【实验】DNA的粗提取与鉴定

1、【实验】dna的粗提取与鉴定一、教学目的1. 学会dna的粗提取和鉴定的方法。2. 观察提取出来的dnao二、教学建议在木实验的教学屮，教师应注意以下儿点：1. 实验材料必须准备充足。本实验所川的实验材料是鸡血细胞液，由活鸡的鲜血经沉 淀后获得。每组（2个学牛）需用5ml鸡血细胞液，则每班（50人）至少需要130ml,而鸡血细 胞液与鸡血的体积比为1 : 3,这样每班至少需要390ml鸡血细胞液。宰杀1只中等大小的 活鸡，一般可得120ml左右的鲜血，凶此，1个班实验需要买4只活鸡。如果不具备购买 活鸡的条件，也可以到帀场售活鸡处去索取鸡血，但所帯烧杯中必须提前放入抗凝剂。2. 盛放鸡血细胞液

2、的容器，最好是塑料容器。鸡血细胞破碎以后释放出的dna,容易 被玻璃容器吸附，由于细胞内dna的含量木来就比较少，再被玻璃容器吸附去一部分，提 取到的dna就会更少。因此，实验过程中故好使用犁料的烧杯和试管，这样可以减少提取 过程屮dna的损失。3. 获取较纯净的dna的关键步骤：（1）充分搅拌鸡血细胞液dna存在于鸡血细胞的细胞核中。将鸡血细胞液与蒸y留水混合 以后，必须用玻璃棒充分搅拌，使鸡血细胞加速破裂，并释放出dna。（2）沉淀dna时必须用冷酒精 实验询必须准备好大量的体积分数为95%的酒精，并在 冰箱（至少5°c以下）中至少存放24ho（3）正确搅拌含有悬浮物的溶液实验步

3、骤3、5、7,都需要川玻璃棒搅拌。教师应提醒 学生注意，在进行步骤3、5时，玻璃棒不要直插烧杯底部，而搅拌要轻缓，以便获得较 完整的dna分子。进行步骤7时,要将玻璃棒插入烧杯中溶液的中间,用手缓慢转动5min lomino三、参考资料实验原理的补充介绍1. dna的释放。dna位丁鸡血细胞的细胞核中，正常情况下不会释放出来。为了使 dna从细胞核中释放岀來，实验中采用了向鸡血细胞液中加入蒸憾水并且搅拌的方法。蒸 憎水对于鸡血细胞來说，是一种低渗液体，水分町以大量迹入血细胞内，使血细胞破裂。同 时，再加上搅拌的机械作川，就加速了鸡血细胞的破裂（细胞膜和核膜的破裂），于是释放出 dna,当然也有

4、rna。但是，释放出来的人量dna和rna往往与蛋白质结合在一起。2. 将dna与蛋白质分离，并溶解dnao根据二者的特性，即在浓度较高的nacl溶液 （nacl物质的量浓度为2mol/l）中，核蛋白容易解聚，游离出dna。而dna在浓度较高的 nacl溶液中的溶解度很高，na+与带负电的dna结合成dna钠盐。这时dna在溶液中 呈溶解状态。3. dna的析出与获取。利川dna在浓度较低的nacl溶液中溶解度小的原理，向含有 dna的浓度较高的nacl溶液屮加入大量（300ml）蒸馆水，稀释nacl溶液，使dna的溶解 度下降，而蛋口质的溶解度增高（这就是蛋口质的盐溶现彖），从而使二者分离。

5、这时，加上 不停地搅拌，溶解度下降的dna逐渐呈丝状物。再通过过滤，滤去蛋口质，就可以获取 dna的粘稠物了。如果釆用离心法则更好,用4000r/niin的旋转频率，离心15min,除去上 清液（含有蛋白质），留下的沉淀物屮含dnao4. dna的再溶解。再川较离浓度的nacl溶液去溶解dna粘稠物。5. dna的沉淀和浓缩。除去了蛋白质的核酸溶液，必须再进一步沉淀和浓缩。最常用 的方法是酒精沉淀法。就是将含有na+的dna溶液，加入到相当于其两倍体积的体枳分数 为95%冷酒精溶液中，混匀以后可以使dna沉淀、浓缩，形成含杂质较少的dna丝状物, 悬浮丁溶液中。如果出现的丝状物较少，可以将此混

