龙牙百合原生质体制备与电融合条件初探论文

1、 本科生毕业设计(论文)中文题目龙牙百合原生质体制备与电融合条件初探 外文题目Preparation and fusion of protoplast of longya Lily optimizationt 学号 0908180009 姓名程思睿 学院生命科学学院 专业 生物工程 指导教师涂艺声教授 完成时间2013年5月2日 江西师范大学教务处制目 录摘 要3Abstract41绪论51.1龙牙百合现状以及实验意义所在51.2 原生质体研究概况61.2.2 原生质分离61.2.2.1 影响原生质体分离的因素71.2.2.1.1 酶71.2.2.1.2 酶解时间81.2.2.1.3 pH值8

2、1.2.2.1.4 温度81.2.2.1.5 预处理8 1. 2. 3 影响原生质体电融合的因素.82材料与方法92.1 实验材料92.2 实验方法与思路9 2. 2. 1龙牙百合的组织培养.92.2.2 酶浓度对原生质体产量的影响92.2.3酶解时间对原生质体产量的影响9 2. 2. 4 离心操作.10 2. 2. 5原生质体成串状排列的条件测定.10 2. 2. 6原生质体电融合的最佳条件测定103结果与分析123.1 龙牙百合原生质体制备条件研究.123.1.1酶液组成对原生质体产量的影响123.1.2酶解时间对原生质体产量的影响123.1.3原生质体电融合的最佳条件分析124结果总结1

3、4参考文献15附录A16A.1.主要试剂17A.2主要溶液的配制17A.3设备和仪器18致 谢19摘 要 本文以龙牙百合试管苗为材料，研究了不同浓度的酶液和酶解时间对获得龙牙百合原生质体产量的影响；进一步探究了原生质体电融合适宜的条件。实验主要结果如下： 1 龙牙百合原生质体制备的最佳条件：酶液组成为1%的纤维素酶+1%果胶酶，酶解的最佳时长为3.5小时，。2 龙牙百合原生质体电融合最佳条件为 交流电压 6V 持续时间 50S 直流电压300V 脉冲时间 25S 脉冲次数为10次 关键词：龙牙百合，原生质体制备，酶液组成，原生质体电融合Preparation and fusion of pro

4、toplast of longya Lily optimizationtCheng SiruiDirected by Professor TU Yisheng AbstractThis paper, in the preparation of protoplasts of longya Lily enzyme and enzyme solutions of different concentrations on yield of protoplasts from effect to one of the most appropriate data as well as fetching in

5、protoplast electrofusion process in the determination of the most appropriate data. Experimental main results are as follos1 best conditions for protoplast of longya Lily: enzyme cellulase +1% 1% composed of Pectinase, best time is 3.5 hours by enzymatic hydrolysis.2 longya Lily protoplast electro f

6、usion the best conditions for the duration of the AC voltage 6V DC 50S 300V pulse time: 25 µs pulse 10 timesKey words: longya Lily, protoplast, enzyme composed of protoplast fusion1绪论百合是百合科百合属多年生草本球根植物，主要分布在亚洲东部、欧洲、北美洲等北半球温带地区。全球已发现有百多个品种，中国是其最主要的起源地，原产五十多种，是百合属植物自然分布中心。近年有不少经过人工杂交而产生的新品种，如亚洲百合

7、、麝香百合、香水百合等。百合的主要应用价值在于观赏，有些品种可作为蔬菜食用和药用。本实验以龙牙百合为材料，研究酶液组成，酶解时间，这两个个因素对龙牙百合原生质体制备的影响，以及百合原生质体电融合的最佳条件。1.1龙牙百合现状以及实验意义所在龙牙百合为江西省宜春市万载名产。万载百合有500多年的种植和加工历史，尤以龙牙百合在历史上久负盛名。从宋朝开始，万载龙牙百合粉就成为历朝贡品。百合的地下鳞茎富有淀粉、蛋白质、脂肪以及人体所需的各种维生素和矿物质。据医药典籍金匮要略、本草纲目、中国药典记载，百合有润肺止咳、宁心安神、理脾健胃、补中益气、利大小便、解无名肿毒及止血等功效。现代医学研究证明，百合含

