（精选文档）EGFP原核表达分析

1、EGFP的原核表达分析首都师范大学生命科学学院 100048摘要：利用PCR反应扩增出所需要的EGFP基因，与pTrc His蛋白表达载体重组，转化大肠杆菌BL21,提取质粒，诱导EGFP蛋白表达，进行进一步的分离纯化并用SDS-PAGE和Western-blot做检测。这个实验让我们充分熟悉了整个流程。关键词：绿色荧光蛋白 蛋白的诱导表达、分离纯化 表达蛋白检测 E.coli 材料和方法：1、主要材料及仪器1.1、菌株和质粒：大肠杆菌BL21为本实验室保存；重组筛选质粒pTrcHis购自Invitroge公司。1.2、培养基：LB培养基（液/固）内含氨苄青霉素浓度为100 ug/ml。1.3

2、、器材和试剂器材：移液枪、PCR仪、离心机（HetticZENTRIFUGEN D-78532 Tuttlingen）、SIGMA2-16K(4离心机)、SIGMA 3-18K(离50ml大离心管)、紫外透射观察仪、水浴锅、核酸电泳仪（BIO-RAD）、超声波破碎仪（SONICSVIbra cell）、气浴恒温振荡器（THZ-82江苏金坛市金城国胜实验仪器厂）、SDS-PAGE电泳装置、Western Blotting电转移装置、水平摇床（WD-9405）、胶片观察灯（WD-9406）、封口机、超净台、250ml锥形瓶。试剂：PCR反应体系缓冲液（1050 mM Tris-HCl，50 mM

3、KCl，1.5 mM MgCl2）、DNA聚合酶（Taq E）、dNTPs混合物（每种2.5mM）、博大泰克PCR产物快速回收试剂盒、限制性核酸内切酶（BglII、EcoRI）、0.5M EDTA、琼脂糖凝胶（1g琼脂糖、100ml1xTAE、10ulEB）、电泳缓冲液（50 x TAE、Tris乙酸、EDTA）、溴酚兰、蔗糖、甘油、连接酶（购于Promega公司的T4DNA连接酶及10ligation buffer）、0.1MCaCl2、碱裂解液（溶液I：50mM葡萄糖、25mM Tris-HCl，pH=8.0、10mM EDTA；溶液II：0.2 M NaOH，1SDS；溶液III：5 M

4、 KAc，11.5 ml冰醋酸，加水定容至100ml）、RNaseA、无水乙醇、PBS缓冲液、裂解缓冲液（含20mM咪唑）、冲洗液（含100mM咪唑）、洗脱液（含500mM咪唑）、5样品缓冲液、30%凝胶贮液、4分离胶缓冲液、4浓缩胶缓冲液（4保存）、TEMED原液、10%过硫酸铵、Tris-甘氨酸电极缓冲液（pH=8.3）、考马斯亮蓝G250染色液、GFP抗体（200ug/ml，用pH=7.5 TBS配置)、转移缓冲液、TBS、封闭液（5%脱脂奶粉）、显色液（氯萘酚，30mg/ml于甲醇中）、ddH2O、脱色液（100 ml 冰乙酸:100 ml乙醇:800 ml蒸馏水）2、方法21、EGF

5、P基因的PCR扩增及其电泳检测在一灭菌的0.2mL小离心管中依次加入(总体积为50ml)：10buffer(Mg2+) 5ml4dNTPs （每种2.5mM ） 8mlEGFP-F 1mlEGFP-R 1ml Template(模板) 34ml Taq E 1ml-Total volume 50l循环参数94 3min94 30s55 30s 27cycle72 1min72 10min4 保存2.2、PCR扩增产物的回收 试剂盒法1)、 柱平衡：向吸附柱CB2中（吸附柱放入收集管中）加入500ml的平衡液BL，12000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB2重新放回收集管中。2

