人FGF―9慢病毒表达载体的构建、包装及鉴定

1、人fgf-9慢病毒表达载体的构建、包装及鉴定人fgf9慢病毒表达载体的构建、包装及鉴定摘要目的构建人成纤维细胞生长因子-9 (fgf-9)慢病毒 表达载体，鉴定其表达，并对慢病毒载体进行包装，为在体及体外研 究fgf-9的功能及其与肿瘤等疾病的关系提供基础。方法pcr扩增 人fgf-9基因。全长序列交换入线性表达载体，连接产物转化感受态 细胞，pcr及基因测序鉴定阳性克隆。重组质粒转染293t细胞，荧 光显微镜观察增强型绿色荧光蛋白(egfp)表达，western-blot鉴 定fgf-9表达。重组病毒质粒在脂质体介导下与结构质粒和包膜质粒 共转染293t细胞包装成人fgf-9过表达慢病毒,r

2、t-qpcr测定滴度。 结果pcr及测序证实人fgf-9基因正确克隆至病毒质粒；感染293t 细胞后，荧光显微镜观察到egfp, western-blot检测到fgf-9融合 蛋白表达；三质粒共转染293t细胞获得慢病毒，测其浓度为2x108 tu/mlo结论 成功构建人fgf-9慢病毒表达载体，可在293t细胞中 表达，并包装成慢病毒，为在体及体外研究fgf-9的功能及其与肿瘤 等疾病的关系提供基础。关键词成纤维细胞生长因子-9；慢病毒；肿瘤中图分类号r3 文献标识码a 文章编号1673-7210 (2013) 10 (c) -0016-04人成纤维细胞生长因子-9 (fgf-9)是人成纤维

3、细胞生长因子的 家族成员之一，最初发现于人类神经胶质瘤细胞1,定位于人 13qll-ql2t染色体2,长约34 kb,包括3个外显子和2个内含子; 该基因编码区有627个脱氧核苜酸，编码208个氨基酸。许多研究表 明，fgf-9异常表达，可导致多种疾病的发生，如子宫内膜异位症及 肿瘤3。todo等4研究了 4株人胶质瘤细胞系，发现fgf-9对其 中3株有促增殖作用，这一作用的强弱与fgf-9的剂量正相关。 granerus等5在对崎胎瘤细胞系的研究中发现，fgf-8与fgf-9均 可促进细胞倍增，但二者的作用效力不同：加入同等量的fgf-8与 fgf-9,后者可引起细胞骤增，而前者效果相对较弱

4、。ueng等6研 究摩托尾气部分提取物（mep）的促癌机制，在细胞水平发现mep可 使肺癌细胞系cl5屮多种蛋白表达水平改变，其屮包括fgf-9表达上 调；在动物水平，大鼠每天吸入2 h摩托尾气持续吸入4周，其肺 组织中fgf-9表达增加。慢病毒载体现已广泛用于基因稳定转染表达及shrna介导的基 因敲除技术。其优点为7：可将携带的基因稳定持续转染至宿主 基因组；可转染分裂及未分裂细胞；转染后无病毒蛋口复制； 可携带复杂基因信息；安全整合；载体系统构建相对较简单。故 在基因研究及基因治疗领域中，慢病毒逐渐受到青睐。木研究旨在构建人fgf-9慢病毒表达载体，鉴定其表达产物，并 对慢病毒载体进行包

5、装，为在体及体外研究fgf-9的功能及其与肿瘤 等疾病的关系提供基础。1材料与方法1. 1材料大肠杆菌菌株dii5a、293t慢病毒包装细胞为本实验室保存；含 fgf-9片段的293t慢病毒包装细胞质粒购口 clontech公司； pgc-fu-3flag-sv40-egfp载体、结构质粒pllelper 10和包膜质粒 pllelper 2. 0购自上海吉凯基因化学技术有限公司；其余试剂均为进 口或国产化学分析纯。pcr 仪购自 applied biosystems 公司；positive clone 测序仪 购自美季生物技术公司；荧光显微镜购自奥林帕斯公司。1. 2方法1.2. 1目的基因

6、pcr扩增、酶切 依据fgf-9基因信息设计pcr 引物，由上海吉凯基因化学技术有限公司合成。引物序列： 5' -gaggatccccgggtaccggtcgccaccatggctcccttaggtgaag-3,（上游）， 5' - tccttgtagtccataccgctttggcttagaatat cc-3'（下游）。以含 fgf-9 片段的质粒为模板，pcr钓取目的基因，电泳检测。回收预期668 bp 大小pcr产物片段。冃的基因pcr产物双酶切。1.2.2 重组质粒构建 pgc-fu-3flag-sv40-egfp 载体 age i 酶切, 目的基因pcr产物交

