碱性蛋白酶菌株的分离鉴定

1、产碱性蛋白酶菌株的分离鉴定 摘 要：碱性蛋白酶是一类重要的工业用酶，广泛应用于食品、医药、洗涤剂、皮革、酿酒等行业。本文综述了产碱性蛋白酶菌株的研究现状，包括生产菌株的来源、菌株的分离方法以及菌株的鉴定方法，并对其前景进行展望。 关键词：碱性蛋白酶、菌株、分离、鉴定 Isolation and Identification of Alkaline Protease-producing Strains Wensi Hou (Yanshan university , Liren college , Hebei 066004)Abstract：Alkaline protease is a group

2、 of important industrial enzyme and has been widely applied in food industry, medical treatment, detergent industry, leather producing, brewing and other fields. This paper reviews the research status of alkaline protease producing strains, including the methods of isolated strains, strain sources a

3、nd methods of identified strains. This paper also discusses its prospect.Key words:Alkaline protease ; strains ; isolation ; identification1碱性蛋白酶1.1简介碱性蛋白酶(alkaline protease) 是一类适宜于在碱性条件下水解蛋白质肽键的酶类, 是一类非常重要的工业用酶, 广泛存在于动、植物及微生物生物体中, 在猪的胰脏中最早被发现。碱性蛋白酶在食品、洗涤及制革等行业中有着广泛的用途。微生物蛋白酶均为胞外酶，它的处理技术相对简单、价格低、来源广

4、、菌体易培养、产量高、高产菌株选育简单快速、具有动植物蛋白酶的所有特性，以与工业化生产。近几年，碱性蛋白酶的研究有很大的进展，取得了许多可喜的成果，及时的转化成生产力，有很大的社会和生产效益。1.2碱性蛋白酶的理化性质微生物的碱性蛋白酶的活性作用范围在PH值7-11之间，在酪氨酸中最适范围为9-11之间，它可以水解肽键、酰胺键、醚键以及转酯、转肽等。多数微生物产生的碱性蛋白酶耐热性差，我国生产的几种碱性蛋白酶耐热温度均在60以下。碱性蛋白酶的分子量一般在2.0-3.4万之间，等电点多为8.0-9.0，能作用于多数肽链，水解肽键生成二肽类物质。其除酶本身的氨基酸残基外,不具有特定的活性基团,因此

5、,一些金属离子(Fe2+,Mn2+,Mg2+,Zn2+等)对酶有激活作用。碱性蛋白酶属丝氨酸蛋白酶,具有蛋白质的基础生化性质,一些生化物质均能引起其变性失活,一些天然植物中也有蛋白酶抑制剂1。1.3碱性蛋白酶的应用碱性蛋白酶主要应用于食品、洗涤及制革等行业中，微生物蛋白酶均为胞外酶，它的处理技术相对简单、价格低、来源广、菌体易培养、产量高、高产菌株选育简单快速、具有动植物蛋白酶的所有特性，以与工业化生产。近几年，碱性蛋白酶的研究有很大的进展，取得了许多可喜的成果，及时的转化成生产力，有很大的社会和生产效益。1.3.1碱性蛋白酶在食品中的应用碱性蛋白酶在食品加工方面主要用于蛋白的降解和修饰，使蛋

6、白变成可溶性的肽而被提取；它可以对小麦的谷蛋白进行限制性的降解修饰，可以增加面团的韧性和机械强度；血液中2/3的蛋白质存在于血细胞是血红蛋白，血红蛋白消化吸收利用率低，用碱性蛋白酶水解血红细胞，可以提高蛋白质利用率2。1.3.2碱性蛋白酶在洗涤用品中得到广泛的应用。加酶洗衣粉中的碱性蛋白酶制剂可以使奶渍、血渍等多种蛋白质污垢降解成易溶于水的小分子肽。用于洗涤剂工业的碱性蛋白酶主要以固体制剂的形式添加到洗衣粉中。为满足市场需要将酶加到洗衣液中。但由于在产品中的稳定性问题未能很好解决，影响了加酶液体洗涤剂、加酶洗衣皂等产品的生产应用。综合分析，对酶制剂影响较大的因素包括产品中的表面活性剂组成、pH

