血液MICM诊断

1、血液的血液的micmmicm综合诊断综合诊断背景介绍背景介绍 血液病血液病是原发于造血系统的疾病，或影响造血系统伴发是原发于造血系统的疾病，或影响造血系统伴发血液异常改变，以贫血、出血、发热为特征的疾病。血液异常改变，以贫血、出血、发热为特征的疾病。 出血性疾出血性疾病病贫血症贫血症白细胞白细胞疾病疾病常见血液病常见血液病造血系统造血系统恶性肿瘤恶性肿瘤白血病的诊断分型白血病的诊断分型micmmicm fab形态学诊断(morphology) 免疫学检查(immunology ) 细胞遗传学检查(cytogenetics) 分子遗传学检查(molecular)检测方法检测方法 病史 形态学：

2、结构：活检 细胞学：涂片 骨髓血凝块 免疫分型：流式细胞或免疫组化 细胞遗传学：核型分析、fish 分子遗传学：融合基因（rt-pcrq-pcr)/基因突变（测序）白血病白血病micm诊断程序及技术诊断程序及技术白血病诊断的任务白血病诊断的任务不仅仅是不仅仅是fab分类分类 是不是白血病？ 急性？慢性？ 系来源 fab分类 预后分层 治疗、疗效判断 mrd 病史病史+形态形态形态形态+免疫免疫形态形态+免疫免疫+遗传遗传+分子分子形态形态+免疫免疫+遗传遗传+分子分子为什么需要为什么需要micm综合诊断？综合诊断？ 形态或病理或加细胞化学分析受观察者个体经验及分辨力的限制，一致率仅50-70%

3、； 在此基础上增加免疫组化和/或fcm分析大大增加了分型的准确率，可达90%以上； 染色体、fish及基因分析，进一步提高分型的准确率 micm整合诊断的临床意义整合诊断的临床意义 全面正确诊断与分型 评估预后 确立检测mrd的标志，追踪mrd 帮助建立分层、个性化的治疗 定期追踪帮助发现抗原丢失、克隆演变或突变 帮助确定病因或发病机制micm整合报告整合报告形态学形态学 是诊断的基础，任何淋巴造血系统增生性疾病是诊断的基础，任何淋巴造血系统增生性疾病的诊断都离不开形态学诊断。形态学诊断技术的诊断都离不开形态学诊断。形态学诊断技术包括包括细胞学：外周血、骨髓涂片，淋巴组织穿刺细胞学：外周血、骨

4、髓涂片，淋巴组织穿刺组织学：骨髓活检、淋巴组织活检组织学：骨髓活检、淋巴组织活检 骨髓活检和骨髓/血涂片骨髓涂片细胞细微结构清楚评估红系、粒系增生情况及幼稚细胞比例具有优势骨髓纤维化、细胞致密可干抽可做组织化学染色（如铁染）对缺铁性贫血、慢性疾病引起的贫血、巨幼细胞性贫血、和急性白血病的诊断尤其有帮助。骨髓活检显示骨髓的组织结构和各成分的分布及相互关系，对巨核细胞的评估具有优势不存在干抽和骨髓稀释可做免疫组织化学染色对再生障碍性贫血、低增生性白血病、淋巴瘤、转移癌、骨髓增生性肿瘤的诊断具有重要价值 血凝块：废物利用、骨髓活检的补充 注明病史骨髓涂片看细胞、骨髓活检看结构，骨髓涂片看细胞、骨髓活

5、检看结构，相互补充相互验证不能相互替代不能相互替代骨髓/血涂片骨髓活检1.骨髓活检+3项特染2.骨髓涂片+组织化学染色（3）3.免疫组织化学染色4-10项4.血块骨髓活检可根据个性化病理诊断需要加做免疫组织化学染色！骨髓活检可根据个性化病理诊断需要加做免疫组织化学染色！免疫组化免疫组化长度长度 1.5cm 1.5cm达标（达标（1cm1cm尚可）尚可）长度长度 1cm 1cm不达标不达标长度长度 0.5cm 0.5cm可能存在诊断不全面可能存在诊断不全面（不包括皮肤、肌肉、软骨、血块等）（不包括皮肤、肌肉、软骨、血块等）附附2 2张合格的骨髓涂片（晾干后再包装）张合格的骨髓涂片（晾干后再包装）

6、血块分开固定（收费按小标本病理收费）血块分开固定（收费按小标本病理收费）注意：取材部位是否有病灶 保存液使用福尔马林固定骨髓活检标本长度要求骨髓活检标本长度要求取材的限制骨髓增生不均匀(与血象不符)取材过少取材表浅组织挤压活检增生低下活检增生低下,涂片增生活跃涂片增生活跃 骨髓增生不均匀 取材较少,表浅活检增生活跃活检增生活跃,涂片增生低下涂片增生低下 骨髓增生不均匀 涂片稀释骨髓活检与骨髓涂片细胞增生不一致骨髓活检与骨髓涂片细胞增生不一致流式细胞术流式细胞术 流式细胞免疫分型的作用流式细胞免疫分型的作用确定系来源确定系来源 原理：不同系有特定的抗原表达 髓系/b系/t/nk系/组织细胞和树突

