检验技术PPT课件

1、一、显微镜一、显微镜 普通光学显微镜（light microscope）0 .2m 0 .2mm （油镜）国产显微镜的油镜常标有“油”字，国外产品则常用“oil”（oil Immersion）或“HI”（Hemcyeneous Immersion）字样，以供识别 第1页/共86页一、显微镜一、显微镜 暗视野显微镜( dark - field microscope ) 钩端螺旋体聚光器不同用途：观察不染色标本活菌的形态、运动方式, 特别适合不染色螺旋体的检查 第2页/共86页一、显微镜一、显微镜 相差显微镜（phase contrast microscope ）用途：观察活细胞和未染色的生物标本

2、 相差物镜环状光阑合轴调中望远镜绿色的滤光片 第3页/共86页二、不染色检查二、不染色检查 观察活体细菌的形态、大小、某些内部结构及运动方式, 但主要用于观察细菌的动力。 悬滴法 压滴法 注意事项：应选用新鲜幼稚的细菌培养物 观察时应在20 以上的室温中进行 细菌的真正运动和布朗运动的区别 第4页/共86页三、染色检查法三、染色检查法 （一）常用的染料(1 )单纯染料 多为偶氮化合物, 化学亲和力低, 不能与被染物结合形成盐类, 不溶于水,但溶于脂溶剂, 其染色能力取决于能否溶于被染物, 如苏丹染料。(2 )酸性染料 电离后带色离子带负电荷, 可与带正电荷的物质结合。通常细菌均带负电荷, 故不

3、易着色。如降低菌液的pH , 使其带正电荷则可着色, 酸性染料如伊红、刚果红等。(3 )碱性染料 多以氯化物形式存在, 电离后带色离子带正电荷, 易与带负电荷的物质结合而着色。由于细菌的等电点较低( pH2pH5)故在中性、碱性或弱酸性溶液中均带负电荷,因而易与带正电荷的碱性染料结合。碱性染料如亚甲蓝、结晶紫和碱性复红等。(4 )复合染料 是碱性染料与酸性染料的复合物, 故又称为中性染料。如姬姆萨染料、瑞氏染料等。第5页/共86页三、染色检查法三、染色检查法（二）常用的染色法(1 )单染色法 是用一种染料染色的方法, 如用美蓝或稀释石炭酸复红等, 使各种细菌均染成同一颜色, 故此法只能显示细菌

4、的形态及大小, 对细菌鉴别价值不大。(2 )复染色法 是用两种以上染料染色的方法, 此法除显示细菌形态大小外, 还有鉴别细菌种类的价值, 因此也称鉴别染色法。(3 )特殊结构染色法 细菌的某些结构, 如鞭毛、荚膜、细胞壁、芽孢及异染颗粒等, 用普通染色法不易着色, 故需用特殊染色法。这些染色法不仅能使特殊结构着色, 还可使特殊结构染成与菌体不同的颜色, 有利于观察。在细菌检验工作中, 除异染颗粒染色法较常用外, 由于其他特殊结构染色操作费时, 故日常检验工作中较少使用这些特殊染色法。第6页/共86页三、染色检查法三、染色检查法（二）常用的染色法(4 )负染色法 是指背景着色而细菌本身不着色的染

5、色方法, 常用的有墨汁, 也可用酸性染料, 如刚果红或水溶性苯胺黑等, 因酸性染料带阴电, 故菌体不着色, 只能使背景着色。实践中常用墨汁负染色法配合单染色法(如美蓝)检查细菌的荚膜, 背景呈黑色, 菌体染成蓝色,荚膜不着色, 包绕在菌体周围成为一层透明的空圈。(5 )荧光染色法 用荧光染料, 如金胺、吖啶橙等进行染色。此类染料分为酸性染料及碱性染料两种, 易溶于水中, 离解出OH - 或H + 离子, 荧光染料在紫外线照射下, 能激发荧光。细菌用荧光染料着色后在荧光显微镜下检查, 可在黑的背景中观察到细菌发出的明亮荧光。第7页/共86页三、染色检查法三、染色检查法（三）鉴别染色 1、革兰染色