8、有的秋水仙碱、秋水仙胺等对人体细胞有丝分裂有明显的抑制作用，抑制癌细胞及急性痛风等，均有明显疗效。百合还可以提练葡萄糖和奎宁等药品。龙牙百合是万载县的一个传统产品，个头大、片长、肉厚、心实、色泽白、味道美、营养丰富、药效明显，经江西检测站检测，每百克百合中含水份65%，碳水化含物23.8%，总膳食纤维5.9%（其中果胶4.8%、蛋白质4%、脂肪0.1%、水分1.1%、钙0.9%、铁0.09%、热量132千卡）。因此，百合是集食品、药品于一身的绿色保健食品。当前由于人为和自然的影响,使得许多野生百合已成为稀有濒危植物,有的甚至已灭绝。因此,野生百合种质资源的保护迫在眉睫。要开展有效的保护,并对其

9、在保护的基础上加以利用,首先必须开展调查研究。近20多年来,我国在百合资源引种驯化、形态与细胞遗传学背景研究、远缘杂交育种等方面取得了一些成就,但在百合育种方面与世界先进国家差距较大,至今没有一个具自主知识产权的人工种植观赏品种。原生质体制备是细胞融合的基础，细胞融合是育种的一种重要手段，本实验对保护和利用龙牙百合的资源和品种改良有积极意义，同时也对百合细胞融合有重要意义。1.2 原生质体研究历史植物原生质体就是除去细胞壁的具有生活力的“细胞”。由于在原生质体制备的过程中,没有对细胞核内染色体及细胞质中各个细胞器进行操作,使得每个原生质体均含有该植物的全部遗传信息,并在适当的培养条件下能通过细

10、胞壁再生、细胞繁殖、愈伤组织萌发或体胚发生、器官发生的途径再生得到与亲本性状相似的个体。在作物杂交育种中，原生质体融合可以有效地克服有性杂交不亲和性以及花期不育等常规育种中所遇到的问题，并创造新的种质或优良的品种。最初采用机械法制备原生质体,但原生质体质量差、产量低,后来酶解法逐渐取代该法,在原生质体培养方面,Nagata等首次通过烟草原生质体培养得到可育再生植株,至此植物原生质体培养研究广泛兴起。继Carlson等报道首例粉蓝烟草与郎氏烟草种间体细胞杂种植株的再生后,Melchers等得到了番茄与马铃薯属间体细胞杂种,随后Kisaka等将番茄叶肉细胞原生质体与胡萝卜悬浮培养细胞原生质体经电融

11、合获得科间杂种。目前,至少有400多种植物通过原生质体培养得到再生植株,并已获得多种植物的种间、属间甚至科间原生质体融合的再生植株。百合原生质体方面的研究起步较晚，于 1979 年 Simmonds 等第一次成功地分离了百合鳞茎原生质体，从此开始了百合原生质体培养的研究进程。1987 年 Tanaka、Kitazune C 等成功分离并培养了花粉的原生质体，使百合原生质体的研究更上一个台阶。在前试验基础上Tanaka（1988）等再次成功分离了生殖细胞的原生质体，为百合原生质体培养及植株再生奠定了基础。近年来，由于原生质体具有结构简单、发育同步性好、群体数量大、DNA分子易于进入细胞，易获得纯

12、合性转化子的特点，及其培养技术与有关的细胞、分子和遗传等学科的交叉渗透，使植物原生质体的研究越来越受到重视。研究领域也从分离原生质体进行的生理生化和利用不同材料的原生质体得到再生植株的阶段转到原生质体的应用(尤其是遗传性状改良)方面。1.2.2 原生质体分离原生质体的分离是原生质体培养成功的一个重要环节。原生质体培养的早期研究是采用机械法分离原生质体的，但由于这种分离方法操作繁琐、产量低，取材又局限于具有高度液泡化的细胞，从而使这一领域的研究进展缓慢。目前,分离植物原生质体的常规方法是酶解法。用酶解法分离原生质体时，首先要考虑植物材料的正确选择。一般情况下，当植物处于最佳生长状态时取材，分离的

13、效果最为理想。如茄科植物一般选取生长旺盛、生理状态一致的试管苗上部叶片（Ochatt S J etal.,1986），而禾本科植物大多数选取胚性悬浮细胞系为材料（马锋旺和李嘉瑞，1999）。一个处于指数期快速生长的细胞培养体系，如愈伤组织或悬浮培养物，最适宜作为分离原生质体的材料。其次，要选择合适的水解酶种类、组合及浓度。目前市场上出现了许多分离原生质体的酶制品，如纤维素酶(Cellulase RS)、半纤维素酶(Hemicellulase)、果胶酶(Pectolyase Y-23)和离析酶(Macerozyme R-10)，但各种酶的性质、活性、纯度及作用有很大的差别，苹果和山桃的原生质体分

