铜绿假单胞菌耐药

1、收稿日期:2003 - 12 - 15作者简介:李学如,男,生于1958年,博士,副教授,主要从事微生物药物和细菌耐药分子机理研究。文章编号:1001 - 8751 (2004) 03 - 0105 - 04铜绿假单胞菌耐药机理研究进展李学如 孟涛 王 艳综述(西南交通大学生物工程系,成都610031 )摘要:铜绿假单胞菌对抗菌药物主要存在以下四种耐药机理:产生抗生素灭活酶或抗生素修饰酶; 改变抗菌药物作用的靶位,从而逃避抗菌药物的抗菌作用;膜屏障与主动外排,限制药物到达其作用靶位; 形成生物膜 。铜绿假单胞菌对抗生素的耐药往往不是由单一因素造成的。有关铜绿假单胞菌的耐药性,仍存在许多问题有待

2、进一步探索,铜绿假单胞菌耐药性防治还需要深入研究,寻找能够拮抗细菌生物膜形成和主动泵出机制抗菌药物是今后必须解决的问题和研究方向。关键词:铜绿假单胞菌;耐药机理;拓扑异构酶;主动外排中图分类号:r915文献标识码:a铜绿假单胞菌是一种临床上最常见的引起严重院内获得性感染条件致病菌。由铜绿假单胞菌引起的医院内感染高达30 %以上 ,而呼吸道感染率更高,居病原菌之首 。随着抗菌药物的广泛应用,细菌的耐药性变得越来越严重,使得治疗铜绿假单胞菌感染十分困难1、2 。铜绿假单胞菌主要通过以下四种途径产生耐药: 产生抗生素灭活酶或抗生素修饰酶,如产生 - 内酰胺酶 、 氨基糖苷钝化酶等; 改变抗菌药物作用

3、的靶位 ,从而逃避抗菌药物的抗菌作用,如青霉素结合蛋白( pbps ) 和 dna 促旋酶等结构发生改变; 膜屏障与主动外排 ,限制药物到达其作用靶位; 形成生物膜(biofilm ) 。本文就铜绿假单胞菌对目前临床上常用的抗铜绿假单胞菌药物的耐药机理方面研究进展作一简要介绍 。1 产生抗生素灭活或修饰酶细菌产生- 内酰胺酶是细菌耐药的最重要的机制之一 。产酶菌通过对 - 内酰胺类抗生素的水解作用 ,使其能在有 - 内酰胺类抗生素存在的环境下生存 。由于铜绿假单胞菌具有比较特殊的细胞壁和细胞膜结构 ,对许多 - 内酰胺类抗生素存在固有耐药,临床上多采用羧基及酰胺类青霉素、 三代头孢菌素和碳青霉

4、烯类 - 内酰胺抗生素治疗铜绿假单胞菌感染。因此 ,深入研究铜绿假单胞菌产超广谱- 内酰胺酶( extended - spectrum- lactamases、 esbls) 的耐药机制具有重要的临床意义。目前临床上将所有能够水解第三代头孢菌素及碳青霉烯类抗生素的酶都称之为超广谱 - 内酰胺酶3 。所有的铜绿假单胞菌都能够表达由染色体介导的ampc 酶 ,ampc 酶的结构基因为ampc,位于染色体上。与其相近的ampr基因编码一个分子质量为31kda 调控蛋白的表达,即 amp r 蛋白 。此蛋白具有激活和抑制两种作用,控制着am pc基因的表达。amp r 为 lysr 受体家族,当诱导性

5、抗生素不存在时,在胞壁质前体尿苷二磷酸乙酰胞壁酸五肽的作用下,对am pc基因的表达起抑制作用。ampc 酶能水解几乎所有类型的- 内酰胺类抗生素,克拉维酸也不能抑制该酶的活性。铜绿假单胞菌对亚胺培南等碳青霉烯类耐药是ampc 酶与外膜蛋白o2prd (d2 孔蛋白 ) 的缺失协同作用的结果4 。2 改变抗菌药物作用的靶位铜绿假单胞菌通过改变靶位青霉素结合蛋白和dna 拓扑异构酶ii 的结构 ,对- 内酰胺类和喹诺酮类抗生素产生耐药。211 青霉素结合蛋白pbp是一组位于细菌内膜的蛋白质,对细菌细胞壁的合成 、 形态维持和糖肽结构调整等功能具有催化作用 。 - 内酰胺类抗生素通过抑制pbp而干