6、法 第8页/共86页三、染色检查法三、染色检查法（三）鉴别染色 2、抗酸染色1 1）初染）初染用玻片夹夹持涂片标本，滴加石炭酸复红2-3滴，在火焰高处徐徐加热，切勿沸腾，出现蒸汽即暂时离开，若染液蒸发减少，应再加染液，以免干涸，加热3-5分钟，待标本冷却后用水冲洗。 2 2）脱色）脱色3%盐酸酒精脱色30秒1分钟；用水冲洗。 3 3）复染）复染用碱性美兰溶液复染1分钟，水洗，用吸水纸吸干后用油镜观察。 第9页/共86页第10页/共86页第三节 细菌的分离培养方法Bacterium culture 目的：为了从样本中获得活的纯化的细菌，以便作进一步的研究和鉴定。第11页/共86页 培养基制备 细

7、菌接种方法 细菌培养方法 细菌的生长现象第12页/共86页一、培养基制备一、培养基制备 培养基（culture medium）是指人工配制的供细菌生长繁殖需要的各种营养物质配制而成的基质。（一） 培养基的种类（二）培养基的主要成分及其作用第13页/共86页（一）（一） 培养基的种类培养基的种类1、按用途分类1) 基础培养基： 如普通肉汤、营养琼脂等。2) 营养培养基： 如血液琼脂培养基、血清肉汤培养基等。3) 增菌培养基： 多为液体培养基, 主要目的是为了增加标本中目的菌的数量, 以提高目的菌检出率所用的培养基。该类培养基内一般均含有抑制剂, 且具有选择性抑制作用的抑制剂。4) 选择性培养基：

8、 在培养基中加有除营养成分以外的抑制物质, 使之具有选择性, 有利于目的菌的检出和识别, 而抑制其他非目的菌的生长或使其生长不佳。此类培养基多为固体培养基, 如HE培养基等。5) 鉴别培养基: 主要供细菌生化反应试验用, 此类培养基中加有某些特定成分, 如糖、醇等, 用于检查各种细菌的生化反应, 以鉴别和鉴定细菌, 如糖发酵培养基、七叶苷培养基等。6) 专用培养基: 有的细菌在培养中需要一些特殊的物质供其生长繁殖, 对于这类细菌应用专门的培养基进行培养。如培养结核分枝杆菌的罗氏培养基, 培养厌氧菌的庖肉培养基等。第14页/共86页（一）（一） 培养基的种类培养基的种类2、按物理性状分类 液体培

9、养基： 用于增菌, 做生化试验 半固体培养基： 用于观察细菌的动力、保存菌种用 固体培养基： 用于分离培养。分为平板、斜面、高层及高层斜面3 、按成分分类1) 合成培养基： 合成培养基是由化学物质和成分已知的各种物质所组成,。由于所用物质是已知的, 因此, 各批培养基的性质是一致的。所以, 在研究细菌的营养要求、代谢、分类鉴定、生物量测定、菌种选育、遗传分析及药物对细菌的作用等, 宜用合成培养基。2) 天然培养基： 天然培养基指培养基由含有的化学成分不完全清楚, 或各批物质的成分很难一致的天然物质所组成, 如蛋白胨、牛肉膏、血液、鸡蛋、马铃薯等。但这些物质成本较低,在细菌学研究中, 一般均以这

10、种培养基为常用。第15页/共86页（二）培养基的主要成分及其作用（二）培养基的主要成分及其作用1、营养物质（1）蛋白胨 蛋白胨是培养基中作为氮源应用最广泛的基本成分，用于合成菌体蛋白质,酶类以及细菌的生长繁殖。特点：易溶于水, 吸水性强；具有缓冲作用。（2）肉浸液 可作为细菌的氮源和碳源。但因含氮物质较少, 尚不能满足细菌生长的需要。因而在制作培养基时, 一般需加入1%2%的蛋白胨及0 .5%的氯化钠。（3）牛肉浸膏 肉浸液加热浓缩而成的膏状制品。肉浸液中的不耐热物质如糖类等已被破坏, 因而其营养价值不及肉浸液, 但因其不含糖, 故可作为肠道细菌鉴别培养基的基础成分。由于牛肉浸膏使用方便, 所

