第一章蛋白质PPT课件

1、1第一节第一节 氨基酸氨基酸-蛋白质的构件分子蛋白质的构件分子第二节第二节 蛋白质的共价结构蛋白质的共价结构第三节第三节 蛋白质的三维结构蛋白质的三维结构第四节第四节 蛋白质结构与功能的关系蛋白质结构与功能的关系第五节第五节 蛋白质的分离、纯化和表征蛋白质的分离、纯化和表征 2第五节第五节 蛋白质的分离、纯化和表征蛋白质的分离、纯化和表征一、蛋白质的酸碱性质一、蛋白质的酸碱性质二、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀二、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀三、蛋白质相对分子质量的测定三、蛋白质相对分子质量的测定四、蛋白质的分离纯化四、蛋白质的分离纯化五、蛋白质的分离纯化方法五、蛋白质的分离纯化方法六、蛋白

2、质的含量测定与纯度鉴定六、蛋白质的含量测定与纯度鉴定本节小结本节小结31.1.蛋白质的等电点蛋白质的等电点P PI I：2.2.蛋白质电泳：蛋白质电泳： 4二、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀二、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀1.1.蛋白质溶液是胶体溶液蛋白质溶液是胶体溶液2.2.维持蛋白质的胶体系统稳定的因素维持蛋白质的胶体系统稳定的因素l1 1100nm100nm大小的质点在动力学上是稳定的大小的质点在动力学上是稳定的. . l某一某一pHpH下质点带有同种电荷，互相排斥。下质点带有同种电荷，互相排斥。l质点能与溶剂（水）形成水化层，相互间不易靠拢。质点能与溶剂（水）形成水化层，相互间不易靠

3、拢。51.1.可逆沉淀可逆沉淀: :2.2.不可逆沉淀不可逆沉淀: :3.3.沉淀蛋白质的方法沉淀蛋白质的方法v等电点沉淀等电点沉淀( (可逆，不变性可逆，不变性) )强酸碱沉淀强酸碱沉淀( (不可逆不可逆):):v蛋白质的盐析蛋白质的盐析( (可逆可逆, ,不变性不变性) )：硫酸铵、硫酸钠、氯化钠。硫酸铵、硫酸钠、氯化钠。v有机溶剂沉淀蛋白质有机溶剂沉淀蛋白质( (可逆或不可逆可逆或不可逆):):乙醇、丙酮或甲醇。乙醇、丙酮或甲醇。v重金属盐和生物碱剂沉淀蛋白质：重金属盐和生物碱剂沉淀蛋白质：Hg2、Ag2、单宁酸、单宁酸、苦味酸。苦味酸。v加热（变性）沉淀蛋白质：加热（变性）沉淀蛋白质：

4、6三、蛋白质相对分子质量的测定三、蛋白质相对分子质量的测定1.根据化学组成测定最低相对分子质量根据化学组成测定最低相对分子质量例例1：肌红蛋白和血红蛋白含铁量均为：肌红蛋白和血红蛋白含铁量均为0.335%,计算二者的相对分计算二者的相对分子质量。子质量。例例2：一种纯酶按重量计算含亮氨酸：一种纯酶按重量计算含亮氨酸1.65%和异亮氨酸和异亮氨酸2.48%，问，问其最低相对分子质量？其最低相对分子质量？2. 沉降法（超速离心法）沉降法（超速离心法）X X（某（某. .）的原子量）的原子量Y Y（某（某.）的百分含量）的百分含量最低相对分子质量最低相对分子质量 10073. 凝胶过滤法测定相对分子

5、质量（分子筛层析）凝胶过滤法测定相对分子质量（分子筛层析）l凝胶过滤的介质：凝胶过滤的介质：多孔网状多孔网状凝胶珠。凝胶珠。l排阻极限排阻极限。被分离的相对分。被分离的相对分子质量范围。子质量范围。l 经常使用的凝胶：经常使用的凝胶：交联葡聚交联葡聚糖（糖（4444页，页，SephadexSephadex），聚），聚丙烯酰胺和琼脂糖（丙烯酰胺和琼脂糖（4949页页,Sepharose,Sepharose）。）。l凝胶过滤的原理凝胶过滤的原理：与分子大：与分子大小和形状有关。小和形状有关。l颗粒大的移动快，颗粒小的颗粒大的移动快，颗粒小的移动慢。形状接近球体。移动慢。形状接近球体。8l测几种蛋白

