大蒜素对人结肠癌HT29细胞增殖影响及作用机制研究

1、大蒜素对人结肠癌ht29细胞增殖影响及作用机制研宄作者：王旭平赵玲王容 郭锋 辛华 【摘要】目的：探讨大蒜素对体外培养结肠癌ht29细胞增殖的影响，并探讨其作用机制。方法：采用四甲基偶 氮唑蓝法测定不同浓度大蒜素对ht29细胞增殖抑制率；流 式细胞术测定细胞周期变化及凋亡相关蛋白bcl-2与bax的 表达。结果：mtt显示大蒜素能抑制人结肠癌ht29细胞的增 殖，并具有时间-剂量依赖性；流式细胞术测定结果显示10 u g/ml大蒜素可明显诱导ht29细胞凋亡，并将细胞周期阻 滞在g2/m期；可降低癌基因蛋白bel表迗，而促进bax表 达。结论：大蒜素对人结肠癌ht29细胞增殖具有抑制作用， 可

2、能与细胞周期阻滞和凋亡相关蛋白表迗有关。【关键词】大蒜素结肠癌细胞系t29凋亡流式细胞术【abstract 】 ionofdiallyltrisul ncoloncarcinomacelchanism. methods：thftervarioustreatmesingthemethodofmtt usedtoanalyzethech bcl-2,baxlevels. reobjective：tostudytheaffectfideonculturedhumallineht-29anditsmeeviabilityofcellsantsweredeterminedu.flowcytometryw

3、ere angeofcellcycleand suits：theproliferationofhumancoloncarcinomaht-29cellswereinhibitedbydiallyltrisulfide. theinhibitionwasassociatedwithdoseandtimedependence. flowcytometryresultsshow edthat：1 )whencells weretreatedwithdia llyltrisulfideattheconcentrationof10ug/mlforl2hand24h,thepercentageofgo/g

4、lphasecellswasdecreasedandthatofg2/mphasecellswassignificantlyincreasedcomparedwiththosei nthecontrol)dially ltrisulfidedownreg ulatedbclexpression,whileup-regulatedbaxexpression. conelusions：itwassuggestedthatdiallyltrisulfideinhibitedht29cellproliferation. andthesewereassociatedwitharrestofcellcyc

5、lesanddown regulationofbcl2/b axratio.keywords idiallyltrisulfide humancoloncarcinomacelllineht-29 ap optosis flowcytome try大蒜素是一种从大蒜鳞茎中分离出的具有多种生物学活性的化合物，其化学名为二烯丙基三硫化物。现代医学研 究证实大蒜素具有抗菌、消炎、提高机体免疫力和抗肿瘤的作用1-3。体外研究显示，大蒜素可以通过诱导癌细胞生 成活性氧，上调bax，bak和激活ca spase3等方式促进其凋亡1，4, 5，但大蒜素对结肠癌作用的研究较少。本研究 以体外培养的结肠癌ht2

6、9细胞为材料，探讨大蒜素对结肠 癌细胞增殖的影响并探讨其机制，以期为结肠癌的防治提供 实验依据。1材料与方法材料人结肠癌ht29细胞由山东大学医学院细胞生物学 研究所提供；大蒜素为上海禾丰制药有限公司生产；mtt、 二甲基亚砜、ho33342、碘化丙啶为美国sigma产品；dmem、 新生牛血清为美国gibco产品；bcl-2、b ax单克隆抗体购 自美国bd公司。方法细胞培养人结肠癌ht29细胞用含10%小牛血清的dmem 培养液，于3 7°c、5%c02饱和湿度条件下静置培养。选择对 数生长期细胞进行分组实验。mtt法检测大蒜素对细胞增殖的影响细胞以5x 104ml-l 的密度接

7、种于9 6孔培养板中，培养48h后，每孔加入不同 浓度的大蒜素各100 ul，终浓度分别为1、5、10、20ug/ml, 对照组加入含10%fbs的培养基，分别培养12、24、48h后， 分别向每孔加入20 puftt溶液，继续培养4 h，弃培养液， 每孔加入dms0100 pl，脱色摇床振荡5min;酶标仪检测。 每时间浓度组设3个复孔，实验重复3次。所得0d值根据公 式计算细胞抑制率。细胞抑制率=x100%，以空白组0d值调大蒜素诱导结肠癌ht2 9细胞凋亡最适浓度筛选以上各实验组加入大蒜素作用24h，加入ho3334 237°c温育20min, 再加入pi，荧光显微镜观察并记录

8、图象。细胞形态学观察loug/ml大蒜素分别作用0 24h，每 隔2h倒置相差显微镜观察一次，随机选取视野记录图象。流式细胞仪检测大蒜素对细胞周期的影响细胞以5 x 104ml-l接种于25cm2培养瓶中，培养48h后，加入10 u g/ml 大蒜素，分别培养12、24h,弃培养液，加入%胰蛋白酶消化， 1000 r/min离心8min收集细胞。细胞用pbs清洗3次后， 500 u 1pbs悬浮细胞，加入含10 u g/ml的rnase的pi，4°c 染色30mino经200目滤网过滤后，上机检测。实验结果采 用modifit软件进行细胞周期各期的百分率及亚二倍体的百 分率分析。实验