11、以常用于制备培养基。 第16页/共86页（二）培养基的主要成分及其作用（二）培养基的主要成分及其作用1、营养物质（4) 糖类 糖类是作为细菌生长繁殖所需的碳源、能源的基本成分。最常用的是葡萄糖和蔗糖。其他的糖类和醇类主要用于发酵反应以及鉴定细菌。糖不耐热, 过久的高热会被破坏,在碱性及与氮源一起高温的情况下, 破坏更快, 因此, 制备这类培养基时, 通常不用高温, 并与培养基中其他成分分别灭菌。（5)血液 培养基中加入血液, 可增加蛋白质、多种氨基酸、糖类、无机盐等营养成分, 同时还能提供辅酶(如V 因子)、血红素(X 因子)等特殊生长因子, 供某些对营养要求高的细菌生长繁殖之用。此外, 血液

12、在培养基中还可以用于测定细菌的溶血作用,作为细菌鉴定的一项指标。（6）鸡蛋和动物血清 鸡蛋和动物血清不是培养基的基本成分, 但对一部分细菌来说是必需的营养成分, 他们可以作为养料直接被细菌利用。故可利用此制备特殊的培养基, 如培养结核杆菌的罗氏培养基和白喉棒状杆菌的吕氏血清培养基等。此外, 鸡蛋和血清还具有凝固剂的作用, 便于观察细菌的菌落形态和生长情况。第17页/共86页（二）培养基的主要成分及其作用（二）培养基的主要成分及其作用1、营养物质（7） 生长因子 在细菌生长繁殖过程中, 需要多种维生素等生长因子, 根据化学结构及代谢功能, 可将其分为三大类, 即维生素、氨基酸和嘌呤、嘧啶。细菌对

13、这些物质的需要量不大, 但如缺少, 某些细菌就不能生长。通常在肝浸液、肉浸液、酵母浸液和血液中含有这些生长因子的大部分, 但有时需要另外加入。（8） 无机盐类 细菌生长繁殖需要多种无机盐类, 如钾、钠、镁、铁、磷酸盐、氯化物等。其中, 有的需要量极微, 如锰、钴、钙、铜等。这些无机离子的作用是，作为酶的激活剂和维持一定的渗透压，或具有缓冲作用。2、水分 蒸馏水、去离子水或自来水。第18页/共86页（二）培养基的主要成分及其作用（二）培养基的主要成分及其作用3、凝固物质 最常用的是琼脂, 特殊目的也用明胶等。琼脂是从石花菜等海藻中提取出来的一种胶状物质, 其化学成分主要为多糖类, 一般不被细菌分

14、解利用, 故无营养价值, 纯属培养基中的赋形剂。4、抑制剂和指示剂 抑制剂的作用。常用的抑制剂有胆盐、煌绿、玫瑰红酸、亚硫酸钠、四硫磺酸盐、叠氮钠及一些染料和某些抗生素等。在选择抑制剂时需注意抑制剂应是具有选择性的抑制作用。 指示剂的作用。为了方便了解和观察细菌是否利用和分解培养基中糖(醇)类物质, 而在培养基中加入的成分。常用的指示剂多为酸碱指示剂, 如酚红、溴甲酚紫、溴麝香草酚蓝、中性红、甲基红、酸性复红等。根据细菌分解糖( 醇)类物质产酸的情况, 选择适当的指示剂, 亚甲蓝为常用的氧化还原指示剂。此外, 一些新的氧化还原指示剂如四氮唑盐类等, 也已广泛用于细菌快速培养和鉴定, 以及快速药