6、合液再放入冰箱中冷却几分。浓缩后的 dna丝状物，可以用缓缓旋转玻璃棒的方法卷起（因为玻璃棒有吸附dna的作用）。6. dna的鉴定。本实验小鉴定dna的方法为二苯胺法（配方见下述的“药品配制”）。 二苯胺法的原理是：dna屮喋吟核甘酸上的脱氧核糖遇酸生成3拜某一丫酮棊戊醛，它 再和二苯胺作用而显现蓝色（溶液呈浅蓝色）。鉴定时溶液蓝色的深浅,少酸匚苯胺）与溶液中dna含量的多少有关。二苯胺试剂的配制a液：1.5g二苯胺溶于100ml冰醋酸中，再加1.5ml浓硫酸，用棕色瓶保存。如冰醋 酸呈结晶状态，则需加温后待其熔化，再使用。b液:乙醛的体积分数为0.2%的溶液。配制：将0.1 mlb液加入到

7、10mla液中，现配现用。dna粗提取与鉴定的另一种方法1. 材料用具：新鲜菜花（或淼黄、菠菜）。塑料烧杯，量筒，玻璃棒，尼龙纱布，陶瓷研钵，试管，试管架，试管夹，漏斗，酒精 灯，石棉网，三角架，火柴，刀片，天平。研磨液，体积分数为95%的酒精溶液，二苯胺试剂，蒸馅水。2. 方法步骤：（1）dna的粗提取%1 准备材料将新鲜菜花和体积分数为95%的酒粘溶液放入冰箱冷冻室，至少24h。%1 取材 称取30g菜花，去梗取花，切碎。%1 研磨 将碎菜花放入研钵中，倒入10ml研磨液，充分研磨lomino%1 过滤衣漏斗中梨上尼龙纱布，将菜花研磨液滤入烧杯中（有条件的学校可将滤液倒入 羯料离心管中进行

8、离心,jij 1000r/min的旋转频率，离心2min5niin,取上清液放入烧杯中）。 在4°c冰箱中放置几分后，再取上清液。%1 加冷酒耕将一倍体积的上清液倒入两倍体积的体积分数为95%的冷酒秸溶液中，并 川玻璃棒缓缓地轻轻搅拌溶液（玻璃棒不要直插烧杯底部）。沉淀3min5min后，可见白色 的dna絮状物出现。用玻璃棒缓缓旋转，絮状物会缠在玻璃棒上。（2）dna的鉴定：%1 配制二苯胺试剂 取0.1 mlb液，滴入到10mla液中，混匀。%1 鉴定 取4mldna提取液放入试管中，加入4ml二苯胺试剂，混匀后观察溶液颜色（不 变蓝）。用沸水浴（100°c）加热lom

9、in。在加热过程中，随吋注意试管中溶液颜色的变化（逐渐 出现浅蓝色）。研磨液的配制方法tris： 10.1g（相对分子质量为121.14）,先加50ml蒸馅冰溶解，用hc1的物质的量浓度 为2moul的盐酸调至ph&o,再加下述药品。nacl： 8.76g（相对分子质量58.44）edta： 37.2g（相对分子质量372.24）sds： 20g（相对分子质量288.3）待上述药甜全部溶解后，再用蒸谓水定容一至looomlo若在室温低于20°c时配制药液，sds呈沉淀析出，此时需要加温，才能将sds溶解。 如果提前配制的研磨液出现了沉淀，则应加温使沉淀溶解后再使川。研磨液中几种药品的作用sds（十二烷基碱酸钠）：可使蛋白质变性，与dna分离。edta（乙二胺四乙酸二钠）：为dna卿的抑制剂，可以防止细胞破碎后dna悔降解dnaonacl的物质的量浓度为0.15mol7l的溶液：能很好地溶解dnaotris/hcl：提供缓冲体系，dna在这个缓冲体系屮呈稳定状态。（tris为三疑甲基氨基甲 烷）鉴定dna的其