第十四章免疫细胞的分离与检测

1、免疫细胞的分离与检测免疫细胞的分离与检测免疫细胞的种类免疫细胞的种类l淋巴细胞：淋巴细胞：T细胞、细胞、B细胞、细胞、 NK细胞等细胞等l单核巨噬细胞单核巨噬细胞l树突状细胞树突状细胞l粒细胞粒细胞分离免疫细胞的样本来源分离免疫细胞的样本来源l外周血外周血l脾脏脾脏l淋巴结淋巴结l胸腺胸腺l骨髓骨髓分离免疫细胞的目的分离免疫细胞的目的l检测免疫细胞的数量和功能，观察机体免疫状态检测免疫细胞的数量和功能，观察机体免疫状态l免疫细胞的细胞生物学研究免疫细胞的细胞生物学研究l免疫细胞的培养和建株免疫细胞的培养和建株分离免疫细胞的一般原理分离免疫细胞的一般原理l物理学和生物学特征物理学和生物学特征l密

2、度大小密度大小l表面标志表面标志l其它活性：吞噬、黏附等其它活性：吞噬、黏附等本章主要内容本章主要内容1. 免疫细胞的分离与纯化免疫细胞的分离与纯化 第一节第一节 免疫细胞的分离与纯化免疫细胞的分离与纯化l白细胞的分离白细胞的分离 l外周血单个核细胞的分离外周血单个核细胞的分离 l淋巴细胞和单核细胞的分离与纯化淋巴细胞和单核细胞的分离与纯化l淋巴细胞亚群的分离淋巴细胞亚群的分离 l细胞活力的检测细胞活力的检测一、白细胞的分离一、白细胞的分离 细胞密度不同，沉降速度不一样。细胞密度不同，沉降速度不一样。 粒细胞粒细胞1.092, 红细胞红细胞1.093, 沉降速度不一样。沉降速度不一样。l自然沉

3、降法自然沉降法(血浆、白细胞、红细胞血浆、白细胞、红细胞)l聚合物加速沉降法：明胶、右旋糖酐、甲基纤维聚合物加速沉降法：明胶、右旋糖酐、甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等。素、聚乙烯吡咯烷酮等。 (会增加白细胞的黏性会增加白细胞的黏性)二、外周血单个核细胞的分离二、外周血单个核细胞的分离外周血细胞的密度外周血细胞的密度 血小板：血小板：1.030-1.035 淋巴细胞和单核细胞：淋巴细胞和单核细胞：1.075-1.090 粒细胞：粒细胞：1.092 红细胞：红细胞：1.093 外周血单个核细胞外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC): Mon

4、ocyte、Lymphocyte聚蔗糖（聚蔗糖（Ficoll）泛影葡胺分层液法）泛影葡胺分层液法（一）原理和方法1. 单次密度梯度分离法单次密度梯度分离法 单次密度梯度单次密度梯度 连续密度梯度连续密度梯度2. 试剂：试剂：FicollHypaqueFicoll：聚蔗糖，聚蔗糖，MW：40 000，高密度，高密度，低渗透压、无毒性，低渗透压、无毒性，6Ficoll密度为密度为1.020Hypaque：泛影葡糖胺，泛影葡糖胺，34 hypaque的密的密度为度为1.200，用于调整分离液的密度。，用于调整分离液的密度。分离人外周血单个核细胞用分离人外周血单个核细胞用1.0770.001的密的密度

5、分离液。度分离液。3. 3. 离心分离：离心分离：将细将细胞叠加在密度合适的胞叠加在密度合适的分层液分层液(1.075-1.09)(1.075-1.09) 上层，经离心后细胞上层，经离心后细胞可分为不同的区带。可分为不同的区带。4. 收集细胞收集细胞5. 洗涤、计数洗涤、计数（二）方法评价（二）方法评价l是分离PBMC最常用的方法l操作简单，不需特殊仪器设备l分离纯度高，可达95l细胞得率高，可达80三、淋巴细胞和单核细胞的分离三、淋巴细胞和单核细胞的分离（一）红细胞的去除：低渗（一）红细胞的去除：低渗0.830.83NHNH4 4ClCl处理处理（二）血小板的去除：离心洗涤；二）血小板的去除

6、：离心洗涤；FCSFCS（三）单核细胞的去除（三）单核细胞的去除 黏附去除法黏附去除法、羰基铁粉吞噬法羰基铁粉吞噬法（四）（四）Percoll离心法纯化离心法纯化淋巴细胞与单核细胞淋巴细胞与单核细胞单核细胞的去除单核细胞的去除l黏附去除法：黏附去除法：根据单核细胞具有黏附作用而根据单核细胞具有黏附作用而去除（培养；凝胶柱）去除（培养；凝胶柱）l羰基铁粉法：羰基铁粉法：单核细胞具有吞噬羰基铁粉的单核细胞具有吞噬羰基铁粉的能力（能力（Ficoll离心；磁铁）离心；磁铁）v粘附贴壁法粘附贴壁法l单核细胞贴壁生长单核细胞贴壁生长l玻璃、塑料平皿玻璃、塑料平皿/ /培养瓶、培养瓶、3737、1h1hl取