15、敏试验方面。第19页/共86页（三）制备培养基的一般程序（三）制备培养基的一般程序无菌试验标准菌株验证保存第20页/共86页二、细菌接种方法二、细菌接种方法 待检标本的性质不同, 培养的目的及所用培养基的种类不同 （一）平板划线接种法（二）斜面接种法（三）半固体培养接种法（四）液体培养基接种法第21页/共86页（一）平板划线接种法 是常用的分离培养方法, 其目的就是使标本或培养物中混杂的多种细菌在培养基表面分散生长, 各自形成彼此分开的菌落, 以便根据菌落的形态和特征, 挑选所需的单个菌落, 经移种获得纯种细菌。 曲线接种法 分区划线接种法 棋盘格划线接种法 平板涂布接种法第22页/共86页二

16、、细菌接种方法二、细菌接种方法（二）斜面接种法 常用于细菌的传代、纯培养、菌种的保存及细菌的某些鉴别试验。 划线接种法 穿刺划线接种法 第23页/共86页二、细菌接种方法二、细菌接种方法（三）半固体培养基接种法 用于观察细菌动力和保存菌种 （四）液体培养基接种法第24页/共86页三、细菌培养方法三、细菌培养方法温度需氧培养法二氧化碳培养法厌氧培养法气体CO2 孵箱法烛缸法化学法第25页/共86页四、细菌的生长现象四、细菌的生长现象（一）细菌在固体培养基上的生长现象 1、细菌在营养琼脂平板上的生长现象1) 菌落形状 为菌落的几何形状及表面隆起情况, 如圆形、不整形、扁平、凸起、凹面等。2) 菌落

17、大小 以毫米(mm) 计算。3) 表面性状 光滑、粗糙、有无光泽等。4) 边缘情况 整齐、不整齐、锯齿状等。5) 颜色 白色、黄色、无色、灰色等。6) 透明度 透明、不透明、半透明等。7) 质地 硬、软、脂状、磨状等。8) 粘度 奶油状、粘液状、膜状易碎等。9) 乳化性 指在生理盐水中, 将一菌落在盐水中研磨形成均匀乳状或为颗粒状的程度。 第26页/共86页四、细菌的生长现象四、细菌的生长现象（一）细菌在固体培养基上的生长现象2、细菌在鉴定培养基上的特征（1）血平板 按溶血情况分类， 根据链球菌在血琼脂平板上溶解红细胞的能力分为甲型()乙型()丙型()链球菌三大类。 第27页/共86页四、细菌

18、的生长现象四、细菌的生长现象（一）细菌在固体培养基上的生长现象2、细菌在鉴定培养基上的特征（2）卵黄琼脂产气荚膜梭菌产生卵磷脂酶将可溶性的磷脂酰胆碱分解生成磷酸胆碱和不溶性甘油酯形成乳白色的混浊带。 肉毒梭菌可产生脂酶，作用于卵黄中的游离脂肪，产生甘油和不溶性的游离脂肪酸，在菌落周围培养基中形成局限的不透明区，并在菌落表面产生一层珠光层（为一薄脂肪酸，其融点在37以下，不能进入培养基，只能漂浮在菌落表面）第28页/共86页四、细菌的生长现象四、细菌的生长现象（一）细菌在固体培养基上的生长现象2、细菌在鉴定培养基上的特征（3) 蛋白水解作用 在菌落周围出现清晰的环。（4) 色素 细菌在生长过程中

19、可产生色素, 水溶性色素溶在培养基中, 如绿脓色素、荧光色素等, 使培养基着色, 而脂溶性色素则使细菌菌落着上颜色, 如金黄色葡萄球菌的金黄色菌落。（5) 气味 有些细菌在生长过程中可产生气味, 再结合细菌的生活特性, 有助于细菌的鉴定。能产生特殊气味的细菌有: 假单胞菌属细菌可产生葡萄汁气味; 变形杆菌产生巧克力烧焦的臭味; 链球菌产生地窖里的霉臭; 梭菌可产生粪臭、腐败味; 产黑色素类杆菌属细菌产生辛辣味等。第29页/共86页四、细菌的生长现象四、细菌的生长现象（二）细菌在液体培养基上的生长现象(1 )发育程度 有无生长及生长程度, 以微弱、中等、旺盛来表示。(2 )浑浊度 有无浑浊以及浑