14、离中只需纤维素酶和果胶酶即可。枣树的原生质体分离用纤维素酶和离析酶（何业华和胡芳名，1999）。在中国李原生质体分离中加一定浓度的半纤维素酶(Hemicellulase)可明显提高原生质体的产量。选用时应根据植物材料和酶制品的特性进行综合考虑（马锋旺和李嘉瑞，1999）。此外，还必须控制好酶解条件。影响酶解过程的主要因素有温度、pH 值、渗透压、离子浓度、振荡及预处理等。一般情况下，酶解温度为 2530，酶解液的 pH 值根据所用酶种类的不同可以在 5.46.2 之间变动，渗压剂的使用浓度，一般控制在 0.450.8mmol/L范围内。酶解前对材料进行轻微的质壁分离，酶解时低速振荡(50rpm

15、)以及酶解液中高钙镁离子浓度(CaCl2和 MgCl2)等能提高原生质体的产量和质量。原生质体成功分离后的纯化方法常用的有漂浮法和界面沉降法。漂浮法在洗涤纯化过程中对原生质体的损伤较小，但对离心力要求严格，不易掌握，界面沉降法易造成原生质体损伤，但操作简单。具体选择方法则依实验条件而定。1.2.2.1 主要影响原生质体分离的因素影响原生质体的产量与活力的因素有很多,主要有以下几个方面:1.2.2.1.1 酶植物细胞壁主要由纤维素，半纤维素以及果胶质三种成分构成，相应的对其进行降解就能够得到原生质体 但是酶浓度过低会导致原生质体产量过低 酶浓度过高就会导致原生质体破裂产量降低。1.2.2.1.2

16、 酶解时间酶解的时间越长，获得的原生质体产量越高。但随着酶解时间的加长，原生质体会发生破裂反而使原生质体产量相对下降。1.2.2.1.3 pH值经过多次实验证明 植物原生质体分离过程中ph值最适合保持在5.46.2之间如果ph值过高或者过低都不利于原生质体的生存 从而导致原生质体产量过低。1.2.2.1.4 温度温度是影响酶活性的另一个重要因素，因此，温度也直接影响着原生质体的产量与活力。一般植物原生质体分离所需要的温度范围是：2530温度过高，酶的活性很低，甚至会失活，从而使原生质体的产量与活力下降。温度过低，酶的活性会降低，原生质体的产量与活力也会下降。但有的植物较为特殊，适宜分离原生质体

17、的温度偏高。例如，制备柑橘原生质体适合适的温度是37，月季的温度范围相对较广，在2533。1.2. 2. 1. 5 预处理许多研究表明，酶解前对材料进行预处理会改变细胞和细胞壁的生理状态增加细胞膜强度或改变细胞壁成分，酶解前用13%甘露醇CPW盐溶液质壁分离1h 。能够有效提高原生质体产量。1.2.3 影响原生质体电融合的因素 影响原生质体电融合的主要因素有交流电压及其持续时间 直流电压 直流电脉冲时间 次数 等主要因素2 材料与方法2.1 试验材料试验所用材料均取自江西师范大学资源植物研究室的无菌试管苗。材料有：龙牙百合。2.2 试验方法与思路2.2.1龙牙百合的组织培养实验采用实验室里的无

18、菌试管苗为材料进行组织培养，以获得足够试验用的材料。激素对愈伤组织诱导的影响效应为NAA>6BA>2，4-D，最适培养基采用MS+ 10 mg·L-1NAA+02 mg·L-1 6BA；琼脂和蔗糖添加量分别为7g·L-1和30g·L-1，培养基ph调为5.8。培养基配制好后用锥形瓶分装，每瓶装约50ml，放入高压蒸汽灭菌锅中进行灭菌，灭好菌冷却之后在无菌的条件下，选取生长两个月左右的健壮的试管苗，剔除表面老化的鳞片，剪掉底部的休眠状态的基底使之形成伤口，之后接种到培养基上。接种完后放入光照培养箱中进行培养，温度控制在23左右，光照为800lu

19、x，约40天后可进行原生质体分离实验。2.2.2酶浓度对原生质体产量的影响 酶液用CPW配制，配制前量取一定量的CPW溶液放在烧杯中，然后依次将称量好的MES、甘露醇、纤维素酶和果胶酶溶解在CPW中，待药品溶解后在无菌条件下使酶液经 0.22um微孔滤膜过滤除菌，然后可用于酶解 其中以纤维素酶与果胶酶的浓度为测定因素 分别取纤维素酶浓1% 果胶酶浓0.5%；纤维素酶浓1% 果胶酶1%； 纤维素酶1.5%果胶酶1%来进行测定2.2.3酶解时间对原生质体产量的影响 将用酶液浸泡好的原生质体水平放置于水平摇床之上 设置转速为5060之间室温保持在26左右，取不同的酶解时间定因素 分别取 3h 3.5