6、)、上样：估计PCR反应液，向其中加入5倍体积的结合液PB，充分混匀, 然后移入吸附柱CB2中（吸附柱放入收集管中），室温放置2分钟，12000rpm离心3060秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB2放入收集管中。3)、 漂洗：向吸附柱CB2中加入600ml漂洗液PW（使用前先检查是否已加入无水乙醇），静止2min后，12,000rpm离心30-60秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB2放入收集管中。4)、 漂洗：重复步骤3 。5)、 甩干：将吸附柱CB2放回收集管中，12000rpm，离心2分钟，尽量除去漂洗液。将吸附柱CB2开盖置于室温放置数分钟，彻底地晾干，以防止残留的漂洗液影响下一步的

7、实验。 6)、 洗脱：将吸附柱CB2放入一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加3050ml洗脱缓冲液EB，室温放置2分钟。12000rpm离心2分钟收集DNA溶液。2.3、PCR扩增产物的电泳检测 PCR产物 6ml 6x样品缓冲液 1ml混匀后加入样品孔中，100V电泳20-30 min2.4、酶切产物的回收 试剂盒法方法同PCR扩增产物的回收2.5、体外重组按以下比例加入试剂： 10 ligation buffer 2 l 载体 3l PCR片段 14 l T4 DNA Ligase 1l-Total volume 20l16过夜。注意：最后加入载体，放入16的锅中水浴时要注意把板子

8、拿起来插，以免进水。2.6、制备感受态细胞1）、划线复壮宿主菌37过夜。2）、挑一个单菌落于30ml LB液体培养基中，37、200rpm至OD600=0.20.4。3）、培养液分装到预冷的无菌1.5ml Ep管中，于冰上放置510min, 离心4，5000rpm, 离心5min。4）、弃上清，吸干残存培养液，加1.0ml预冷的CaCl2溶液重悬菌体，冰上放置1530min，4，5000rpm，离心5min。5）、重复步骤4。6）、加100ml冰预冷的CaCl2溶液重悬菌体，放置4 用于转化。2.7、重组DNA转化感受态细胞1）、加10ml连接产物到100ml感受态细胞中，轻悬以混合内含物，置

9、于冰上30min。2）、42 热休克90秒，不要摇动试管，置冰上12min。3)、加400ml液体培养基，37 150rpm 摇4560min。4)、微波炉融化LB固体培养基，待冷却至50 左右时，加入相应的抗生素，摇匀，倒平板，每板20ml左右。室温凝固。5)、转化产物用无菌涂板器涂匀。6)、37 倒置培养过夜。2.8、重组质粒的提取试剂盒法1）、在含有抗生素的LB培养基中接种一单菌落，37，150rpm摇培过夜。2）、柱平衡步骤：向吸附柱cp3中（吸附柱放在收集管中）加入500ml的平衡液BL。12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。（请用当天处理的柱子

10、）3）、取1.5ml过夜培养的菌液，加入离心管中，使用常规台式离心12000rpm离心1min尽量吸除上清（菌液多时可以通过多次离心将菌体沉淀到一个离心管中）。4）、向留有菌体沉淀的离心管中加入250ml的溶液p1（检查是否已加入RNaseA），使用移液器或者涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀。 注意：如果有未彻底混匀的菌块，会影响裂解，导致提取量和纯度偏低。5）、向离心管中加入250ml溶液p2，温和上下翻转6-8次使菌体充分裂解。 注意：温和地混合，不要剧烈震荡，以免打断基因组DNA，造成提取的质粒中混有基因组DNA片段。此时菌液应清亮粘稠，所用时间不超过5分钟。如果未变清亮，可能是菌体太多，裂解

11、不彻底，应减少菌体量。6）、向离心管中加入350ml溶液p3，立即温和上下翻转6-8次，充分混匀，此时将会出现白色絮状沉淀。12000rpm离心10min，此时在底部形成沉淀。 注意：p3加入后应立即混合，避免产生局部沉淀。如果上清中还有微 小白色沉淀，可以离心后取上清。7）、将上一步收集的上清液用移液器转移到cp3中（吸附柱放入收集管中），不能吸出沉淀。12000rpm离心30-60s，倒废液，将吸附柱cp3放入收集管中。8）、可选步骤：向吸附柱cp3中加入500ul去蛋白溶液pd，12000离心30-60s，倒废液，将吸附柱cp3重新放回收集管中。如果宿主菌是endA+菌(TG1,BL21

