大豆苷元对神经母细胞瘤细胞增殖的抑制作用

1、大豆苷元对神经母细胞瘤细胞增殖的抑制作用作者：徐鹰朱恒英，李舒梅，赖日勇，唐丹【摘要】目的探讨大豆苷元对神经母细胞瘤s h s y 5 y细胞凋亡和增殖的影响。方法采用细胞生长抑制实验、 流式细胞仪检测等方法观察s h-s y 5 y细胞的形态变 化、细胞凋亡率及细胞周期变化。结果10. 080. 0m g /m 1的大豆苷元明显抑制细胞的增殖，且有剂量依赖性；与对照组相比，大豆苷元处理2 4 h后，各组sh_sy 5 y细胞均出现亚二倍体峰，细胞凋亡率与大豆苷元呈剂量依赖性。结论大豆苷元可诱导神经母细胞瘤s h s y 5y细胞凋亡，对sh_s y 5 y细胞增殖有明显的抑制作 用。【关键词

2、】神经母细胞瘤大豆苷元增殖 abstract： objecti vetoobservetheeffectofda idze inonneurobl as t o m a . methods theprol i ferat ionw a s t e s t edbymtta s s ay.ce 1 lcyc leandapoptos i srateweredet e r m i n edbyf 1 owcytomet r y . results 10.0 80. oug/mlofdaidzeincoulds igni f i cant lyinhibi t p r o 1 i f e r a t

3、 ionofshsy5yc ell, daidzeinextractcouldin duceapoptos i sofsh sy5ycel landtherateofapoptos i s was i n creasedwi ththe increaseof th edrugconcent rat ion. conclusion d a idzeinextractcaninduceapop tos i sandinhibi tprol i f e r a t ionofsh-sy5ycell.key wo rds： neuroblastoma；daid z e i n ； proliferat

4、ion神经母细胞瘤是儿童较常见的恶性肿瘤，发病率占儿童 恶性肿瘤的第3位，与儿童期常见的其他恶性肿瘤相比，化 疗效果差，严重威胁儿童的生命安全。因此，寻找新的治疗 药物成为人们十分关切的问题。近年来，多种研究发现大豆 异黄酮对多种癌症具有抑制和治疗作用1，但对大豆异 黄酮抗癌作用的研究主要集中在乳腺癌和前列腺癌等激素 依赖性肿瘤，关于其对儿童神经母细胞瘤生长作用的影响研 究报道很少。因此，我们于体外观察了大豆苷元对nb细胞 株shsy5y生长的影响，以期为进一步研究其作用机 制及临床应用提供实验室依据。1材料与方法1.1 材料s hs y 5 y细胞株为贵阳医学院分子生物学重点实验室赠送。大豆

5、苷元为陕西赛德高科生物股份 有限公司馈赠，纯度为98%。rpmi 1 640为gi be o公司生产，小牛血清为杭州四季青公司生产，二甲基 哑砜和噻唑蓝为s i g m a公司生产。bdfacsca 1 i b u r流式细胞仪为美国bd公司生产；mk3型酶标仪 和3 1 1 1型c 0 2培养箱均为美国the rmo公司生 产。方法1.2.1 细胞培养与接种s hs y 5 y细胞株培 养在含5 %小牛血清的rpm i 1 6 4 0培养基中，co 2培养箱内，恒温3 7 °c。当细胞长满时，用0. 2 5 %胰 蛋白酶消化，收集细胞，1000r/min，离心5mi n，p b s

6、洗2次，以12 x 1 0 4的浓度接种于9 6孔 板内，每孔体积为18 0ml。1.2.2 受试药物的处理将大豆苷元溶解在dms 0中，配成1 0 0 m g / m 1的储存液，一 2 0 °c保存。使 用时用完全培养基将其稀释成1 0 m g /m 1的工作液，用 直径为0. 2 2 ym的微孔滤膜过滤除菌置于4 °c保存，并 进一步用完全培养基分别稀释成所需的不同浓度，待细胞接 种2 4 h后分别加入不同浓度的受试药，每孔2 0 u 1，使 其终浓度分别为0. 1，1 . 0，1 0 . 0，2 0. 0，40. 0，60. 0, 80. 0，10 0. 0，150

7、. 0 m g/m1。每个浓度为4个孔，同时用含dmso的完全培 养基和空白一起作对照。mtt用pbs配成5 . 0 m g / ml的溶液，磁力搅拌器搅拌3 0 m i n，直径为0.22 pm的微孔滤膜过滤除菌后4 °c保存，2周内有效。1.2.3 细胞生长抑制效应的测定采用mtt比色 法2。细胞接种2 4 h后加受试药，之后每隔2 4 h用m tt比色法测定光密度值，即对应的活细胞数。具体操作如 下：加受试药后每隔一定时间加mtt溶液10u1， 3 7 °c继续培养4 h，终止培养后小心吸去孔内培养上清液， 每孔加入150p1dmso，振荡器振荡51 0 m i n

8、使结晶物充分溶解。选择4 9 0 nm波长在酶联免疫检测仪 上测各孔的光吸收值，记录大豆苷元作用于sh_sy 5 y 细胞的浓度效应数据和时间效应数据，用下列公式计算药物 对细胞生长的抑制率，并绘制效应曲线。抑制率=对照孔测定的平均0d值一加药组测定的平均 0d值照孔测定的平均0d值x 10 0%表1大豆苷元对sh-sy5y细胞增殖抑制率的影响 与对照组比较，?< n=31.2.4 流式细胞仪检测细胞凋亡及细胞周期分析 各组细胞培养4 8 h后，收集各组细胞悬液1 m 1，浓度约 为 1 0 6 个/ ml, 1 0 0 0 r/mi n离心 5mi n，弃掉培养液，用p b s离心冲洗

