抗CD3_CD28单抗对人T淋巴细胞共刺激作用的影响因素

1、抗 CD3 、CD28 单抗对人 T 淋巴细胞共刺激作用的影响因素王顺友孙雨马宝骊上海第二医科大学上海市免疫学研究所上海200025摘要 以抗 CD3 和抗 CD28 作为 T 细胞激活的第一和第二信号 , 观察二者不同浓度 , 不同作用顺序和不同作用时间对人 T淋巴细胞增殖反应的影响 。结果显示单一的抗 CD3 和抗 CD28 不能刺激 T 细胞增殖 , 只有同时或在一定时间内接受二者的 共同刺激才能促使 T 细胞增殖 。单独接受抗 CD3 24h 或抗 CD28 16h 后 , T 细胞对相应的另一信号刺激呈低反应性 , 这一现 象可能与 T 细胞耐受及自身免疫病的发生有关 。关键词 CD

2、3 ; CD28 ; T 淋巴细胞 ; 增殖 ; 共刺激Bretscher 和 Chon 于 70 年代初首次提出免疫识别的双信号理论 。对 T 细胞而言 , 传导第一信号的 受体分子 是 T 细 胞 表 面 特 异 性 抗 原 受 体 ( TCR) ,结合 , 可 阻 断 T 细 胞 的 激 活 而 治 疗 移 植 排 斥 反应7。为此 , 我们观察了第一信号和共刺激信号对T 细胞增殖的影响 。它由 TCR (或) , CD3 复 合 物()和 二 聚1 材料和方法体 (或 异二聚体) 共同构成 。TCR 作 为 接 受 第一信号的受体 , 其信息由 CD3 复合体分子向细胞内 传递 , 因

3、此 , 抗 CD3 的单克隆抗体可以模拟第一信 号 , 刺激 T 细胞产生一系列的生化反应 ( 如蛋白质 的磷酸化) , Ca2 + 浓度升高 , 磷脂分解等1 。但是 , 免疫活性细胞在接受第一信号之后一定时间内如果 不能 接 受 第 二 信 号 的 刺 激 , 则 将 产 生 低 反 应 性 ( hypo2resposibility) 或灭能 ( anergy) 。因此 , 第一信 号决定了免疫反应的特异性 , 而第二信号决定了免 疫反应的量及其时空效应2 。到目前为止 , 对第二 信号 (共刺激信号) 的认识还不完整 。在已经发现 的第二 信 号 分 子 中 , CD80 ( B721

4、) 是 最 重 要 的 一 类 。它表达于抗原提呈细胞 (APC) 表面 , 通过与 T 细胞表面受体 CD28 相互作用 , 激活接受第一信 号刺激的 T 细胞 , 使其增殖和分泌 IL223 。CD28 分 子接受 刺 激 后 , 也 能 传 递 一 种 不 依 赖 于 Ca2 + 的 , 并对免疫抑制剂环胞霉素 ( CsA) 和 FK506 有抗性 的信号4 。一般认为 , CD28 在传递 这 一 信 息 之 前需要第一信号激活的 PTK 酶对其细胞浆内 DYMNM 区域的酪氨酸磷酸化 , 磷酸化的 CD28 能激活 PI23 激酶 , 后者进一步活化 PKC, 促进转录因 子 的 活

5、111 材料 CD28 单抗腹水 ( IgG1 , 3mg/ ml) 由 美国 Bristol2Myers Squibb 药物研究所 Linsley 教授馈赠 ; CD3 单抗腹 水 ( 0175mg/ ml) 由 分 泌 CD3 单 抗 杂 交 瘤 (购自美国 ATCC 公司) 制备 。二种单抗经纯化 后用于下述实验 。112 外周血 T 细胞分离 无菌抽取正常人外周血 , 肝素抗 凝 。用 淋 巴 细 胞 分 离 液 离 心 分 离 单 个 核 细 胞 , 经尼龙毛柱吸附后 , 得到非粘附细胞为纯化 T细胞 , 经抗 CD3 、抗 CD28 、锥兰染色 , 计算纯度 、CD28 阳性率及活

6、力分别为 82 % 、79 %和 99 % 。培养于含 10 %人 AB 型血清的 RPMI1640 培养液 。113 抗 CD3 和抗 CD28 抗体的浓度对 T 细胞增殖的 影响 在 96 孔 板 内 , 每 孔 加 入 纯 化 的 T 细 胞 ( 2 ×106 / ml) 100l ,不同稀释度的抗 CD3 或抗 CD28 抗体100l ,37 ,5 %CO2 条件下继续 培 养 96h , 在 实 验 结 束前 16h 加入 1815 ×103Bq 3H2TdR ,用多头细胞收集仪收集细胞 ,液体闪烁计数仪测定放射性计数 。114 共刺激时相 96 孔板内每孔加入纯