7、状细胞确定细胞分化阶段确定细胞分化阶段 不同发育阶段细胞，其抗原表达不同预后判断预后判断 有些抗原表达和淋巴瘤/白血病预后相关治疗方法选择治疗方法选择-治疗靶向治疗靶向疗效判断、复发监测疗效判断、复发监测 m0 cd34,cd33,cd13 m1 mpo,cd34,cd33,cd13, hla-dr m2 mpo,cd34,cd15,cd13, hla-dr m3 mpo, cd33,cd13、cd9(hla-dr、cd11b常阴性) m4 mpo,cd33,cd15,cd14,cd13 m5 cd68,cd33,cd14,cd13,hla-dr,cd36，cd64 m6 cd33,cd235

8、a,cd71 m7 cd33,cd41,cd42b,cd61急性髓系白血病免疫表型与急性髓系白血病免疫表型与fabfab分型相关性分型相关性形态与免疫表型的符合性不足80%，不能脱离形态学单纯依赖免疫表型进行白血病的诊断与分型。fab基于形态，两者不符以形态为主。mrd流式细胞检测流式细胞检测 肿瘤细胞与正常起源细胞免疫表型不同 跨系表达 抗原表达不同步 抗原表达丢失 抗原表达减弱 其它抗原表达 初始免疫分型结果、白血病相关表型特点 抗体组合越多覆盖率越高、敏感性越高 假阳性、假阴性均存在 随访、动态观察更有意义流式检测标本要求流式检测标本要求抗凝骨髓/外周血附2张合格的骨髓涂片（晾干再包装）

9、 完整的病史 mrd需要初次分型资料 组套12、18、24、30、36遗传学诊断技术遗传学诊断技术 细胞遗传学： 核型分析：全基因检测、覆盖面广、敏感性差 fish：针对性强、敏感性高、周期短、覆盖率低 分子遗传学： 融合基因（rt-pcrq-pcr)：针对性强、敏感性高 基因突变（测序、pcr）：覆盖面较大、敏感性较低 染色体异常 包括染色体的结构和数量异常 根据这些特征性的异常，对恶性血液病进行诊断和分类 细胞遗传学细胞遗传学急性白血病急性白血病染色体检测的临床意义染色体检测的临床意义 染色体畸变可以作为急性白血病缓解和复发重要参考，最初治疗后异常核型可以消失提示cr，之后重新出现提示白血

10、病复发，有新的核型出现，表明有进展 可以作为标志来验证骨髓移植成功与否 最初诊断的核型是急性白血病预后最有价值指标预后等级好中差核型类型amlt(8;21)、 t(15;17)、inv(16)正常、+8、+21、+22、11q23异常、del(9q)、del(7q)-5、del(5q)、-7、3q异常、复杂异常allt(12;21)、染色体数目50条的超二倍体、dic(9;12)(p11;p12)正常、47-50的超二倍体、t(11;14)亚二倍体、近单倍体、t(9;22)、t(4;11)、t(1;19)、t(8;14)急性白血病核型的预后分级急性白血病核型的预后分级染色体检测常见问题染色体检

11、测常见问题 标本取材量不足：检测最低白细胞数为10的6次方个细胞 培养后无分裂相或分裂相少于15个：标本白细胞量低，患者正在进行化疗 结果临床不符：分子检测阳性而染色体阴性（染色体分辨率低） 融合基因融合基因bcr/abl(p210)-cml/allbcr/abl(p230)-cmlbcr/abl (p190)-allpml/rara-m3aml/eto-m2cbf/myh11x-m4eomll重排-m5flp1l1-pdgfr-嗜酸细胞增多症 基因突变基因突变jak-2 v617f /539-543突变mpl 外显子10突变分子遗传学分子遗传学-血液病类型确诊的分子标志血液病类型确诊的分子标

12、志融合基因筛查融合基因筛查 适用患者 本筛查项目主要用于筛查all、aml、cml、ammol、cmml、mds等血液病病种可能出现的31种融合基因或癌基因，及其融合基因的110余种剪切变异情况。适合无法确定融合基因类别的初诊患者初诊患者，便于医生对血液病患者进行分子标志物的确定，并进行后续微小残留病灶的监控。 本项目建议配合染色体核型分析一起检测，以免由于染色体数目异常或携带少见融合基因而造成漏诊。 苏州大学附属第一医院对于初诊苏州大学附属第一医院对于初诊all,amlall,aml患者都建议做患者都建议做此项目此项目不同疾病筛查项目不同疾病筛查项目all融合基因筛查（18种）aml融合基因