9、重复3次。流式细胞仪检测大蒜素对bcl-2和bax的影响细胞以5 x104ml-l接种于25cm2培养瓶中，培养48h后，加入10 u g/ml大蒜素分别培养12和24h,收集细胞，以pbs清洗3 次，70%乙醇4°c固定lh。经pbs再次清洗后，不同时间组 细胞分别加入兔抗人bcl-2或兔抗人bax抗，37°c孵育lh， pbs清洗后加入fitc标记山羊抗兔二抗，37°c避光孵育 20min。阴性对照以代替一抗。pbs洗3次后上流式细胞 仪检测，实验重复3次。统计学处理经软件分析，组间比较采用方差分析，结果 以x±s表示，a =为显著性检验标准。2结果

10、大蒜素对结肠癌ht29细胞活性的影响mtt结果显示1 10 ug/ml大蒜素均能抑制ht29细胞的增殖，呈时间-剂量 依赖性；20 ug/ml大蒜素细胞毒性作用明显，作用1 2h， 细胞抑制率为，作用24h以后细胞几乎全部死亡。大蒜素诱导结肠癌ht29细胞凋亡最适浓度的筛选ho3 3342和pi染色结果提示，各浓度组中，10 ug/ml大蒜素对 ht29细胞诱导凋亡作用最明显；20ug/ml大蒜素主要表现为 细胞毒性作用。因此，本实验选取10 u g/ml作为最适诱导浓 度来探讨其作用机制。细胞形态学观察正常条件下ht29细胞呈梭形或多角形， 传代培养48h,细胞贴壁生长，有聚团现象；10 y

11、 g/ml大蒜 素作用6 h，细胞开始出现形态学改变，紧贴瓶壁的细胞边 界模糊，部分细胞缩起，分裂相减少；大蒜素作用12h开始 有凋亡小体出现；大蒜素作用24h,大部分细胞回缩变圆， 凋亡小体明显，部分细胞悬浮于培养基中，细胞碎片增多。大蒜素对细胞周期影响流式细胞仪检测结果显示，10 ug/ml大蒜素作用12h, ht29细胞凋亡率为;作用24h细 胞凋亡率为。细胞周期均发生了明显的变化，主要表现为 g0/g1期细胞减少，g2/m期细胞增加，而s期细胞无明显变化。流式细胞仪检测bcl-2和bax表达结果显示10pg/ml 大蒜素作用12和24h，可降低癌基因蛋白bel-2表迗，而促 进bax表

12、达（表2）。3讨论近年国内外流行病学调查发现，大蒜素对多种肿瘤有一 定抑制作用6，但具体机制尚未完全明确。本研究采用的大 蒜素主要含三硫二丙烯，选择人结肠癌ht29细胞进行抑制增 殖和诱导凋亡的研究，并初步探讨了其可能的作用机制。细胞周期在肿瘤细胞的生长调控中具有重要作用，通过 改变细胞周期来阻止肿瘤细胞的增殖已受到人们的关注7。 本研究发现，大蒜素作用后g1期ht29细胞明显减少，g2/m 期相对增多。其原因可能是大蒜素抑制g2/m期，使多数细胞 不能通过m期向g1期的转变，导致g1期细胞减少，使大量 细胞停留在m期，无法完成正常的有丝分裂，提示大蒜素对 ht29细胞有周期特异性抑制作用；大

13、蒜素对iit29细胞m期 的阻滞作用，对临床应用大蒜素防治结肠癌，尤其与周期特 异性化疗药物辅助应用治疗结肠癌具有重要的理论意义。bel-2家族在细胞凋亡中起着重要的作用，其家族成员 包括抑制凋亡蛋白bel-2、bcl-xl等，促凋亡蛋白bax、bb ad等。bel-2和bax分别可以同源二聚体形式存在，二者之 间也可以形成异源二聚体。bax的表达增多时，ba x-bax的同源二聚体便诱导细胞凋亡；而bcl-2的表达增多时，bax 便和bcl-2形成更为稳定的异源二聚体来抑制细胞凋亡。 bcl-2/bax的比率可以调节细胞凋亡的速率8。本实验证明 经大蒜素处理的ht29细胞，bax表迗升高而b

14、cl-2水平明显 降低。提示大蒜素可能通过降低bcl-2 /bax的比率诱导ht29 细胞凋亡。【参考文献】l xiaod, lewkl,kimya，etal. diallyltrisulfidesuppressesgrowthofpc-3humanprostatecancerxenograftinvivoinassociationwithbaxandbakinductionj. clincancerres,xx,12:6836-6843.2 l in,guor,liw,etal. a proteomicinvestiga tionintoahumangastriccancercellline

15、bgc823treatedwithdi allyltrisulfidej. carcinogenesis,xx ,27： 1222-1231.3 zhouz,tauhl,xubx,e tai. microarrayanalysisofalteredgenee tri sulfide-treated macolrep, xx, 57:818 -823.4 xiaoxl,pe yltrisulfideinducexpressionindiallyl hepg2cellsj pharngj,suq,etal. diall sapoptosisofhumang nemgc803throughcasas

16、triccancercelllipase3pathway j. a izheng, xx, 25： 12471251.5antosiewiczj，herman-antosiewicza,marynowskisw,etal. c-junnh-terminalkinasesignalingaxisregulatesdiallyltrisulfide-inducedgenerationofreactiveoxygenspeciesandcellcyclearrestinhumanprostatecancercellsj. cancerres,xx,66：5379-5386.6fleischauerat,arabl. garlicandcancer：acriticalreviewoftheepidemiologicliteraturej. j nutr, 2001,131 ： 1032 s-1040s.7alhasa nsa,ensleyjf,sarka rfh. genisteinelicit