6、扰细菌细胞壁的合成,从而达到杀灭细菌的作用,因此 pbp是 - 内酰胺类抗生素的作用靶位。几乎所有的细菌都含有 pbp ,一种细菌通常含有48 种 pbps,分子质量在 35kda120kda 范围 ,习惯上按分子质量降序命名 。在同一种pbp 中 ,又细分出多种命名,如 pbpla?501?国外医药抗生素分册2004年5月第25卷第3期? 1995-2005 tsinghua tongfang optical disc co., ltd. all rights reserved.和 pbp1b 等铜绿假单胞菌pbp 类型与大肠埃希氏菌高度相似 。sds- page 电泳中铜绿假单胞菌表现有6

7、 个主要 pbp 区带和数个小的带型。在实验室菌株和临床分离菌中,均发现耐药铜绿假单胞菌中有pbp 改变现象的存在 。在染色体介导- 内酰胺酶缺失的铜绿假单胞菌中 ,通过分子生物学方法使pbp3 过度表达后,发现其对氨曲南、 头孢吡肟、 头孢磺啶和头孢他啶的m ic 上升 2 8倍 ,而对以 pbp1 为靶位的抗生素头孢噻啶 、 以 pbp2 为主要靶位的亚胺培南敏感性没有改变5 。在一株亚胺培南耐药的铜绿假单胞菌临床分离菌中 ,发现其耐药性与pbp4 的改变密切相关,并与膜通透性改变协同作用4 。铜绿假单胞菌的pbp5 具有- 内酰胺酶活性,能够降低青霉素的浓度。对作用于铜绿假单胞菌的- 内

8、酰胺类抗生素的敏感性和耐药性 ,pbp5 的 2内酰胺酶活性具有重要作用,pbp5缺失铜绿假单胞菌显示出高敏特性。2. 2 dna 拓扑异构酶ii 基因的突变喹诺酮类抗菌药是通过抑制dna 拓扑异构酶ii(dna 促旋酶 )和拓扑异构酶iv ,阻断 dna 的复制而产生抗菌作用。这种作用对细菌的选择性高,特别是氟喹诺酮类的出现,创造了合成抗菌药的新时代。但随着该类药物的广泛使用,细菌的耐药性也随之发生,严重影响其临床应用。大量的研究表明:细菌编码喹诺酮类药物作用靶位的dna 促旋酶和拓扑异构酶iv的基因突变,改变了酶的结构,使药物不能与酶-dna 复合物稳定结合是细菌对喹诺酮类药物的主要耐药机

9、制之一6 。2. 2. 1 dna 促旋酶dna 促旋酶为能量依赖性拓扑异构酶 ,由两对亚单位gyra 和 gyrb 组成 ,分别由gy ra、gyrb基因编码,gyra参与dna的断裂与重新连接 ,gyrb 参与 a tp 酶水解 ,提供反应的能量。kukeishi 等7 首先报道了gyra基因的突变,通过对铜绿假单胞菌的dna 促旋酶gyra基因的克隆并测序 ,发现了一个2769 bp 的开放阅读框架(orf) ,它编码一个由923 个氨基酸组成的蛋白,分子质量约103kda 。 用 pcr 扩增铜绿假单胞菌临床分离株的gyra基因上一段长为360bp的序列 (喹诺酮耐药决定区 ,qrdr

10、 ) ,发 现 gyra 有 三 种 突 变 方 式 : asp87 asn ,asp87 tyr 及 thr83 ile。takashi 等8 通过对临床分离株铜绿假单胞菌gyra基因的研究又发现了三种新的双突变现象,即 : thr83 ile 和 asp87 gly ;thr83 ile 和 asp87 asn ; thr83 ile 和 asp87 his。takenouchi 等进行非同位素单股构象多肽性分析和直接测序检测gyra点突变时 ,发现gyra的七种错义方式,其中包括 2 种以前未报道过的新的双突变,即 :ala67 ser和 asp87 gly ;ala84 pro 和 g

