荧光分光光度计的原理及应用.

1、2021-12-10荧光分光光度计的原理荧光分光光度计的原理荧光分光光度计的原理荧光分光光度计的原理荧光分光光度计的原理荧光分光光度计的原理及应用及应用及应用及应用及应用及应用2021-12-10一、分子荧光的产生一、分子荧光的产生一、分子荧光的产生一、分子荧光的产生一、分子荧光的产生一、分子荧光的产生1. 1.电子激发态的多重度电子激发态的多重度单重激发态单重激发态S：电子自旋方向和处于基态轨道的电：电子自旋方向和处于基态轨道的电子配对。子配对。第一节第一节第一节第一节第一节第一节 荧光分光光度法原理荧光分光光度法原理荧光分光光度法原理荧光分光光度法原理荧光分光光度法原理荧光分光光度法原理三

2、重激发态三重激发态T：电子：电子自旋方向和处于基态自旋方向和处于基态轨道的电子平行。轨道的电子平行。2021-12-102. 2. 分子能级与跃迁分子能级与跃迁基态基态( (S0)激发态激发态( (S1、S2激发态振动能级激发态振动能级) )：吸收特吸收特定频率的辐射。定频率的辐射。激发态激发态基态：多种途径和方式基态：多种途径和方式( (见能级图见能级图) )；速度最；速度最快、激发态寿命最短的途径占优势；快、激发态寿命最短的途径占优势；磷光内转移外转移系间跨越延迟荧光传递途径传递途径辐射跃迁荧光振动弛预无辐射跃迁2021-12-10S2S1S0T1吸吸收收发发射射荧荧光光发发射射磷磷光光系

3、间跨越内转换振动弛豫能量l l 2l l 1l l 3 外转换l l 2T2内转换振动弛豫2021-12-10二、激发光谱与荧光光谱二、激发光谱与荧光光谱二、激发光谱与荧光光谱二、激发光谱与荧光光谱二、激发光谱与荧光光谱二、激发光谱与荧光光谱1. 1.荧光的激发光谱曲线荧光的激发光谱曲线 固定测量波长固定测量波长( (选最大发射波长选最大发射波长), ),化合物发射的荧化合物发射的荧光光( (磷光磷光) )强度与激发光波长的关系曲线强度与激发光波长的关系曲线 （图中曲线（图中曲线I ） 。激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最。激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多，荧光强度最大；多，荧

4、光强度最大；2021-12-102. 2. 2. 2. 2. 2.荧光光谱荧光光谱荧光光谱荧光光谱荧光光谱荧光光谱 固定激发光波长固定激发光波长, , 化合物发射的荧光强化合物发射的荧光强度与发射光波长关系度与发射光波长关系曲线曲线( (图中曲线图中曲线II) )。问题：荧光问题：荧光( (磷光磷光) )的的激发光波长如何选择激发光波长如何选择？Stokes位移位移：激发激发光谱与发射光谱之间光谱与发射光谱之间的波长差值的波长差值。发射光发射光谱的波长比激发光谱谱的波长比激发光谱的长的长。2021-12-10三、荧光强度和溶液浓度的关系三、荧光强度和溶液浓度的关系三、荧光强度和溶液浓度的关系三

5、、荧光强度和溶液浓度的关系三、荧光强度和溶液浓度的关系三、荧光强度和溶液浓度的关系1 1 定量依据定量依据 荧光强度荧光强度 If正比于正比于吸收的光量吸收的光量Ia和荧光量子效率和荧光量子效率 ： If = Ia 由朗由朗- -比耳定律：比耳定律： Ia = I0(1-10- l c ) If = I0(1-10- l c ) = I0(1-e-2.3 l c ) 浓度很低时，将括号项近似处理后：浓度很低时，将括号项近似处理后： If = 2.3 I0 l c = Kc （浓度高时（浓度高时如何？）如何？）2021-12-10标准曲线法定量：标准曲线法定量： 配制一系列标准浓度试样测定荧光强

6、度，绘制标配制一系列标准浓度试样测定荧光强度，绘制标准曲线，再在相同条件下测量未知试样的荧光强度准曲线，再在相同条件下测量未知试样的荧光强度，在标准曲线上求出浓度；，在标准曲线上求出浓度；比较法定量：比较法定量： 在线性范围内，测定标样和试样的荧光强度，比在线性范围内，测定标样和试样的荧光强度，比较。较。2 2 定量方法定量方法三、荧光强度和溶液浓度的关系三、荧光强度和溶液浓度的关系三、荧光强度和溶液浓度的关系三、荧光强度和溶液浓度的关系三、荧光强度和溶液浓度的关系三、荧光强度和溶液浓度的关系2021-12-10四、荧光、磷光分析方法的特点四、荧光、磷光分析方法的特点四、荧光、磷光分析方法的特

7、点四、荧光、磷光分析方法的特点四、荧光、磷光分析方法的特点四、荧光、磷光分析方法的特点（1 1）灵敏度高）灵敏度高 比紫外比紫外- -可见分光光度法高可见分光光度法高2 24 4个数量级；为什个数量级；为什么？么？ 分光光度法所检测的是两个较大的信号的微小差分光光度法所检测的是两个较大的信号的微小差别，荧光光度法检测的是很小背景值上的荧光强度别，荧光光度法检测的是很小背景值上的荧光强度。（2 2）选择性强）选择性强 既可依据特征发射光谱，又可根据特征吸收光谱既可依据特征发射光谱，又可根据特征吸收光谱；（3 3）试样量少）试样量少（4 4）可提供比较多的物理参数）可提供比较多的物理参数 缺点：应

8、用范围小缺点：应用范围小。2021-12-10第二节第二节第二节第二节第二节第二节 荧光分光光度计的组成荧光分光光度计的组成荧光分光光度计的组成荧光分光光度计的组成荧光分光光度计的组成荧光分光光度计的组成 测量荧光的仪器主要由测量荧光的仪器主要由四个部分四个部分组成：激发光源、样品组成：激发光源、样品池、双单色器系统、检测器。池、双单色器系统、检测器。 特殊点：有两个单色器，光源与检测器成直角。特殊点：有两个单色器，光源与检测器成直角。 基本流程如图：基本流程如图：单色器单色器：选择激发光波长：选择激发光波长的第一单色器和选择发射的第一单色器和选择发射光光( (测量测量) )波长的第二单色器波

9、长的第二单色器；光源光源：氙灯：氙灯? ?和高压汞灯，和高压汞灯，染料激光器染料激光器检测器检测器：光电倍增管：光电倍增管。2021-12-10仪仪仪仪仪仪器器器器器器光光光光光光路路路路路路图图图图图图问问题题：参参考考光光电电管管作作用用？2021-12-10第三节第三节第三节第三节第三节第三节 荧光分析法的应用荧光分析法的应用荧光分析法的应用荧光分析法的应用荧光分析法的应用荧光分析法的应用(1)(1)无机化合物的分析无机化合物的分析 与有机试剂配合物后测量；可测量约与有机试剂配合物后测量；可测量约6060多种元素。多种元素。 铍、铝、硼、镓、硒、镁、稀土常采用荧光分析法；铍、铝、硼、镓、硒、镁、稀土常采用荧光分析法； 氟、硫、铁、银、钴、镍采用荧光熄灭法测定；氟、硫、铁、银、钴、镍采用荧光熄灭法测定； 铜、铍、铁、钴、锇及过氧化氢采用催化荧光法测定；铜、铍、铁、钴、锇及过氧化氢采用催化荧光法测定； 铬、铌、铀