9、两次，以7 0 %的冷乙醇固定，4 °c 保存 1 24h，10 0 0 r / m i n 离心 5 m i n后，p b s洗涤冲洗去乙醇2次；加入rn a s e a，摇匀，3 7 °c温育3 0 m i n ；加入p i染料1 m 1，4 °c暗染3 0 m i n。流式细胞仪检测，每份标本测定x 1 0 3个细胞， 采用m o u f i t l t软件对各组样本进行dna含量及 细胞周期分析。1. 3 统计学方法实验均重复3次以上。所有的测定 指标均采用土s表示，用s p s s 1 4 . 0统计软件包进行 分析，凋亡实验用方差分析，细胞增殖实验用t

10、检验。以p <0.05表示差异有显著性。2 结果2.1 大豆苷元对s h-s y 5 y细胞的生长抑制作 用细胞增殖抑制实验结果显示，与正常对照组相比，大豆苷 元各浓度组处理2 47 2 h的细胞抑制率与正常对照组 比较均有显著性升高。大豆苷元处理sh_sy 5 y细胞2 4，4 8，7 2 h 的 i c 5 0 分别是 6 5 . 0，4 7. 0, 40. 0ug/m1。以上结果表明大豆苷元对sh_sy5 y细胞的体外增殖具有较强的抑制作用，其抑制作用在一 定的范围内有剂量和时间依赖性，并呈现出一定的饱和性。1大豆苷元对sh-sy5y细胞体外增殖的抑制作用2. 2 大豆苷元对sh_

11、sy5y细胞周期和凋亡的影响药物处理4 8 h后，大豆苷元各浓度组均能诱导h s y 5 y细胞凋亡，g1峰前出现亚二倍体峰，即凋亡细胞所 特有的凋亡峰。大豆苷元诱导sh_sy 5y细胞凋亡呈现 一定的剂量依赖性，细胞凋亡率显著高于正常对照组。随着 大豆苷元浓度的升高，g 0 /g 1和g 2 /m期的细胞明显 减少，dna合成期细胞数均明显增多，表明大豆苷元使s h_s y 5 y细胞发生s期阻滞，抑制细胞增殖。2大豆苷元对sh-sy5y细胞周期和凋亡的影响3 讨论n b治疗十分棘手，人们一直在积极寻找新的治疗药物。 我国中医中药用于治疗肿瘤历史悠久，具有疗效确切、毒副 作用低等优点。大豆异

12、黄酮是重要的植物化学物质，由1 2 种单体组成，包括金雀异黄素、大豆苷元、黄豆黄素3种苷 元及这3种苷元衍生的9种苷类成分。大量研究表明3, 4大豆异黄酮类化合物在高浓度时具有防癌抑癌作用。近 年来，从细胞凋亡角度探讨中草药抗肿瘤作用机制及从天然 药物中筛选抗癌药物已成为研究热点。本研究采用mtt法 和流式细胞仪检测了大豆苷元对s h-s y 5 y细胞的增 殖、细胞周期和细胞凋亡的影响。细胞的增殖、细胞周期和细胞凋亡的影响。mt结果也 表明大豆苷元对s h-s y 5 y细胞的体外增殖具有明显的抑制作用，在1080ug/ml的范围内其抑制作用 随药物浓度的增加及作用时间的延长其抑制作用更加明

13、显; 当浓度大于8 0 u g /m 1后，其抑制作用不再随药物浓度 增加和作用时间延长而进一步增强，呈现出一定的饱和性。 流式细胞仪检测结果显示大豆苷元能诱导s h-s y 5 y 细胞凋亡，且随大豆苷元浓度的升高，g 0 / g 1 h e g 2 /m期的细胞数明显减少，dna合成期明显增多，提示大 豆苷元可使s hs y 5 y细胞发生s期阻滞，从而抑制细 胞增殖。目前对于大豆异黄酮类物质抑制细胞增殖的机理研 究认为它抑制细胞增殖的主要包括性激素样作用、抗氧化作 用、诱导细胞凋亡的作用、抑制酪氨酸蛋白激酶的活性和抑 制拓扑异构酶的活性等58。我们研究表明大豆苷元 能通过使s h-s y

14、 5 y细胞发生s期阻滞来抑制s h- s y 5 y细胞的增殖。是否还存在其他途径抑制s h-s y 5 y细胞的增殖，在本实验中没有涉及，尚不得而知。总之，本研究表明大豆苷元在体外对sh sy5 y细 胞的增殖有明显的抑制作用并能诱导细胞凋亡，尽管目前对 其是通过激活细胞凋亡的那条途径来诱导s h-s y 5 y 细胞凋亡尚不得而知，有待进一步研究，但本研究还是可以 为n b的治疗提供一种新思路。【参考文献】1 st eema s a . e n v i rontox i c olpharma col j，1999，7: 2 0 9.2 李杰，刘玉琴，孙桂芝.mtt法在肿瘤研究中的改良及应

15、用进展j .中国肿瘤临床，1 9 9 8，2 5 :3 12.3 aronsonwj，tymchukcn, elashoffrm, e t a 1 . decreasedgr owthofhumanp r o s tatelncapt umors i nscidmi c e f e d a 1 o w f a t , soyproteindietwi thi sofla vones j. nutrcancer, 1999，3 5:130.4 lands t r o m m, zhangjm，h allmansc，e t a 1 . inhibitoryeff e c t sof soyandryed i e t s o n t h e deve 1 opment o fdunn i ngr3327 pros tateadenocarc inoma inr a t s j. prostate, 1998，36:151 .5 bocrsmabj，patelrp，kir k m, e t a 1 . chlorinat