7、化 T 细胞2 ×105 / 孔 , 抗 CD3 单 抗 100l ( 终 浓 度 为 1215g/ml) 。37 , 5 % CO2 条 件 下 , 于 不 同 时 间 ( 0 、1 、2 、4 、8 、16 、24 和 32h ) 洗 去 CD3 单 抗 , 加 入化1。抗 CD28 单抗也可模拟第二信号 CD80 。异常表达的 CD80 分子与多种自身免疫性疾病有关5 ,6 。以 CD80 分 子 或 CTLA4 Ig 分 子 代 替 CD80 , 与 CD28CD28 单抗 ( 终 浓 度 为 5g/ ml ) , 继 续 培 养 至 96h 。另一组 加 抗 CD28 单

8、抗 100l ( 终 浓 度 为 5g/ ml ) ,与上述 相 同 时 间 洗 去 抗 CD28 单 抗 , 加 CD3 单 抗(终浓度为 1215g/ ml ) , 37 , 5 %CO2 条 件 下 培 养1h 后 洗 去 抗 CD3 , 重 新 加 入 抗 CD28 , 37 , 5 % CO2 条件下继续培养至 96h , 在 收 集 细 胞 前 16h 加入 1815 ×103Bq 3 H2TdR , 收集细胞 , 液体闪烁计数 仪测定 。2结果211 不同浓度 CD3 单抗和 CD28 单抗对 T 淋巴细胞增殖的影响 在不存在 CD28 单抗时 , CD3 单抗不 能使

9、 T 淋巴细胞增殖 , 但 CD28 单抗存在时 , CD3 单抗呈浓度依赖性地促使 T 淋巴细胞增殖 , 其浓度 为 1215g/ ml 达峰值 , 加大浓度也不能使其作用增 加 (图 1) 。同样 , 在不存在 CD3 单抗时 , CD28 单 抗不能使 T 淋巴细胞增殖 , 但有 CD3 单抗存在时 , CD28 单抗浓度依赖性地促使 T 淋巴细胞增殖 , 其 浓度为 5g/ ml 达峰值 , 大 于 此 浓 度 时 , 反 而 使 其 作用降低 (图 2) 。212 CD3 单抗和 CD28 单抗刺激后不同时相对 T 淋 巴细胞增殖的影响 第一信号 ( CD3 单抗) 或第二 信号 (

10、 CD28 单抗) 刺激后 8h 内先后接受两个信号 的刺激均可使 T 细胞增殖 。T 细胞先接受 CD3 单抗 作用 8h 之后 , 其增殖作用迅速降低 ; 而 T 细胞先 接受 CD28 单抗作用后 , 增殖作用在 16h 时明显降 低 , 2436h 后基本不再对随后第一或第二信号的 刺激产生反应 (图 3) 。图 2不同浓度 CD28 单抗对人 T 淋巴细胞增殖的影响图 3第一信号 ( CD3 单抗) 和第二信号 ( CD28 单抗)刺激不同时间对 T 淋巴细胞增殖的影响3讨论本实验 结 果 显 示 , 单 一 的 刺 激 ( 抗 CD3 或 抗CD28) 在所用各种浓度下均不能使外周

11、血 T 淋巴细 胞增殖 。这与大多数报告相一致8 ,9 。在双信号刺 激下 , T 细胞才能进行有效的增殖 。第一信号 ( 抗 CD3) 在达到一定浓度后 , 再增加浓度 , 也不能增 强 T 细胞的增殖反应 ( 图 1) 。第二信号则表 现 为 双向调节 , 促使 T 细胞增殖的最佳浓度为 5g/ ml 。 高于或低于这一浓度都使其刺激 T 细胞增殖的水平 降低 (图 2) 。原理尚不清楚 , 或 许 体 内 的 第 二 信 号系统达不到这种药理浓度 , 或许是防止过度活化后细胞的反应性逐渐下降 。对于先接受抗 CD3 作用的 T 细胞 , 如果 2436h 之内不能接受第二信号的 刺激 ,