7、值、储存温度、水分含量、金属离子含量、酶制剂的稳定助剂等。通过研究证实减少加酶皂体系中的水分含量可显著延长样品酶活力的储存时间。硼砂和甘油作为蛋白酶稳定助剂能显著延长样品酶活力的储存时间。加酶皂所用原料的前期处理不能忽视，应避免使用吊白块及强氧化性物质，慎重选用螯合剂种类及加量。通过采取综合措施，为酶制剂构造合适的生存环境，酶制剂可以在洗衣皂中得到成功应用。现在一些大型洗涤用品生产工业用的是“复合酶体系”3。1.3.3 碱性蛋白酶在羊毛制品中的应用酶脱毛具有简化生产工艺、缩短周期、提高成品质量、增加得革率、降低生产成本、改善劳动条件与环境卫生，变污水为农业肥等优点 。但是酶处理时不仅羊毛表层蛋

8、白质会水解，而且反应也深入其内部。对酶而言要分解覆盖在羊毛表面最外层含高交键度的胱氨酸鳞片层及疏水性外层角质细胞要比分解内层及细胞膜复合体(CMC)困难得多。因此在酶处理过程中，酶对羊毛内层分解损伤所引起的副作用已大大超过了酶处理的目标值 剥鳞和削棱。如何将酶的水解作用最大限度地限制在羊毛纤维表面，是当今科研攻关的首要问题。经研究发现，一种新型海洋碱性蛋白酶YS-894-122在处理羊毛方面可以较好的水解磷脂层，而对皮质层的损害比较轻微，表现出良好的处理羊毛特性及发展潜力4。1.4 生产菌株的种类 碱性蛋白酶广泛存在于细菌、放线菌和真菌中，主要有芽孢杆菌（包括嗜碱性芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、

9、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、马铃薯芽孢杆菌、短小芽孢杆菌）、链霉菌(如灰色链霉菌、费氏链霉菌等)、一些真菌（如酵母）以及一些革兰氏阴性菌5。生产菌株还分为高温菌、低温菌和中温蛋白酶。高温菌可以从高温堆肥或废水污泥中筛选出来的产高温碱性蛋白酶菌株，其发酵所产的蛋白酶具有良好的热稳定性和酸碱稳定性，并对表面活性剂、温和型去垢剂有超强的耐受性，具有巨大的潜在应用价值。低温蛋白酶具有低温易反应，高效活力，热损失少等优点，因此，在食品、环境修复、化妆用品、医药等领域有着中温蛋白酶无法比拟的优越性。1.5碱性蛋白酶工程菌的选择目前研究较多的碱性蛋白酶表达系统有三种:酵母系统、大肠杆菌系统和枯草芽孢杆菌系统

10、。酵母菌系统:巴斯德毕赤酵母(Pichiia pastoris)是甲醇营养型酵母表达系统中发展较为完善的一种,其作为表达外源蛋白宿主菌的优点是:具有调控外源基因的表达强启动子;可以修饰和加工表达的蛋白,使其有活性;同时生长快,易于培养,适应工业化批量生产;自身分泌的蛋白种类少,利于纯化。大肠杆菌系统:大肠杆菌易培养、转化效率高、生长繁殖快、培养基价格低廉,可以快速生产大量的蛋白酶。它对外源基因产物的表达水平高于其他表达系统,因此是目前应用最广泛的蛋白酶表达系统。Fu克隆了嗜热脂肪芽孢杆菌的耐热碱性蛋白酶基因,并成功转入大肠杆菌,直接将重组酶分泌到培养基中6。刘新育从枯草芽孢杆菌A-109中扩增

11、碱性蛋白酶基因后,在大肠杆菌中获得表达,并表现出蛋白酶活性7。芽孢杆菌系统:芽孢杆菌具有良好的分泌特性,其发酵工艺和产物回收技术也较成熟,故广泛用作外源蛋白的分泌型宿主菌。短小芽抱杆菌胞外分泌能力较强,然其分泌的蛋白酶的活性却很弱。短小芽孢杆菌HPD31的所产胞外蛋白酶活性几乎无法检测到,短小芽孢杆菌47的所分泌的蛋白酶酶性只是芽孢杆菌的1.6%。目前许多已成功构建的有效的外源蛋白分泌载体,都是利用短小芽孢杆菌的优点8。2产碱性蛋白酶菌株的分离鉴定2.1菌株的来源土壤中和海洋中存在大量的产碱性蛋白酶菌株，实验菌株可以从土壤和海洋中分离。2.2菌株的分离产碱性蛋白酶的分离方法主要是透明圈法进行初