6、质相对分子质量测几种蛋白质相对分子质量标准物的标准物的Ve（洗脱体）。（洗脱体）。l再测待测样品的再测待测样品的Ve。94. SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定相对分子质量聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定相对分子质量lSDS: 阴离子去污剂，十二烷基硫酸纳阴离子去污剂，十二烷基硫酸纳 破裂蛋白质分子中的氢键和疏水作用。破裂蛋白质分子中的氢键和疏水作用。l巯基乙醇：巯基乙醇：HO CH2 CH2 - SH 能打开二硫键能打开二硫键 SDS以其烃链与蛋白质分子的侧链结合成复合体，以其烃链与蛋白质分子的侧链结合成复合体，每两个氨基酸残基结合一个每两个氨基酸残基结合一个SDS分子。分子。101010结果结果：v不

7、同蛋白质的不同蛋白质的SDSSDS复合体覆盖复合体覆盖上相同的负电荷，具有几乎上相同的负电荷，具有几乎相同的荷质比，向正极移动。相同的荷质比，向正极移动。v具有机同的构象，长椭圆棒，具有机同的构象，长椭圆棒，v电泳迁移率不受各种蛋白质电泳迁移率不受各种蛋白质原有的电荷、分子形状等因原有的电荷、分子形状等因素的影响素的影响 ，而与多肽链分子，而与多肽链分子量大小相关。分子量大的泳量大小相关。分子量大的泳动慢，小的泳动快。动慢，小的泳动快。v几种已知分子量的标准蛋白几种已知分子量的标准蛋白质作对照。也可做图求。质作对照。也可做图求。- - - - - - - - - - - - - - - - -

8、 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -11四、蛋白质的分离纯化四、蛋白质的分离纯化原理原理：目的是从混杂蛋白质中分离出一个特殊蛋白质。页使用：目的是从混杂蛋白质中分离出一个特殊蛋白质。页使用组合的分级技术，利用欲分离蛋白质的溶解度、分子大小、电组合的分级技术，利用欲分离蛋白质的溶解度、分子大小、电荷、特殊的结合亲和力。荷、特殊的结合亲和力。程序程序前处理：选材、破碎、匀浆、溶解、离心或差速离心、（前处理：选材、破碎、匀浆、溶解、离心或差速离心、（pH、温温 度、酶的抑制剂等保证蛋白质的稳定）。度、酶的抑制

9、剂等保证蛋白质的稳定）。粗分级分离：盐析、等电点沉淀、有机溶剂分级分离，离心。粗分级分离：盐析、等电点沉淀、有机溶剂分级分离，离心。细分级分离：层折法。细分级分离：层折法。结晶：结晶过程本身也伴随着一定程度的纯化。结晶：结晶过程本身也伴随着一定程度的纯化。12五、蛋白质的分离纯化方法五、蛋白质的分离纯化方法1. 根据分子大小不同的纯化方法根据分子大小不同的纯化方法 透析透析(玻璃纸、火棉纸玻璃纸、火棉纸)加压、抽滤和离心加压、抽滤和离心超过滤超过滤滤膜有滤膜有多种规多种规格：格：截留相截留相对分子对分子质量不质量不同的蛋同的蛋白质。白质。透析液透析液132.密度梯度（区带）离心密度梯度（区带）

10、离心并且每种蛋白质并且每种蛋白质颗粒沉降到与自颗粒沉降到与自身密度相等的介身密度相等的介质密度梯度时，质密度梯度时，即停止不前，在即停止不前，在离心管中被分离离心管中被分离成成各自独立的区各自独立的区带。带。143. 蛋白质的层析蛋白质的层析凝胶过滤凝胶过滤（分子排阻、凝胶过滤层析、凝胶渗透层析）（分子排阻、凝胶过滤层析、凝胶渗透层析）15离子交换层析离子交换层析l蛋白质的分离基于它的总净电荷。蛋白质的分离基于它的总净电荷。l常用离子交换剂（支持物）：常用离子交换剂（支持物）：纤维素和交联葡聚糖离子交换剂纤维素和交联葡聚糖离子交换剂阴离子交换层析：用于带负电荷蛋白质的分离。阴离子交换层析：用于