12、 则对以后的刺激产生呈明显的低反应性 ( 图1) 。先接受抗 CD28 处理的 T 细胞的增殖反应在 16h 已明显降低 , 2436h 则基本不再对第一或第二信 号的剌激产生 反 应 ( 图 3) 。Linsley 等 曾 报 道 CD28 与其配基的结合会引起 CD28 表达的降低 。PHA 或 PMA 激活的 T 细 胞 在 接 受 CD80 + CHO 细 胞 刺 激 后4h CD28 mRNA 即显著降低 , 24h 才恢复到接近正常 的水平 。细胞表面的 CD28 分子在 1224h 显著减 少 , 直到 48h 恢 复 到 正 常 水 平10 。我 们 观 察 到 的 现象可能与

13、 T 细胞 CD28 表达的降低有关 。一般认为 , T 细胞单独接受第二信号不产生反间来调控多种淋巴细胞的反应性 。参考文献Rudd CE ,Janssen O , Cai Y. Two2step TCR / CD32CD4 andCD28 signaling in T cells : SH2/ SH3 domains ,protein2tyrosine and lipid kinases. J Immunol ,1994 ;225 :234J une CH ,Bluestone JA ,Nadler LM ,et al . The B7 and CD28 re2ceptor familie

14、s. Immunol Today ,1994 ;15 :321Gimmi CD ,Freeman GJ , Gribben J G ,et al . B2cell surface anti2 gen B7 provides a costimulatory signal that induces T cells to proliferate and secrete interleukin 2 . Proc Natl Acad Sci USA ,1991 ;88 :6575Lu Y ,Phillips CA ,Bjormdahl JM ,et al . CD28 signal transduc2

15、tion :tyrosine phosphorylation and receptor association of phos2 phoinositide23 kinase correlate with Ca2 + 2independent costimu2 latory activity. Eur J Immunol ,1994 ;24 :2732Verwilghen J ,Lovis R , BoerM , et al . Expression of functionalB7 and CTLA4 on rheumatoid synovial T cells. J Immunol ,1994

16、 ;153 :1378Perrin PJ ,Scott D ,Quigley L ,et al . Role of B7 : CD28/ CTLA4 in the induction of chronic relapsing experimental allergic en2 cephalomyelitis. J Immunol ,1995 ;154 :148Lenschow DJ , Zeng Y , Thistlethwaite J R ,et al . Long2term sur2vival of xenogeneic pancreatic isolet grafts induced b

17、y CT2LA4 Ig. Science ,1992 ;257 :789Abe R , Vandenberghe P , Craighead N , et al . Distinct signal transduction in mouse CD4 + and CD8 + splenic T cells after CD28 receptor ligation. J Immunol ,1995 ;154 :985Sansom DM , Wilson A , Boshell M , et al . B7/ CD28 but notLFA23/ CD2 interactions can provi

18、dethird2partyco2stimula2tion for human T2cell activation. Immunology ,1993 ;80 :24212345应2, 但我们的结果提示 CD28 单独接受抗体结合作用后会明显影响随后对抗 CD3 + 抗 CD28 对 T 细胞的激活作用 。这一现象的生理学功能尚不清楚 。在 体内 , CD28 的配基主要存在于活化的 APC 细胞表 面 , 机体在受到外源或内源性的刺激 (如细菌或病 毒的感染 , 局部 炎 症 等) 时 可 引 起 APC 细 胞 大 量 表达 CD80 , 此时循环的无关 T 细胞可能与 CD80 相 结合

19、, 如果它们进 一 步 不 与 TCR 特 异 的 抗 原 作 用 将会引起耐受 。此时如果 T 细胞与其相应的特异性 抗原相互作用 , 则可不再依赖于辅助细胞而直接被 激活 , 形成一种多克隆激活状态 。任何一类免疫反 应的发生及强度都是由其所接受信号的类型和量所 决定的 , 这一质和量决定免疫反应对机体的作用 。 机体也有可能通过对第一信号和第二信号发生的时678910 Linsley PS ,Bradshaw J ,Urnes M ,et al . CD28 engagement by B7/ BB1 induces transient down2regulation of CD28 s

20、ynthesis and prolonged unresponsiveness to CD28 signaling. J Immunol1993 ;150 :3161(1998 年 6 月 25 日收稿 ,1998 年 11 月 18 日修回)Costimulatory Effect of Anti2CD3 andLymphocyte ProliferationAnti2CD80 on Human TWang Shunyou ,Sun Yu ,Ma Baoli ( S hanghai Institute of Immunology , S hanghai Second Medical Universi2ty , S hanghai 200025)Using anti2CD3 and anti2CD28 mimicking as the first and the second signals in T cell acti2Abstractvation ,the influences of different concentration