11、ln106 leu 。尽 管gyra基 因 的 突 变 方 式 多 种 多 样 , 但thr83 ile 仍为最主要的突变方式。2. 2. 2 dna 拓扑异构酶 对耐喹诺酮类药物的铜绿假单胞菌的研究主要集中于dna 促旋酶 ,对 dna 拓扑异构酶iv 的研究则鲜有进展。直到最近,dna 拓扑异构酶iv 才被认为是喹诺酮类药物作用的一个替代靶位 。多数喹诺酮类药物首先以dna 促旋酶为主要作用靶点,然而越来越多的研究表明某些抗菌谱增宽的新一代喹诺酮类药物对dna 促旋酶和dna 拓扑异构酶iv 有等同作用9 。李学如等10 对临床分离铜绿假单胞菌环丙沙星耐药株的拓扑异构酶gyra、gyrb、

12、parc和par e基因的喹诺酮类药物耐药决定区(qrdr) 基因突变与耐药性的关系研究结果表明,90 %以上的铜绿假单胞菌耐药株表现出拓扑异构酶 基因突变 。突变主要发生在gyra基因和parc基因上,其中gyra基因的第83位氨基酸密码子表现出高频突变,占拓扑异构酶基因突变的90 % ,parc基因第 80 位氨基酸密码子也表现出较高的突变,占拓扑异构酶基因突变的50 %。gyra基因和par e基因同时发生突变的变异株比只发生单突变(gyra或gyrb或parc或par e)的菌株对喹诺酮类药物有更高的耐药性,大都呈现较高水平的耐药 ;发生 3 点突变的变异株都是高水平耐药株。结果表明g

13、yra的突变是铜绿假单胞菌临床分离株对喹诺酮类药物的主要耐药机理,parc基因的突变只是使铜绿假单胞菌对喹诺酮类药物的耐药上升到更高的水平 。3 膜通透性障碍铜绿假单胞菌的天然多重耐药特点与细胞膜结构密切相关,细菌细胞膜对抗菌药物进入细菌具有阻碍作用 。铜绿假单胞菌l ps分子有 67 条脂肪酸链相互共价连接,使得膜流动性非常低,对药物的屏障作用十分强 。细菌细胞膜上镶嵌有孔蛋白( porin) ,在运输 、 交换细菌生命必须的物质的同时,小分子药物可以通过孔蛋白进入细菌内。但铜绿假单胞菌缺乏这种典型的通道,它的孔蛋白具有特殊性,在维持铜绿假单胞菌基本生理代谢的同时,即使小分子水溶性抗菌素通过

14、孔道的速度依然很慢,因而铜绿假单胞菌具有天然的多重耐药性。4 主动外排系统铜绿假单胞菌特殊的膜结构和低通透性不能完全?601?国外医药抗生素分册2004年5月第25卷第3期? 1995-2005 tsinghua tongfang optical disc co., ltd. all rights reserved.解释其固有的多重耐药性,因为许多对铜绿假单胞菌靶位可以产生作用的抗生素通过其细胞外膜的速率高于细菌生长的速率,但铜绿假单胞菌仍能够继续生长,因此推测可能有主动外排机制的存在。许多研究表明铜绿假单胞菌细胞膜上的许多蛋白的确具有将抗菌药物主动外排的作用,并与其细胞外膜的低通透性协同作用

15、 ,导致铜绿假单胞菌固有多重耐药2 。411 铜绿假单胞菌的外排泵铜绿假单胞菌细胞膜上的主动外排蛋白是导致铜绿假单胞菌对多种抗生素表现固有或获得性多重耐药的原 因 。这 些 蛋 白 包 括 : 转 运 抗 生 素 的 内 膜 蛋 白mexb 、 mexd 、 mexf 或 mex y; 控制抗生素进出细胞的外膜通道蛋白oprm 、 oprj 或 oprn ;连接膜与相关外排蛋白的膜连接蛋白mexa 、 mexc 、 mexe 或 mexx 。铜绿假单胞菌细胞膜上的这些主动外排蛋白组成四类主动外排系统,即 mexab - oprm 、 mexcd - oprj、mexef - oprn和mexx