7、未贴壁细胞取未贴壁细胞-淋巴细胞（淋巴细胞（T T、B B）l刮下贴壁细胞刮下贴壁细胞-纯单核细胞纯单核细胞l缺点：缺点：B B细胞也有较弱贴壁，使细胞也有较弱贴壁，使B B细胞收率细胞收率v过柱吸附法过柱吸附法l层析过柱，单核细胞滞留于层析柱中层析过柱，单核细胞滞留于层析柱中l洗脱洗脱-淋巴细胞淋巴细胞l层析柱：玻璃纤维或葡聚糖凝胶层析柱：玻璃纤维或葡聚糖凝胶l粘附能力：粘附能力：单核细胞单核细胞淋巴细胞淋巴细胞Percoll分层液法分层液法lPercoll分层液：经聚乙烯分层液：经聚乙烯吡咯烷酮处理过的硅胶颗吡咯烷酮处理过的硅胶颗粒混悬液，对细胞无毒、粒混悬液，对细胞无毒、无刺激。无刺激。

8、lPercoll原液加原液加PBS稀释，稀释，高速离心（高速离心（21000g）连续）连续密度梯度。密度梯度。l将将PBMC加在分离加在分离液上低速离心后可液上低速离心后可分离分离PBMC中的单中的单核细胞和淋巴细胞核细胞和淋巴细胞淋巴细胞亚群的分离淋巴细胞亚群的分离 E E花环分离法花环分离法尼龙棉柱分离法尼龙棉柱分离法补体细胞毒法补体细胞毒法亲和板结合分离法亲和板结合分离法免疫磁珠分离法免疫磁珠分离法细胞分选术细胞分选术E花环分离法花环分离法T细胞细胞（CD2/LFA2/E受体）受体）绵羊红细胞绵羊红细胞SRBCE花环花环比重增加比重增加Ficoll-Hypaque 分离液分离分离液分离低

9、渗低渗 尼龙棉柱分离法尼龙棉柱分离法尼龙棉装入尼龙棉装入5ml5ml注射器中注射器中加入淋巴细胞悬液加入淋巴细胞悬液37、 5 CO2、12hRPMI 1640RPMI 1640完全培养基灌洗完全培养基灌洗洗脱液中为洗脱液中为T T细胞细胞原理原理 B B细胞可粘细胞可粘 附尼龙毛；附尼龙毛； T T细胞不具细胞不具 有粘附活性。有粘附活性。方法评价：方法评价：实验室常用分离方法之一实验室常用分离方法之一l简便、易行简便、易行l获得细胞纯度较高获得细胞纯度较高T T细胞细胞9090B B细胞细胞8080尼龙毛柱法尼龙毛柱法E E花环法，花环法，T T细胞可达细胞可达9999以上以上 （三）补体

10、细胞毒法（三）补体细胞毒法l原理：免疫细胞表面的某种原理：免疫细胞表面的某种Ag与相应与相应Ab结合，加入结合，加入补体，借助补体，借助补体介导的细胞毒补体介导的细胞毒作用，破坏作用，破坏Ag阳性的阳性的细胞，收集细胞，收集Ag阴性的细胞。阴性的细胞。l如：在如：在LC悬液中加入抗人悬液中加入抗人Ig抗体去除抗体去除B细胞，得到细胞，得到T细胞。细胞。l如：在如：在T细胞悬液中加入抗细胞悬液中加入抗CD4抗体去除抗体去除CD4+ T细细胞，得到胞，得到CD8+T细胞。细胞。亲和板分离法亲和板分离法（五）免疫磁珠法（五）免疫磁珠法 原理：原理：l将抗体交联于磁珠表面形成将抗体交联于磁珠表面形成免

11、疫磁珠免疫磁珠 （Immunomagnetic bead，IMB）l加入细胞悬液，加入细胞悬液，IMB上的上的Ab与细胞表面的与细胞表面的Ag反应，反应，形成抗体形成抗体/抗原的复合物抗原的复合物。l外加磁场，分选出结合有免疫细胞的外加磁场，分选出结合有免疫细胞的IMB 。分法：分法：l直接法直接法l间接法间接法免疫磁珠法细胞分选过程免疫磁珠法细胞分选过程免免疫疫磁磁珠珠细细胞胞分分选选装装置置特点特点:简便简便, 快速快速, 费用低费用低, 无需特殊设备无需特殊设备全自动细胞分选仪全自动细胞分选仪评价l高纯度（高纯度（9599）l高回收率（高回收率（9095）l高活性（高活性（99100）l