20、浊的程度( 一般以混、中等、微浑、透明表示) ; 均匀浑浊、有颗粒; 絮状生长。(3 )液体表面性状 有无表面生长以及生长的性状, 如膜状( 厚薄)、环状、皱状、是否光滑或呈颗粒状。(4 )其他 有无色素, 有无气味, 有无产酸情况, 有无气体产生。第30页/共86页四、细菌的生长现象四、细菌的生长现象（三）细菌在半固体培养基上的生长现象 主要用于细菌动力的观察, 有动力的细菌除在穿刺线有生长外, 在穿刺线的周围均可见浑浊和细菌生长的小菌落; 无动力的细菌仅在穿刺线上有生长, 周围的培养基透明清晰。 第31页/共86页第七节 细菌数量的测定物理计数法生物计数法 细菌数量的测定不仅可用于了解样品

21、被细菌污染的程度, 判断样品的卫生状况, 确定食物中毒的种类, 也可用于确定实验菌的浓度, 以便进行各种实验, 如细菌的药物敏感实验、消毒剂的鉴定等。 第32页/共86页一、物理计数法一、物理计数法（一）Breed 计数法 每毫升菌数=N4104 d2式中N: 每视野所数平均菌数。d: 视野直径。（二）比浊管计数法 第33页/共86页一、物理计数法一、物理计数法（三）分光光度计测定法 每种细菌细胞能吸收和散射通过它们的光, 每种菌的散射光强及吸收光度与细胞总数有相对应的关系。菌体愈多, 菌悬液浊愈大, 散射及吸收光愈多。利用分光光度计测定菌悬液减少光线透过的程度, 用吸光度( A) 表示 第3

22、4页/共86页二、生物计数法二、生物计数法 生物计数法是利用各种培养方法检测样本中细菌的数目, 又称活菌计数法。假定每一个存活细菌发育成一个菌落, 则计数培养基上生长的菌落数即为样品中活菌数。 （一）半定量计数法 本法是供尿液半定量细菌计数用。取未经沉淀的尿液0 .01ml 或0 .001ml 于定量接种环上, 在琼脂平皿中心划一条线, 在初次划线的基础上成直角均匀的连续划线涂布培养物, 然后使平皿转动90o 再划线, 接种物完全覆盖琼脂表面。第35页/共86页二、生物计数法二、生物计数法（二）倾注平板法 （三）旋管计数法 本法是将稀释好的样本接种于装有溶化培养基的试管(或小瓶)内, 然后作水

23、平转动使培养基凝固, 经孵育后计数菌落。具体操作如下:在25ml 螺帽试管(或小瓶) 中装2ml4ml 培养基(培养基应比平常多加0 .5%1%的琼脂) , 在水浴中融化并冷却至45 , 取稀释样液0 .1ml 加入培养基管中, 然后进行水平旋转, 直至琼脂在管壁凝固成均匀的薄层。然后倒置孵育, 使冷凝水集于颈部, 避免菌落在琼脂表面蔓延。计数时, 沿培养管的长轴平行划一线, 旋转试管, 在低倍镜下进行计数。 第36页/共86页二、生物计数法二、生物计数法（四）滴液计数法（五）琼脂表面计数法 第37页/共86页二、生物计数法二、生物计数法（六）膜滤过滤计数法第38页/共86页二、生物计数法二、

24、生物计数法（七）微菌落快速计数法 此法需醋酸纤维素薄膜及透明固定液( 95%乙醇80ml 与冰醋酸20ml 混和而成)。测定时, 将灭菌滤纸放入灭菌培养皿中, 倒入适量肉汤培养基浸润制成培养衬垫。醋酸纤维膜按需要剪成适当大小并打上加样标记。对于菌浓度 103 cfu/ ml 的标本, 则将膜先贴在培养衬垫上, 加样10l , 接种后37培养5 小时, 取下膜放玻片上加热干燥, 然后放入透明液中0 .5min , 再贴玻片上, 加热使其完全透明, 最后用结晶紫液染色, 水洗后镜检, 用低倍镜对形成的微菌落进行计数。此法最大的优点是省时, 特别适合对临床标本( 如尿液) 进行细菌菌数的测定。第39