7、换入线性表达载体，将连接产物转化到感受态细 胞。pcr鉴定长出的克隆。阳性克隆基因测序。1.2.3冃的基因过表达载体检测 处于对数生长期的293t细胞 胰酶消化，制成细胞悬液，接种于24孔细胞培养板屮。依据 invitrogen lipofectamine 2000转染试剂使用说明书进行转染操作。 转染24 h后，观察质粒上荧光标记基因增强型绿色荧光蛋白(egfp) 的表达。转染36 h后，收集细胞，western-blot检测目的基因融合蛋白的表达。1. 2. 4慢病毒包装 重组病毒质粒在脂质体lipofectamine 2000 介导下与结构质粒pllelper 1. 0和包膜质粒plle

8、lper 2. 0共转染293t 细胞。收集转染后48 h的293t细胞上清并离心，浓缩得到慢病毒。1. 2. 5病毒滴度的检测293t细胞传代培养，24孔板每孔中加入 ix 105个细胞，次fi,准备6个无菌ep管，每管加入90 ul培养 基，取待测病毒原液10 11 l加入第1管，混匀后取10 pl加入第2 管，继续相同操作至故后一管，分别记为10 ul组、1 ul组、10-1 l 组、10-2 ul 组、10-3 口1组及10-4 ul 组，其屮，10 u l 组 舍弃不测。另取一无菌ep管，加入100 u l培养基，作为对照(c0n) 组。加入稀释好的病毒溶液，37°c, 5

9、%c02培养24 h,加入500 ul 新鲜培养基。4 d后，抽提rna,逆转录获得cdna, rt-qpcr检测浓 度。2. 1目的基2 结果 <!endprint> <!一一startprint>因pcr扩增、酶切pcr成功扩增出人fgf-9序列dna片段。电泳结果如图1所示,在668 bp左右可见明亮特异的条带，与预计产物大小一致。3讨论hiv-1慢病毒载体最早被用于研究病毒的生活复制周期8。naldini等9将慢病毒注射到大鼠脑内，使其成功转染未分裂的神 经元细胞，这是慢病毒载体技术的突破性进展。其后，人们陆续改进 hiv-1慢病毒载体以降低完全复制慢病毒产纶的

10、概率，这些改进包括: u3启动了的删除，使用包装细胞等。现今慢病毒载体已应用于多个领域的基础研究及临床研究：体 外研究：weber等10用3种携带不同荧光蛋口的慢病毒载体转染细 胞，使其在细胞中稳定表达，为进一步在体及体外研究单克隆细胞在 组织再生中的作用提供基础。ravassard等11用慢病毒介导胰岛素 启动子调控的sv40lt表达体系靶向转染人胚胎胰腺芽胚，并以此为 基础构建了 1株功能性人胰腺b细胞系，在葡萄糖等胰岛素促泌剂作 用下，该细胞系可稳定分泌胰岛素。在体研究：guillem等12以 烟碱样乙酰胆碱受体3 2亚单位缺陷小鼠为研究对象，用慢病毒载体 介导其边缘区前额叶皮质神经元表

11、达该受体，发现小鼠的注意力得以 重建，但冲动行为及动机行为不受影响。xia等13用慢病毒构建了 小鼠非小细胞肺癌模型，并在此基础上研究了 ikk2及nf-kappab在 肺癌发生发展中的作用。ranzani等14以慢病毒为载体介导插入突 变，成功诱导出3种不同的肝细胞性肝癌小鼠模型，进一步研究肝癌 和关基因ojidong等15将携带egfp的慢病毒在体注射到大鼠卵巢, 发现egfp可持续有效的在卵巢表达。临床研究：porter等16用 过表达嵌合抗原特异性受体的慢病毒转染t细胞，并将该t细胞输注 到难治慢性淋巴细胞白血病患者体内，发现该细胞可长期存在于患者 血液及骨髓中，并稳定表达嵌合抗原受体

12、。aiuti等17用慢病毒转 染wiskott-aldrich综合征(was)患者的造血干细胞，使其表达有 功能的wasp蛋口并回输患者体内，发现该细胞可稳定存在于患者体 内，冃患者的血小板计数、免疫功能及临床评分均有不同程度的提升。综上所述，fgf-9参与多组织器官的发生和分化，并与肿瘤等疾 病的发牛发展密切相关，但具体作用机制尚不明确。而慢病毒以其较 好的生物安全性、有效性和系统稳定性等特点，为在体及体外研究 fgf-9的功能及与疾病的关系提供了新思路。而现国内外暂无文献报 道fgf-9过表达慢病毒的应用，故本课题成功构建人fgf-9慢病毒表 达载体，并对慢病毒载体进行包装，为后续研究奠定

13、了良好基础。参考文献1naruo k, seko c, kuroshima k, et al. novel secretory heparin-binding factors from human glioma cells(glia-activating factors) involved in glial cell growth purification and biological properties j. j biol chem, 1993, 268 (4)： 2857-2864.2 mattei mg, penault-llorca. f, coulier f, et a 1. th

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