20、h 4h来观察原生质体生长情况2.2.4 离心操作1.材料酶解后，先使用100目的无菌过滤网进行粗过滤，再通过320目的无菌过滤网进行细过滤，除去没有酶解完的组织和细胞团。2.将滤液置于离心管中，在转速800r/ min下离心8min,弃去上清液后加入CPW配制的洗酶液进行洗酶离心，条件为转速800r/ min离心时间8min，重复两次。3.弃去上清液，另取一支离心管，在管底加入CPW配制的30%蔗糖8ml，在蔗糖液层表面用无菌滴管缓缓加入上一步得到的原生质体沉淀物，进行离心 条件为600r/min 5min4.取离心后原生质体浓密分布的部分加入CPW液的离心管内进行离心分别离心900r/mi

21、n 8min 和800r/min 5min两次。2. 2. 5 原生质体成串装条件测定 取离心过后沉淀液滴于Eppendorf电融合杯中覆盖于电极两级置倒置显微镜下接通电源调制参数观察。初始设定交流电0V 时间0V 直流电0V 脉冲时间0s 脉冲次数0 然后慢慢调整交流电压与交流电持续时间直到原生质体能很好的成串装排列。2. 2. 6 原生质体电融合条件测定 取得原生质体能够成串装排列条件 之后保持交流电压不变 改变直流电压 脉冲时间 脉冲次数等参数 直到得出相应最好的数据。 3结果与分析3.1 百合原生质体制备条件研究3.1.1酶液组成对原生质体产量的影响 表1（纤维素酶与果胶酶对原生质体产

22、量的影响） Effects of cellulase and Pectinase to yield of protoplasts实验次数1%纤维素酶+1%果胶酶(个/g)1%纤维素酶+0.5%果胶酶（个/g）1.5%纤维素酶+1%果胶酶（个/g）13.34x1053.O7x1053.11x10523.19X1053.15X1052.79X10533.45X1053.10X1052.91x105平均3.33x1053.11x1052.74x105由表1分析以看出来所选定的三个条件下在纤维素酶与果胶酶浓度均为1%的时候原生质体产量最高其原因可能是酶浓度不够可能导致酶解不够彻底而酶浓度过高则容易造成

23、原生质体破裂死亡。3.1.2酶解时间对原生质体产量的影响 表2（酶解时间对原生质体产量的影响） Enzymolysis effects of time on the yield of protoplasts试验次数3h（个/g）3.5h(个/g)4h（个/g）11.23x1051.47x1051.12x10521.30x1051.75x1051.22x10531.05x1051.44x1051.33x105平均1.19x1051.55x1051.22x105由表2数据分析可知，在一定范围内，随着酶解时长的增加，原生质体的产量也随之增加，但当酶解时长超过3.5小时后，酶解时长增加，原生质体产量减

24、少。在显微镜下进行观察可以发现，3小时和3.5小时酶解时长处理下的原生质体形态正常，碎片较少。而酶解4小时后的酶解液在显微镜下能够看到有大量的细胞碎片。原因可能是原生质体不稳定，震荡会加快原生质体破裂，酶解时间越长，破碎的原生质体也就越多。3.1.3原生质体电融合最佳条件分析 观察经过处理可以发现当交流电压为6V 持续时间为50s的时间原生质体已经稳定成串状排列 加大电压或者调整其他数据也不能使原生质体移动。 然后调整直流电数据观察到在直流电压300V 脉冲时间25s 脉冲次数为10次 原生质体大部分都能完成进行电融合，见图1 2 3图1 原生质体在16x10倍镜下的大概分布略图 图2 原生质

25、体在双电极间成串状排列图 图3 适宜原生质体电融合的电压作用4结果总结。龙牙百合原生质体制备的最适条件为酶液组成为1%纤维素酶+1%果胶酶，最佳酶解时长为3.5个小时，原生质体电融合最佳条件为 交流电压6V 持续时间50s 直流电压300V 脉冲时间25s 脉冲次数10次参考文献1 国家药典委员会，中华人民共和国药典：一部M.北京工业出版社，2005：12 涂鹏飞，何燕萍，楼之岑，肉苁蓉的本草考证J 中国中药杂志，1994,19(1):33 田爱梅，郑日如，王国强，陈发菊，曹家树，中国野生百合种质资源的研究保护与利用J，安徽农业科学2007,35(31):9987-99904 张良波，李培旺，

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