25、页/共86页二、生物计数法二、生物计数法（八）最可能数(most probable numbe r ,MPN)的估计 这种方法对样品进行连续系列梯度稀释，加入培养基进行培养，从规定的反应呈阳性管数的出现率，用概率论来推算样品中菌数最近似的数值。对某种细菌选择性计数对菌数少的样品进行选择性计数第40页/共86页第五节 细菌的血清学检验 用含有已知特异性抗体的免疫血清, 与从样本中分离培养出的未知纯种细菌进行血清学试验, 可以确定致病菌的种或型, 此种血清学试验称为血清学鉴定( serological identity ) , 常用方法是玻片凝集试验。 例如：沙门菌血清学鉴定主要借助于沙门菌O抗原

26、多价血清与O、H、Vi抗原的单价因子血清 生化和形态疑似A-F组多价“O”诊断血清“+”“-”Vi凝集试验不同“O”群的单价因子血清多价H血清H单因子血清第41页/共86页第42页/共86页第五节 细菌的血清学检验 沙门菌具有和其他肠杆菌科细菌类似的抗原结构，如菌体抗原(O)，鞭毛抗原(H)和表面抗原(Vi)，菌体抗原是作沙门菌血清学分型的主要依据，其化学成分是脂多糖，现已发现60多种菌体抗原，有些沙门菌的菌体抗原可在生长繁殖中发生量的变异，沙门菌的鞭毛抗原为蛋白质，根据其鞭毛抗原的特性，可将其分为相菌和相菌，相菌可与同种H因子抗血清发生凝集反应;相菌可在含同种H因子抗血清的培养基中诱生，它们

27、失去与同种H因子抗血清发生凝集反应的能力，可见，相菌的鞭毛抗原特异性较强，而相菌的鞭毛抗原特异性较弱。 第43页/共86页 O抗原：为脂多糖，性质稳定。能耐100达数小时，不被乙醇或0.1%石炭酸破坏。决定O型原特异性的是脂多糖中的多糖侧链部分，以1、2、3等阿拉伯数字表示。例如乙型副伤寒杆菌有4、5、12三个。鼠伤寒杆菌有1、4、5、12四个；猪霍乱杆菌有6、7二个。其中有些O抗原是几种菌所共有，如4、5为乙型副伤寒杆菌和鼠伤寒杆菌共有，将具有共同O抗原沙门氏菌归为一组，这样可将沙门杆氏菌属分为AZ、O51O63、O65O67共有42组。我国已发现26个菌组、161个血清型。使人类致病的沙门

28、氏杆菌大多属于AF组。O抗原刺激机体主要产生lgM抗体。 第44页/共86页 H抗原：为蛋白质，对热不稳定，60经15分钟或乙醇处理被破坏。具有鞭毛的细菌经甲醇液固定后，其O抗原全部被H抗原遮盖，而不能与相应抗O抗体反应。H抗原的特异性取决于多肽链上氨基酸的排列顺序和空间构型。 沙门氏杆菌的H抗原有两种，称为第1相和第2相。第1相特异性高，又称特异相，用a、b、c等表示，第2相特异性低，为数种沙门氏杆菌所共有，也称非特异相，用1、2、3等表示。具有第1相和第2相H抗原的细菌称为双相菌，仅有一相者称单相菌。每一组沙门氏杆菌根据H抗原不同，可进一步分种或型。H抗原刺激机体主要产生lgG抗体。 第4