16、y - oprm。mexab - oprm 主动外排导致野生型铜绿假单胞菌对四环素类、 氯霉素类 、 氨基糖苷类、 大环内酯类、- 内 酰 胺 类 和 喹 诺 酮 类 等 多 种 抗 生 素 产 生 耐 药 。mexcd - oprj 和 mexef - oprn 操纵子基因在一般的实验条件下并不表达,在铜绿假单胞菌的野生菌株中 ,不存在这两种主动外排系统,它们与铜绿假单胞菌的固有多重耐药性无关,但当其过度表达时,则参与铜绿假单胞菌的获得性多重耐药的形成11 。mexxy -oprm 目前发现它只能外排氨基糖苷类抗生素。41111 mexab - oprm 铜绿假单胞菌mexab - o2pr

17、m 外排系统是迄今为止最具有临床意义的药物外排系统 。由 3 个结构基因编码,mexa 是 40kda 的浆膜蛋白 ,起连接 mexb 和 oprm 的作用 ;mexb 是浆膜上108kda的蛋白,为跨膜的底物输出亚单位;oprm形成外膜通道并加速底物输出外膜。masuda 等12 首先发现一株 50kda 的外膜蛋白明显增加的铜绿假单胞菌变异株,该外膜蛋白即oprm ,其过度表达与铜绿假单胞菌对环丙沙星、 四环素等多种抗生素产生耐药,但是 ,oprm 不能单独起到外排抗生素的作用,外排泵的三 联 结 构 是 其 泵 出 底 物 抗 生 素 的 基 础 。最 近 ,wang13 评价了铜绿假单

18、胞菌外膜蛋白oprm的结构模式 ,他们认为oprm 与 tolc 在结构上相似,在 o2prm 模式中 ,oprm 将其序列线状排列成tolc 晶体结构 ,对 tolc 结构起重要作用的残基则在空间中呈现出保守性 。该模式使我们能够作出更多关于oprm 功能区及与之相关外排蛋白家族的假说。最近有研究表明mexab -oprm 的作用至少部分地依赖tonb 能量偶联蛋白 ,说明该外排泵的外膜组件可能由通道闸门控制 。mexab - oprm 生理条件下的阻遏蛋白为mexr基因所编码的产物, mexr的突变导致mexab - o2prm 脱抑制而表达增强,从而形成获得性耐药14 。41112 me

19、xcd - oprj li 等2 对铜绿假单胞菌突变株外膜蛋白分析表明,其上存在分子质量分别为50、46、 100kda的 3 个蛋白 ,后两者过度表达。这个系统与 mexab - oprm 类似 ,被命名为 mexcd - oprj。此后 ,naomasa等发现 mexcd - oprj 外排泵与铜绿假单胞菌对普通头孢类药物、 氟喹诺酮类药物及第四代头孢类药物的耐药性有关,而与羧苄青霉素及氨曲南的耐药性无关 。41113 mexef - oprn kohler 等15 发现用环丙沙星和氯霉素筛选出的多重耐药的铜绿假单胞菌也过度表达一个50kda 的外膜蛋白,western blot 分析表明

20、该蛋白是oprn ,系能量依赖的主动外排系统的一部分,存在3个orf ,这3个orf ,即mexe、mexf和o2prn 。类似于铜绿假单胞菌外排操纵子mexab - o2prm 和 mexcd - oprj 的组分 。41114 mexxy - oprm mexxy - oprm 存在于天然野生株铜绿假单胞菌中,mexxy 与 oprm 并不由同一操纵子所表达,但 mexxy 需要 oprm 的参与发挥外排功能 ,主要参与氨基糖苷类固有耐药性的形成。mexxy - oprm的作用底物也包括四环素类、 氯霉素类 、 大环内酯类、- 内酰胺类和喹诺酮类等多种抗生素16 。目前还不断有其他类型的铜

21、绿假单胞菌主动外排系统被发现的报道17 ,搜寻铜绿假单胞菌基因文库发现 ,该菌至少有12 种主动外排系统。目前很难推测其他外排系统是否与细菌的耐药性有关。5 细菌生物膜细菌生物膜是近年来引起国内外学者高度重视的一种细菌群体生物学特性,是细菌吸附于惰性或活性材料表面形成的,由细菌和它所分泌的胞外多聚物组成的外观呈膜状的多菌集合体(community ) ,是细菌在生长过程中,为了适应生存环境而形成的一种与游走细胞相对应的存在形式,由细菌和它所分泌的胞外多聚物如胞外多糖等组成。进年来研究表明,65 %以上的人类细菌感染与生物膜有关,铜绿假单胞菌极易形成生物膜18 。细菌生物膜具有极强的耐药性和抵抗

