚合酶聚合酶结合位点结合位点外显子外显子内含子内含子1 12 23 34 45 5转转 录录mRN

2、AmRNA前体前体成熟成熟mRNAmRNA加加 工工切除内含子转录部分切除内含子转录部分原核细胞的基因结构原核细胞的基因结构非编码区非编码区非编码区非编码区编码区编码区编码区上游编码区上游 编码区下游编码区下游 与与RNARNA聚合酶结合位点聚合酶结合位点启动子启动子终止子终止子能转录相应的信使能转录相应的信使RNARNA，能编码蛋白质，能编码蛋白质基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序目的基因的获取基因表达载体的构建将目的基因导入受体细胞目的基因的检测与鉴定一、目的基因的获取一、目的基因的获取 用用3 3分钟阅读分钟阅读P8-11P8-11，并思考下列问题，然后用，并思考下列问题，然后

3、用2 2分钟与同桌交流、讨论。分钟与同桌交流、讨论。1 1、获取目的基因的常用方法有哪些、获取目的基因的常用方法有哪些? ?2 2、何谓基因文库？其类型有哪几种？、何谓基因文库？其类型有哪几种？3 3、如何构建基因文库？、如何构建基因文库？4 4、何谓、何谓PCRPCR技术？其原理、条件和过程是怎样的？技术？其原理、条件和过程是怎样的？一、目的基因的获取一、目的基因的获取3 3、基因文库、基因文库 又称又称DNADNA文库，将含有某种生物不同基因的许多文库，将含有某种生物不同基因的许多DNADNA片段，片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的导入受体菌的群体中储存，各个受体菌

4、分别含有这种生物的不同的基因，所有受体菌的集合即为该生物的基因文库。不同的基因，所有受体菌的集合即为该生物的基因文库。基因文库由基因文库由外源外源DNADNA片段、载体片段、载体和和宿主宿主组成。组成。按外源按外源DNADNA片段的来源分基因文库分为：片段的来源分基因文库分为：基因组基因组DNADNA文库：包含了某物种的所有的基因文库：包含了某物种的所有的基因部分基因文库：只包含了部分基因文库（如部分基因文库：只包含了部分基因文库（如cDNAcDNA文库）文库）1 1）载体）载体DNADNA片段的制备片段的制备 DNADNA分离纯化分离纯化限制酶切限制酶切2 2）供体）供体DNADNA片段的制

5、备片段的制备总总DNADNA分离纯化分离纯化酶切法酶切法分离特定大小分离特定大小DNADNA片段片段3 3）载体与基因组）载体与基因组DNADNA片段的连接片段的连接4 4）重组）重组DNADNA转化受体细胞转化受体细胞4.4.基因文库的构建基因文库的构建基因组文库的构建基因组文库的构建通过对受体菌通过对受体菌的培养而储存的培养而储存基因基因 cDNAcDNA文库的构建文库的构建 （反转录法）反转录法） 目的基因的目的基因的mRNAmRNA单链单链DNADNA反转录酶反转录酶DNADNA聚合酶聚合酶双链双链DNA(DNA(目的基因目的基因) )接到载体接到载体小小大大无无有有无无有有某种生物的

6、部分基因某种生物的部分基因 某种生物的全部基因某种生物的全部基因可以可以部分基因可以部分基因可以思考：思考：怎样从基因文库中得到我们所需的目的基怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因？因？ 根据基因的有关信息如根据基因的有关信息如根据基因的转录根据基因的转录产物产物mRNAmRNA、基因的核苷酸序列、基因翻译产、基因的核苷酸序列、基因翻译产物蛋白质物蛋白质等来获取目的基因。等来获取目的基因。2 2、利用、利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因PCRPCR 概念概念：PCRPCR全称为全称为_，是一项在生物，是一项在生物_复制复制_的核酸合成技术的核酸合成技术 条件：条件：_ _ _、