12、效果可与流式细胞仪媲美，效果可与流式细胞仪媲美，l但更经济、省时、简便、快速但更经济、省时、简便、快速（六）流式细胞仪分选技术（六）流式细胞仪分选技术 经典方法：经典方法：l离心离心l粘附法粘附法l补体细胞毒法补体细胞毒法l淘洗法淘洗法l免疫磁珠法免疫磁珠法 经典分离方法的局限性经典分离方法的局限性l 纯度纯度l 稀有细胞稀有细胞 ？l 高速高速l 高纯度高纯度l 高精度高精度l流式细胞仪（流式细胞仪（FCM）具有）具有高速、高速、 高纯度、高精度高纯度、高精度优势。优势。l激活细胞分类仪：用来分析、鉴定细胞的流式细胞仪。激活细胞分类仪：用来分析、鉴定细胞的流式细胞仪。lFluorescenc

13、e activated cell sorter （FACS）细胞分选细胞分选四、吞噬细胞的分离四、吞噬细胞的分离吞噬细胞种类吞噬细胞种类l大吞噬细胞：大吞噬细胞：单核单核细胞、巨噬细胞细胞、巨噬细胞l小吞噬细胞：小吞噬细胞：中性中性粒细胞粒细胞l巨噬细胞：巨噬细胞：斑蝥敷贴法、斑蝥敷贴法、腹腔渗出分离法、腹腔渗出分离法、l中性粒细胞：右旋糖酐分中性粒细胞：右旋糖酐分离法、离法、FicollHypaque分层液分离法分层液分离法吞噬细胞分离法吞噬细胞分离法斑蟊敷贴法分离人巨噬细胞斑蟊敷贴法分离人巨噬细胞腹腔渗出法分离腹腔巨噬细胞腹腔渗出法分离腹腔巨噬细胞3 34 days4 days 3ml肝素

14、抗凝全血肝素抗凝全血1/4体积体积6右旋糖酐右旋糖酐生理盐水，室温静置生理盐水，室温静置3040min，取上层取上层白细胞，白细胞，0.8NH4Cl溶解红细胞，离心，溶解红细胞，离心，取细胞沉淀用取细胞沉淀用FicollHypaque分离液分离液分分离中性粒细胞和单个核细胞。离中性粒细胞和单个核细胞。右旋糖酐法分离中性粒细胞右旋糖酐法分离中性粒细胞外周血中性粒细胞分离外周血中性粒细胞分离(Ficoll-Hypaque)五、细胞活力检测五、细胞活力检测l细胞活力：指细胞存活的数量，一般用百分表细胞活力：指细胞存活的数量，一般用百分表示。示。l通常活力应通常活力应95%l方法：苔盼蓝染色法方法：苔

15、盼蓝染色法 活细胞：不着色活细胞：不着色 死细胞：着色死细胞：着色l白细胞的分离白细胞的分离 l外周血单个核细胞的分离外周血单个核细胞的分离 l淋巴细胞和单核细胞的分离淋巴细胞和单核细胞的分离l淋巴细胞亚群分离淋巴细胞亚群分离 l吞噬细胞的分离吞噬细胞的分离小结：小结：免疫细胞的分离与纯化免疫细胞的分离与纯化第二节 淋巴细胞的数量检测微量细胞毒试验微量细胞毒试验花环技术花环技术一、一、T细胞数量检测细胞数量检测3. 微量细胞毒试验微量细胞毒试验 针对淋巴细胞针对淋巴细胞CD分子分子Ab与其相应的与其相应的CD分子结合，分子结合，借助补体依赖的细胞毒作用，可造成表达特定表面借助补体依赖的细胞毒作

16、用，可造成表达特定表面Ag的细胞损伤，破坏膜的完整性，应用伊红染料渗入细胞内的细胞损伤，破坏膜的完整性，应用伊红染料渗入细胞内，使之着染红色，而无相应，使之着染红色，而无相应CD分子的细胞则不受损伤，因分子的细胞则不受损伤，因而不着色。计数着色细胞数而不着色。计数着色细胞数,计算相应细胞的计算相应细胞的%。微量细胞毒试验微量细胞毒试验淋巴细胞淋巴细胞抗抗CD分子单抗分子单抗补体补体伊红染色伊红染色细胞着色细胞着色l总花环形成率（总花环形成率（Et）： 4过夜，过夜，60%80l活性花环形成率（活性花环形成率（Ea）： 室温低速短时离心，室温低速短时离心，2040lE受体受体: CD2，表达于，