22、机体免疫系统作用的能力,由已形成生物膜的细菌感染的组织和污染的生物材料,即使使用正常剂量成百倍的药物也难以治愈,最终导致病人系统性衰竭,危及生命 。细菌生物膜表现出的这种极强耐药性的机理目前?701?国外医药抗生素分册2004年5月第25卷第3期? 1995-2005 tsinghua tongfang optical disc co., ltd. all rights reserved.还不十分清楚,有渗透限制 、 营养限制和表型推断三种学说 。渗透限制学说认为19 ,细菌生物膜对抗菌剂的不敏感性是由于生物膜内细菌分泌的胞外多聚物被膜所形成的屏障,阻止了抗生素的穿入。这一假说被许多研 究 者

23、 所 接 受 ,并 被 一 些 研 究 所 证 实 。但 正 如stewart 所指出 ,对多数抗生素来说,渗透限制还不足以解释生物膜的耐药性。营养限制学说认为,生物膜内细胞 ,至少是部分细胞,由于受到营养供给的限制,处于缓慢生长或饥饿状态,这种状态的细胞对抗生素不敏感 ,或者使对只杀伤处于分裂状态的细胞的抗生素难以发挥作用。但 karen 认为 ,该假说很难对生物膜引起的顽固性难治感染做出满意的解释,如果该假说成立 ,那末生物膜顶部具有代谢活性的细胞就能被杀菌剂所杀死,之后 ,原来位于次层的受到营养限制处于缓慢生长或不生长的细胞,就成为生物膜顶部细胞,重新具有代谢活性,可被杀菌剂杀死。这样生

24、物膜内层细胞就会逐步被消灭,最终细胞全部被消灭,生物膜消失 。显然 ,这与实际情况不符。表型推断学说认为,细菌生物膜表现出的抗药性可能是生物膜内细胞,至少某些细胞采用一种与游走细胞不同的具有保护作用的生物膜表型,这种表型不是对营养限制的一种反应,而是细菌附着在表面的一种生物学反应,细菌的一些新基因表达产物对生物膜的抗药性起着关键作用。表型推断学说从基因一表型角度来解释其抗药性,涉及到细菌生物膜抗药性的实质20 。虽然上述三种学说都被一定的实验所证实,但都不足以全面揭示生物膜的耐药性 。细菌生物膜引起的难治性感染的防治是临床上亟待解决的问题之一21 。人类对单个细菌所引起的感染的研究已经很深入,

25、但对细菌生物膜的了解才刚刚开始,还有许多有关细菌生物膜的基础问题有待解决,尤其需要搞清细菌生物膜形成的遗传物质基础,搞清细菌生物膜的耐药机理,寻找其薄弱环节,以便研究出更好的目前又迫切需要的处理方法。近年来的研究标明 ,由于细菌生物膜的信号传递系统对生物膜的形成和生物膜结构的稳定起着关键性作用,该信号传递系统被认为是消灭细菌生物膜最有希望的突破口22 。6 结语铜绿假单胞菌对抗生素的耐药往往不是由单一因素造成的 。产生灭活抗生素酶或修饰抗生素酶;改变抗菌药物作用的靶位;形成膜屏障;主动外排等机理之间可以发生协同作用。细菌群体的生物膜耐药与多种耐药机理相关。有关铜绿假单胞菌的耐药性,仍存在许多问

26、题有待进一步探索,如生物膜形成的机理、 主动处排系统的作用方式,各外排系统之间的相互关系等等 。同时 ,细菌耐药性的传播影响着铜绿假单胞菌感染的临床治疗,虽然铜绿假单胞菌中质粒含量很少,噬菌体引发的耐药性传播在铜绿假单胞菌临床分离菌中已有报道 。综合评价耐药铜绿假单胞菌临床分离菌的耐药性 ,分析总结其耐药规律和特点,可以指导临床合理使用抗生素,开发新的抗铜绿假单胞菌药物。铜绿假单胞菌耐药性防治还需要深入研究,寻找能够拮抗细菌生物膜形成和主动外排的抗菌药物是今后必须解决的问题和研究方向。参考文献1 stove ck , pham qx , erwinal , et al . complete g

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