11、带负电荷蛋白质的分离。DEAE纤维素或纤维素或DEAE葡聚糖葡聚糖Sephadex)阳离子交换层析：用于带正电荷蛋白质的分离。阳离子交换层析：用于带正电荷蛋白质的分离。 CM纤维素或纤维素或CM葡聚糖葡聚糖蛋白质对离子交换剂的结合力取决于：蛋白质对离子交换剂的结合力取决于：彼此间相反电荷基团的静电吸引彼此间相反电荷基团的静电吸引与溶液的与溶液的pH有关有关保持洗脱液不变、分段洗脱、梯度洗脱、改变保持洗脱液不变、分段洗脱、梯度洗脱、改变pH对离子交换剂结合力最小的蛋白质首先被洗脱下来对离子交换剂结合力最小的蛋白质首先被洗脱下来16亲和层析亲和层析17184. 蛋白质的电泳：蛋白质的电泳：根据电荷

12、不同的纯化方法根据电荷不同的纯化方法l支持物：支持物：具多孔的聚丙烯酰胺凝胶。具有分子筛的作用。具多孔的聚丙烯酰胺凝胶。具有分子筛的作用。l凝胶的孔隙大小用选择丙烯酰胺的适宜浓度和交联剂（亚甲凝胶的孔隙大小用选择丙烯酰胺的适宜浓度和交联剂（亚甲基双丙烯酰胺）加以控制。基双丙烯酰胺）加以控制。l迁移率由分子大小、分子形状、净电荷多少决定。迁移率由分子大小、分子形状、净电荷多少决定。19 PAGE（非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳）（非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳）l分子的分离是根据蛋白质的大小，分子的分离是根据蛋白质的大小，以及它的净（负或正）电荷以及它的净（负或正）电荷。l较小的分子量，较多的净负（或正）较

13、小的分子量，较多的净负（或正）电荷向正（或负）极移动的快。电荷向正（或负）极移动的快。SDSPAGE（变性聚丙烯酰胺变性聚丙烯酰胺凝胶电泳）凝胶电泳）所有蛋白质都带有与质量成比例的所有蛋白质都带有与质量成比例的相同负电荷。相同负电荷。最小的蛋白质迁移最远。最小的蛋白质迁移最远。用于测定蛋白质样品的纯化程度、用于测定蛋白质样品的纯化程度、蛋白质的相对分子质量和蛋白质中蛋白质的相对分子质量和蛋白质中多肽亚基的数量。多肽亚基的数量。2021等电聚焦等电聚焦l使用大孔隙聚丙烯酰胺凝胶并含有两性聚电解质，如使用大孔隙聚丙烯酰胺凝胶并含有两性聚电解质，如果将电场加到凝胶上，两性聚电解质迁移并产生果将电场加到凝胶上，两性聚电解质迁移并产生pH梯梯度。度。l蛋白质混合物是在具有蛋白质混合物是在具有pH梯度的介质进行的。各种蛋梯度的介质进行的。各种蛋白质到达白质到达pH等于它的等于它的pI位置时，即不再移动成条带。位置时，即不再移动成条带。双向凝胶电泳双向凝胶电泳等电聚焦与等电聚焦与SDSPAGE相结合的电泳方法。相结合的电泳方法。2223六、蛋白质的含量测定与纯度鉴定六、蛋白质的含量测定与纯度鉴定（一）蛋白质的含量测定（一）蛋白质的含量测定凯氏定氮法、双缩尿法、凯氏定氮法、双缩尿法、Folin-酚试剂法、紫外吸收法等。酚试剂法、紫外吸收法等。（二）蛋白质的纯度测定（二）蛋白质