7、 _ _ 、 _原理：原理：_方式：方式：以以_方式扩增，即方式扩增，即_（n n为扩增循环的次数）为扩增循环的次数）结果：结果：聚合酶链式反应聚合酶链式反应体外体外特定特定DNADNA片段片段DNADNA双链复制双链复制已知基因的核苷酸序列已知基因的核苷酸序列( (前提条件前提条件) )四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸成对引物成对引物DNADNA聚合酶聚合酶(Taq(Taq酶）酶）指数指数2 2n n使目的基因的片段在短时间内成百万使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增倍地扩增过程：过程：a a、DNADNA变性（变性（90-9590-95）：双链）：双链DNADNA模板模板 在热作用下，在热

8、作用下，_断裂，形成断裂，形成_b b、退火（、退火（复性复性55-6555-65）：系统温度降低，引物）：系统温度降低，引物与与DNADNA模板结合，形成局部模板结合，形成局部_。 c c、延伸（、延伸（70-7570-75）：在）：在TaqTaq酶的作用下，酶的作用下，合成与模板互补的合成与模板互补的_。 氢键氢键单链单链DNADNA双链双链DNADNA链链PCRPCR的基本反应步骤的基本反应步骤变性变性90-9590-95C C延伸延伸70-7570-75C C退火退火55-6055-60C CPCRPCR总结：总结： 基因比较小基因比较小, ,已知核苷酸序列，直接利已知核苷酸序列，直接

9、利用用DNADNA合成仪用化学方法合成，不需要模板。合成仪用化学方法合成，不需要模板。从基因文库中获取从基因文库中获取利用利用PCRPCR技术扩增技术扩增利用化学方法人工合成利用化学方法人工合成归纳：获取目的基因的方法归纳：获取目的基因的方法二、基因表达载体的构建二、基因表达载体的构建 核心核心质粒质粒DNADNA分子分子一个切口一个切口两个黏性末端两个黏性末端两个切口两个切口获得目的基因获得目的基因DNA DNA 连接酶连接酶重组重组DNADNA分子（重组质粒）分子（重组质粒）同一种同一种 限制酶限制酶1 1、基因表达载体的构建方法、基因表达载体的构建方法2.2.基因表达载体的目的基因表达载

10、体的目的（1 1）使目的基因在受体细胞中稳定存在）使目的基因在受体细胞中稳定存在并可以遗传给下一代并可以遗传给下一代（2 2）使目的基因能够表达和发挥作用。）使目的基因能够表达和发挥作用。b b、思考：它们有什么作用？ 表达载体为什么一定要有启动子？表达载体为什么一定要有启动子？（1 1）生物之间进行基因交流，只有使）生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动子才能有用受体生物自身基因的启动子才能有利于基因的表达。利于基因的表达。（2 2）通过）通过cDNAcDNA文库获得的目的基因没文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体细有启动子，只将编码序列导入受体细胞无法转录。胞无

11、法转录。终止子的作用是什么？终止子的作用是什么？ 终止子是位于基因尾端的一段特终止子是位于基因尾端的一段特殊的殊的DNADNA片断，能终止片断，能终止mRNAmRNA的转录。的转录。 是为了鉴别受体细胞中是否含有目是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来。出来。标记基因有什么作用？标记基因有什么作用？三、将目的基因导入受体细胞三、将目的基因导入受体细胞2 2、方法、方法将目的基因导入将目的基因导入植物细胞植物细胞将目的基因导入将目的基因导入动物细胞动物细胞将目的基因导入将目的基因导入微生物细胞微生物细胞农杆菌转化法农杆菌转化法基因枪

12、法基因枪法花粉管通道法花粉管通道法显微注射法显微注射法感受态细胞感受态细胞（1）农杆菌转化法特点：特点： 易感染双子叶植物和裸子植物，易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能对大多数单子叶植物没有感染能力力原理：原理： TiTi质粒上的质粒上的T-DNAT-DNA可以转移到受体细胞，并整可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的合到受体细胞染色体的DNADNA上。上。转化过程:TiTi质粒质粒目的基因目的基因构建表达载体导入植物细胞插入植物细胞染色DNA表达新性状转入农杆菌 基因枪法又称微弹轰击基因枪法又称微弹轰击法，是法，是利用压缩气体产利用压缩气体产生的动力生的动力，将包