29、5页/共86页 Vi抗原：因与毒力有关而命名为Vi抗原。由聚-N-乙酰-D-半乳糖胺糖醛酸组成。不稳定，经60加热、石碳酸处理或人工传代培养易破坏或丢失。新从患者标本中分离出的伤寒杆菌、丙型副伤寒杆菌等有此抗原。Vi抗原存在于细菌表面，可阻止O抗原与其相应抗体的反应。Vi抗原的抗原性弱。当体内菌存在时可产生一定量抗体；细菌被清除后，抗体也随之消失。故测定Vi抗体有助于对伤寒带菌者的检出。 第46页/共86页第五节 细菌的血清学检验 用已知的细菌或其特异性抗原检测患者体液中有无相应特异抗体和其抗体效价的动态变化, 作为某些传染病的辅助诊断。一般采取病人的血清进行试验, 故这类方法通常称为血清学诊

30、断( serological diagnosis) , 常用方法是试管凝集试验。 第47页/共86页第一节第一节 细菌噬菌体分型技术细菌噬菌体分型技术一、概述（一）噬菌体化学组成：化学组成：噬菌体主要由核酸和蛋白质组成。核酸为噬菌体的遗传物质，为DNA或RNA，并由此将噬菌体分成DNA噬菌体和RNA噬菌体。蛋白质构成噬菌体头部的衣壳及尾部，起着保护核酸的作用，并决定噬菌体外形和表面特征。抗原性：抗原性：噬菌体具有抗原性，能刺激集体产生特异性抗体。抵抗力：抵抗力：噬菌体对理化因素及多数化学消毒剂的抵抗力比一般细菌的繁殖体强，75 30min灭活。噬菌体能耐受低温和冰冻，但对紫外线和X射线敏感。第

31、48页/共86页第一节第一节 细菌噬菌体分型技术细菌噬菌体分型技术一、概述（一）噬菌体毒性噬菌体（virulent phage）能在宿主菌细胞内复制增殖，产生许多子代噬菌体，并最终裂解细菌，称为毒性噬菌体温和噬菌体（temperate phage）/溶原性噬菌体（lysogenic phage）噬菌体基因与宿主菌染色体整合，不产生子代噬菌体，但噬菌体DNA能随细菌DNA复制，并随细菌的分裂而传代第49页/共86页第50页/共86页第一节第一节 细菌噬菌体分型技术细菌噬菌体分型技术一、概述噬菌现象噬菌现象液体培养基 混浊 澄清固体培养基中，出现噬菌斑（plaque）一定体积内的噬斑形成单位数目（

32、pfu）第51页/共86页prophage: 整合在细菌基因组中的噬菌体基因组溶原性细菌第52页/共86页第一节第一节 细菌噬菌体分型技术细菌噬菌体分型技术（二）噬菌体在细菌的鉴定与分型方面的应用 高度特异性-分类 型特异性-分型第53页/共86页第一节第一节 细菌噬菌体分型技术细菌噬菌体分型技术四、细菌的噬菌体分型技术（一）培养基（二）噬菌体和宿主菌 制备符合要求的RTD噬菌体 确认宿主菌的裂解模式（三）噬菌体的增殖 液体增殖法 固体增殖法第54页/共86页第一节第一节 细菌噬菌体分型技术细菌噬菌体分型技术四、细菌的噬菌体分型技术（四）细菌的噬菌体分型方法的操作程序单菌落培养物双层琼脂法（菌

33、苔）滴加噬菌体培养结果观察大于20个噬菌斑：+融合性裂解(CL) 次融合性裂解( CL)半融合性裂解( SCL)不透明融合性裂解( OL )第55页/共86页第二节 细菌素分型技术一、概述细菌素（bactericin）是某些细菌产生的蛋白类抗菌物质，这种物质只对产生菌亲缘关系近的细菌有抗菌作用，而对产生菌本身不敏感。产生细菌素受质粒控制。可进行细菌分型和流行病学调查大肠菌素、绿脓菌素、葡萄球菌素与敏感菌特异受体结合，观察抑菌斑第56页/共86页第二节 细菌素分型技术二、细菌素的分型方法（一）、细菌素分型试验法（二）平板交叉划线分型法（三）细菌素产生菌的分型法能被X型细菌素所抑制者即为X型菌制备