12、选和发酵产酶法进行复筛复选。产碱性蛋白酶芽孢杆菌的筛选常用的是透明圈法进行初筛,透明圈法方法简单，但是只是初步筛选出产碱性蛋白酶菌株。发酵产酶法进行复选，对菌株进行液体培养，分离出酶进行检测，低温碱性蛋白酶活性采用紫外法测定 ，对照氨基酸标准曲线换算出酪氨酸的量9。还有福林一酚法测定10。用发酵产酶法可以筛选出高产菌。菌株可分为高温、中温和低温，选出高温菌株要在初选时在50下培养，中温菌株在37下培养，低温菌在15-20之间培养。2.3菌株的鉴定菌株的鉴定分四种种方法：形态学鉴定、分子生物学鉴定、生理学鉴定、Biolog全自动菌种鉴定仪鉴定11。2.3.1形态学鉴定 菌落形态观察平板上单菌落形

13、状、大小、颜色与突起特征。细胞形态光学显微镜观察菌体的形态、大小、运动性等。革兰氏染色菌体红色为革兰氏染色阴性,蓝紫色为革兰氏染色阳性。芽抱染色观察,芽胞色,菌体颜色。形态学鉴定根据细胞菌落的形态检测所属菌属。2.3.2分子生物学鉴定测定16SrRNA，根据16S rRNA测序结果，确定菌属。分子鉴定方法的准确性很高。2.3.3生理学鉴定主要进行耐盐性实验、最适温度实验、甲基红(M.R)实验、V.P实验、石肖酸盐还原试验、酪素水解实验、H2S产生试验12。通过菌的生理学特征来鉴定所属菌属，这种方法相似性不高。3相关研究刘向宇从茶籽油榨油作坊中榨油机周围的油泥与土壤中用透明圈法分离出产碱性蛋白酶

14、的单一菌株，经过形态学鉴定和生理学鉴定，鉴定出SJP-5，它的特征性质接近于枯草芽抱杆菌种1。杨成业从黄海底泥分离出一株产低温蛋白酶的的菌株HW08。经过16SrDNA及生理生化鉴定为Pseudomonas lundensis12。郑朝成从污泥中分离到的这一株具有高蛋白酶活性的菌株TC16，通过形态学、生理生化指标和16S rRNA系统发育树构建等对其进行了鉴定，发现菌株 TC16 与解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens NBRC15535 16SrRNA的同源性最高，通过遗传距离分析其相似度为99.6，虽然 TC16生理性质与 NBRC15535 几乎相同，但生

15、化性质却相差较大，就细菌的鉴定角度而言，现在普遍采用形态学指标结合分子生物学鉴定来进行综合鉴定，可将其归类于芽孢杆菌菌株 NBRC1553513。成堃,路福平.从盐碱地的土壤中分离出5株分泌碱性蛋白酶的芽孢杆菌属菌株TCCC1 1001、TCCC1 1004、TCCC1 1013、TCCC1 1024、TCCC1 1029。经16srRNA鉴定，TCCC1 1001、TCCC1 1024为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，TCCC1 1004为嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alcalophilus)，TCCC11013为短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)，TCC

16、C1 1029为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)。通过测定5株菌分泌的蛋白酶最适作用温度发现，5种碱性蛋白酶均为中温酶，而最适作用pH值为9.0-11.0。碱性蛋白酶在碱性条件下具有较好的催化能力，其最大用途是作为洗涤添加剂14。4结论通过相关研究得出用透明圈法可以粗略的分离出产碱性蛋白酶的菌株，用发酵产酶法可以筛选出高产菌。对菌株的鉴定分子学鉴定的方法比较准确，Biolog全自动菌种鉴定仪鉴定快速简捷。参考文献1 刘向宇. 一株碱性蛋白酶产生菌的分离与应用D. 湖南农业大学, 2011.2 夏凡, 琚争艳. 微生物碱性蛋白酶在食品工业中的应用及其安全性研究进展J.

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18、urification of a heat-stable alkaline proteaseJ. Protein Expression and Purification, 2003, 28: 63-68.7 刘新育, 张品品, 李林珂. 枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶基因的克隆和表达J. 生物技术, 2007, 17: 13-16.8 徐雅芫. 碱性蛋白酶产生菌筛选及其apr基因表达与酶学特性的研究D. 安徽农业大学, 2012.9 全桂静, 尹黎献. 低温碱性蛋白酶高产菌株的选育与发酵条件研究J. 沈阳化工大学学报, 2011, 2(25): 117-120.10 王伟, 王世英, 李佳. 高产蛋白酶菌株的分离、筛选及鉴定J. 广东