13、裹在金，将包裹在金属颗粒表面的表达载体属颗粒表面的表达载体DNADNA打入受体细胞中打入受体细胞中，使目的基因与其整合并使目的基因与其整合并表达的方法。表达的方法。（2）基因枪法（3）花粉通道法 植物花粉在柱头上萌植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。花粉管通道法直通胚囊。花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，滴加剪去柱头，然后，滴加DNADNA（含目的基因），使目的（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道进入基因借助花粉管通道进入受体细胞。受体细胞。胚珠花药花丝柱头花柱子房壁子

14、房雄蕊雌蕊2 2、将目的基因导入动物细胞、将目的基因导入动物细胞目的基因表达载体提纯目的基因表达载体提纯 取卵（受精卵）取卵（受精卵） 显微注射显微注射 受精卵受精卵 新性状动物新性状动物微生物作受体细胞原因：微生物作受体细胞原因：繁殖快、多为单细胞、繁殖快、多为单细胞、 遗传物质相对少遗传物质相对少过程：过程：CaCa2+2+处理大处理大肠杆菌肠杆菌感受态感受态细胞细胞表达载体表达载体与感受态与感受态细胞混合细胞混合感受态感受态细胞吸细胞吸收收DNADNA3.3.将目的基因导入微生物细胞将目的基因导入微生物细胞四、目的基因的检测与鉴定四、目的基因的检测与鉴定 分子水平检测分子水平检测: :

15、是否插入目的基因是否插入目的基因 是否转录是否转录 是否翻译是否翻译 个体生物学水平鉴定个体生物学水平鉴定1 1、检测转基因生物染色体的、检测转基因生物染色体的DNADNA上是否插入上是否插入了目的基因了目的基因 首先取出转基因生物的基因组首先取出转基因生物的基因组DNADNA；（1 1）方法）方法: :DNADNA分子杂交分子杂交（2 2）过程）过程: : 将含目的基因的将含目的基因的DNADNA片段用放射性同位素等片段用放射性同位素等作标记作标记, ,以此做探针；以此做探针； 使探针和转基因生物的基因组杂交使探针和转基因生物的基因组杂交, ,若显示若显示出杂交带出杂交带, ,表明染色体已插

16、入染色体表明染色体已插入染色体DNADNA中。中。（一）检测（一）检测（二）鉴定（个体生物学水平）抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等方法:分分 子子 杂杂 交交方法: 抗原-抗体杂交（蛋白质是抗原）过程:用上述探针和转基因生物的用上述探针和转基因生物的mRNAmRNA杂交杂交, ,若出现杂交带若出现杂交带, ,表明目的基因转录出了表明目的基因转录出了mRNAmRNA。一、目的基因的获取一、目的基因的获取 用用3 3分钟阅读分钟阅读P8-11P8-11，并思考下列问题，然后用，并思考下列问题，然后用2 2分钟与同桌交流、讨论。分钟与同桌交流、讨论。1 1、获取目的基因的常用方法有哪些、获取目的基因的常用方法有哪些? ?2 2、何谓基因文库？其类型有哪几种？、何谓基因文库？其类型有哪几种？3 3、如何构建基因文库？、如何构建基因文库？4 4、何谓、何谓PCRPCR技术？其原理、条件和过程是怎样的？技术？其原理、条件和过程是怎样的？基因组文库的构建基因组文库的构建通过对受体菌通过对受体菌的培养而储存的培养而储存基因基因基因组文库的构建基因组文库的构建通过对受体菌通过对受体菌的培养而储存的培养而储存基因基因2.2.基因表达载体的目的基因表达载体的目的（1 1