17、表达于T细细 胞、胸腺细胞、胞、胸腺细胞、NK细胞细胞T celllSPA-IgG（anti-CD）-CD分子分子-T细胞亚群细胞亚群SRBC-anti-CD-T细胞（细胞（CD分子）分子）(三三) 可溶性抗原肽可溶性抗原肽-MHC四聚体复合物法四聚体复合物法l是一项近年发展起是一项近年发展起来的新技术来的新技术l与与FCM联合联合, 定量定量检测抗原特异性检测抗原特异性T淋巴细胞淋巴细胞1. mIg的检测的检测: 酶免疫法、荧光免疫法酶免疫法、荧光免疫法2. CD抗原检测抗原检测l 酶免疫组织化学法酶免疫组织化学法l 间接荧光免疫法间接荧光免疫法l 流式细胞术流式细胞术3. 受体检测（受体检

18、测（FcR、CR）l EA花环花环l EAC花环花环l 小鼠红细胞花环小鼠红细胞花环二、二、B B细胞数量检测细胞数量检测EA花环花环形成形成试验试验Fc受体受体B cellB cellB cellB cellEAC花环形成试验花环形成试验补体受体补体受体l小鼠红细胞受体：小鼠红细胞受体： 慢性慢性B细胞白血病细胞白血病 方法简单，鉴定类型方法简单，鉴定类型第三节第三节 淋巴细胞功能检测淋巴细胞功能检测nT细胞功能检测细胞功能检测nB细胞功能检测细胞功能检测nNK细胞活性测定细胞活性测定一、一、T T细胞功能检测细胞功能检测n Produce cytokinesn Cytotoxic acti

19、on n Mediate DTHT T细胞功能检测试验细胞功能检测试验nT细胞增殖试验细胞增殖试验n CTL介导的细胞毒试验介导的细胞毒试验nT细胞分泌功能检测细胞分泌功能检测n检测检测T细胞功能的体内试验细胞功能的体内试验T T细胞增殖试验细胞增殖试验形态学法形态学法3H-TdR掺入法掺入法MTT比色法比色法CFSE标记染色法标记染色法形态学形态学法法 PBMCPBMCPHA/PHA/ConAConA5 5COCO2 2 、 3737培养培养7272h h细胞细胞涂片涂片染色染色显微镜显微镜检查检查未转化淋巴细胞未转化淋巴细胞转化的淋巴母细胞转化的淋巴母细胞转化率（）转化率（）转化的淋巴细胞

20、数转化的淋巴细胞数计数的淋巴细胞总数计数的淋巴细胞总数X100Sitmulated by mitogen or antigen48h3H-TdR Count CPM3H-TdR掺入法掺入法 CFSE的前体（的前体（CFDSE）可进入细胞，）可进入细胞，降解后形成降解后形成CFSE，在一定波长的光激发下可，在一定波长的光激发下可发出荧光。当细胞分裂时，发出荧光。当细胞分裂时，CFSE平均分配到平均分配到子细胞中，使荧光量减半，再采用流式细胞子细胞中，使荧光量减半，再采用流式细胞仪分析细胞增殖活性。仪分析细胞增殖活性。CFSE标记染色法标记染色法T cell proliferation analy

21、zed by CFSE labelingT细胞介导的细胞毒试验细胞介导的细胞毒试验CTL杀伤靶细胞的机制杀伤靶细胞的机制l 通过颗粒酶和穿孔素杀伤靶细胞通过颗粒酶和穿孔素杀伤靶细胞l 通过通过FasFasL介导细胞凋亡介导细胞凋亡CTL介导细胞毒作用的检测方法介导细胞毒作用的检测方法l 形态学检查法形态学检查法l51Cr释放法释放法l 细胞凋亡检测法细胞凋亡检测法 （1）形态学检测法）形态学检测法 （2）DNA Ladder （3）ELISA （4）Flow cytomeryCytotoxicity Assays (51Cr release) B细胞增殖试验细胞增殖试验 溶血空斑试验溶血空斑试

22、验 ELISPOT检测抗体分泌细胞检测抗体分泌细胞 抗体的检测抗体的检测B细胞功能检测细胞功能检测Direct assay for IgM-secreting plasma cells (primary response)Indirect assay for IgG-secreting plasma cells (secondary response)ELISPOT检测抗体形成细胞检测抗体形成细胞第四节第四节 吞噬细胞功能测定吞噬细胞功能测定中性粒细胞中性粒细胞巨噬细胞巨噬细胞趋化功能检测趋化功能检测吞噬和杀菌功能测定吞噬和杀菌功能测定中性粒细胞功能检测中性粒细胞功能检测中性粒细胞趋化功能检测中性粒细胞趋化功能检测琼脂糖平板法琼脂糖平板法中性粒细胞趋化功能检测中性粒细胞趋