34、细菌素（诱导剂）细菌素敏感试验细菌素分型试验第57页/共86页第三节 细菌的药物敏感试验与分型一、概述 细菌的药物敏感试验(drug susceptibility test,简称药敏试验) 是指在体外测定药物抑制或杀死细菌能力的试验。 纸片扩散法（K-B法） 稀释法（肉汤、琼脂稀释法） 第58页/共86页第三节 细菌的药物敏感试验与分型二、纸片扩散法（disc agar diffusion test, K-B法）（1)原理：是将含有定量抗菌药物纸片(药敏纸片)贴在涂有细菌的琼脂平板上，抗菌药物在琼脂内向四周扩散，其浓度逐渐递减，使纸片周围的敏感细菌在一定距离内的生长受到抑制，形成抑菌圈，再测量

35、抑菌圈的直径来判定待检菌对被测药物的敏感程度。（2）优点：简单易行、价格便宜、药物选择性灵活，适用对生长快的细菌进行药敏试验。第59页/共86页第三节 细菌的药物敏感试验与分型二、纸片扩散法（3）方法药敏纸片 培养基（M-H）菌液 1)药敏试验标准比浊管的制备:0.048m0l/L(1.175%)氯化钡0.5m1加0.18m0l/L(1%)硫酸溶液99.5ml充分混匀，其浊度为0.5麦氏比浊标准（约108），分装试管，置室温下暗处保存。使用前应充分混匀，每半年重配一次。 第60页/共86页第三节 细菌的药物敏感试验与分型二、纸片扩散法（3）方法2)被检菌液的制备:用接种环挑取已分纯的被检菌菌落

36、4-5个，接种于3-5mlMH肉汤，35培养4小时。链球菌属和嗜血杆菌属需在5%羊血MH肉汤中培养过夜，淋病奈瑟菌需在5%-7%C02条件下培养。用生理盐水或肉汤校正菌液浓度至0.5麦氏比浊标准，校正后的菌液应在15分钟内接种。3)用无菌棉拭蘸取制备好的菌液，在管内壁挤去多余菌液均匀涂布接种于琼脂表面，一般涂布3次，每次平板旋转60度，最后沿平板内沿涂抹一周，置室温干燥30分钟后，用无菌镊子或贴纸机将药敏纸片紧贴于含菌琼脂表面。纸片位置要适当，各纸片中心距离不小于24mm，纸片距平皿内缘应大于l5mm。直径9Omm的平皿可贴6张纸片，贴后要尽量避免移动，置于35培养16-18小时观察记录结果。

37、第61页/共86页MHMH平板的厚度要求平板的厚度要求4mm4mm第62页/共86页第63页/共86页菌液浓度菌液浓度0.50.5麦氏单位麦氏单位, ,无菌棉签蘸取菌液无菌棉签蘸取菌液第64页/共86页均匀涂布均匀涂布第65页/共86页贴纸片毕贴纸片毕, ,轻轻按压轻轻按压第66页/共86页也可以用纸片分配器贴纸片也可以用纸片分配器贴纸片第67页/共86页用游标卡尺量取直径用游标卡尺量取直径第68页/共86页第三节 细菌的药物敏感试验与分型二、纸片扩散法（4）结果 一般宜在黑色无反光背景上观察，如培养基含有血液须打开皿盖观察，测量抑菌圈直径(单位为mm)，判断结果。每批试验应做标准菌株对照，只有对照菌株的敏感度符合标准，实验结果才可靠。 根据最新NCCLS标准指南判断出:S或I或R第69页/共86页第70页/共86页第71页/共86页第三节 细菌的药物敏感试验与分型三、稀释法是体外定量测定抗菌药物抑制细菌生长活性的方法。液体稀释法和固体稀释法 将药物按一定规律稀释成一系列浓度后, 与等量的细菌作用, 经培养后观察其能抑制细菌生长的最低浓度即MIC（minimal inhibitory concent