13、筛查（23种）apl融合基因筛查 继t(15;17)之后，又先后发现4种m3特异的累及rar的变异性染色体易位：分别产生plzf-rar，npm-rar，numa-rar和stat5b-rar融合基因。 临床上，具有plzf-rar或stat5b-rar融合基因患者对atra治疗不敏感，其余三种染色体易位患者经atra治疗可获完全缓解。mll融合基因筛查jak2 基因突变基因突变 已列入who2008 mpns的诊断标准 v617f见于90%以上的pv，约50%的et、pmf 在pv中，少部分患者为jak2 exon12或其它突变 建议jak2基因突变筛查检测以下几种 v617f; k539l

14、; n542-e543del; e543-d544delmpl基因突变检测基因突变检测 mpl和mpn mpn中以jak2 v617f最为常见，pv、et、pmf中的突变频率分别为96%、55%、65%。 mpl突变主要见于et和pmf，频率分别为2-5%和5-10%。 mpl可用于jak v617f阴性的et和pmf患者的诊断。检测目的检测目的用于jak2 v617f阴性的et和pmf患者的诊断。 临床考虑et或pmf的患者可以组合检测 融合基因融合基因bcr-abl p210jak2 v617f基因突变基因突变mpl基因突变基因突变基因阳性率临床意义预后与其他遗传异常相关性kit5%预后因

15、素差t(8;21)inv(16)/t(16;16)flt320-40%预后因素差-npm130%（核型正常）对疾病进行临时性的定义良好 （如果没有flt3突变）m4, m5cd34 -cebpa10%对疾病进行临时性的定义良好m1，m2cd7+who 2008 新界定的突变新界定的突变aml预后基因突变6项 cebpa基因tad1区突变检测 cebpa基因tad2区突变检测 cebpa基因bzip区突变检测 c-kit17号外显子 flt3-itd基因突变检测 npm1基因突变检测报告时间：12个工作日价格：1800元aml预后基因突变9项 cebpa基因tad1区突变检测 cebpa基因ta

16、d2区突变检测 cebpa基因bzip区突变检测 c-kit（8号外显子和17号外显子） flt3-itd基因突变检测 flt3基因592位点突变检测 flt3基因835位点突变检测 npm1基因突变检测 报告时间：12个工作日价格：2700元 tcr和和igh重排项目重排项目 有5-10%的患者无法通过常规方法辨别其淋巴系统的增生是恶性增生还是反应性增生。 正常淋巴细胞在成熟过程中重排是多克隆性的，但恶性肿瘤（98%）表现为单克隆性ig和/或tcr基因重排。 适用患者及适应症：疑似淋巴瘤患者的良恶性鉴别诊断。淋系白血病患者的鉴别诊断及微小残留跟踪检测。 目标科室：血液科、肿瘤科、病理科现有检

17、测方法及相关技术现有检测方法及相关技术pcr结合毛细管电泳技术（genescan）： 分辨率高，不易产生假阳性或假阴性pcr结合聚丙烯酰胺凝胶电泳技术 abl激酶区突变激酶区突变 伊马替尼的长期服用导致部分患者，特别是cml 急变期（ap-cml）的患者，发生伊马替尼的耐药，其耐药发生率在20-30%。耐药主要由abl激酶区突变引起，可导致药物疗效下降或失效。 适用患者：伊马替尼，尼洛替尼及达沙替尼治疗bcr-abl阳性cml、all患者，建议定期检测，尽早发现耐药。 检测范围：bcr-abl融合基因abl激酶区52个位点abl激酶区突变与tki耐药的关系sara redaelli, et.

18、al, jco, 2009,vol27(3)469-471分子检测常见问题分子检测常见问题 标本取材量不足：检测最低白细胞数为10的6次方个细胞 检测内参偏低：目前原因未知 结果临床不符：分子检测覆盖范围问题，其他情况一般假阴性较少micm整合报告整合报告染色体检查的分析前影响因素染色体检查的分析前影响因素 标本要求：肝素抗凝骨髓，最少标本量为2ml。需要用公司统一配送的专用肝素钠抗凝管。抗凝剂量太多影响培养效果 标本需要当天送检，24小时内到达实验室。标本存放于18-25常温即可，温度不可高于25，不要低于16。温度过高或过低都会影响细胞存活 药物影响及病情影响：恶性血液病细胞，特别是用药后的细胞存活能力较正常细胞差，不易培养流式检查的分析前影响因素流式检查的分析前影响因素 标本要求：edta抗凝骨髓，最少标本量为2ml。 标本需要当天送检，48小时内到达实验室。标本存放于18-25常温即可，温度不可高于25，不要低于16。 温度过