12、,HB101,JM系列，ET12567等)，因为有核酸酶，推荐采用此步骤。若不是，可省略。9）、向吸附柱cp3中加入600ul的pw（用前加入无水乙醇），12000rpm离心30-60s，倒废液，将cp3放回。10）、重复步骤9。11）、将吸附柱cp3放入收集管中，12000rpm离心2min,除去残余漂洗液。 注意：此步非常重要，建议cp3开盖放置数分钟，以彻底晾干。12）、将吸附柱cp3置于一个干净离心管中，向其中间滴加40ml的洗脱缓冲液EB，室温放置2min，12000rpm离心1min,将质粒溶液收集到离心管中。2.9、大肠杆菌中重组蛋白的表达和纯化（a）蛋白的诱导表达1）、挑取含重

13、组质粒的单菌落，接种于含Amp抗生素的培养基中（终浓度100 mg/ml)，37振荡培养过夜。2）、次日以5量接种，37 培养至OD0.6时,加入IPTG （终浓度为1mM），37诱导表达23h.3）、收集细菌（每组20ml)，5000rpm离心10min，20保存。（b）大肠杆菌细胞的破碎1）、收集细菌（每组20ml)，5000rpm离心10min。2）、取出保存的细菌，加入1ml裂解缓冲液，充分混匀后再加入溶菌酶, 使得终浓度为1 mg/ml, 放置冰浴中3060min充分酶解。3）、冰上用超声波（200300W）破碎细胞，每次10秒，间歇10秒，共做6次。4）、11000 rpm 4离心

14、1520min，收集上清液。5）、取20ml上清液，-20暂存，准备进一步做SDS-PAGE分析。其余上清液做下一步亲和纯化。（c）融合蛋白的亲和层析1）、结合：1ml裂解液加入50ml Ni-NTA填料用涡旋振荡器（200rpm）混合均匀，4，60分钟。2）、装柱：将上述混合液装入准备好的层析柱，打开层析柱出口，让液体自然流过。3）、冲洗：待液体流尽以后，自层析柱顶部徐徐加入1ml冲洗液，让液体自然流尽。重复此步骤1次。4）、洗脱：自层析柱顶部缓慢加入0.1ml洗脱液，收集流过的液体，即获得洗脱的蛋白。重复此步骤1次，每次分别收集蛋白洗脱液。（d）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳1）、将玻璃板、样品

15、梳、Spacer用洗涤剂洗净，用ddH2O冲洗数次，再用乙醇擦拭，晾干；2）、制胶架3）、检查凝胶板是否渗漏4）、制胶(1)、按如下体积配制10分离胶8 ml，混匀；ddH2O 3.4 ml4X分离胶缓冲液 2.0 ml30% Acr-Bis 2.6 ml 10%AP 50 ml TEMED 5 ml(2)、向玻璃板间灌制分离胶，立即覆一层重蒸水，大约20 min后胶即可聚合；(3)、按如下体积配制6浓缩胶4.0 ml，混匀；ddH2O 4X浓缩胶缓冲液 30% Acr-Bis 10% AP TEMED2.3 ml 1ml 700 ml 50 ml 5 ml(4)、将上层重蒸水倾去，滤纸吸干，

16、灌制浓缩胶，插入样品梳；注意：操作时要带手套，灌胶时不能有气泡，以免电泳时影响电流通过。（e）Western Blot1）、滤纸和硝酸纤维素薄膜的准备切4张滤纸和1张硝酸纤维素滤膜(避免用手直接接触滤膜，需带手套操作)，其大小都应与凝胶大小吻合，放入浅盘中，并加入转移缓冲液使其浸泡15-20min。2)、凝胶-硝酸纤维素薄膜 “三明治”的制作（1）、打开转移盒并放置在浅盘中，用转移缓冲液将海绵垫完全浸透，海绵的上面放置2张用转移缓冲液浸泡过的滤纸；(2)、小心将凝胶用去离子水略为漂洗一下，然后放在滤纸上，要保证精确对齐，避免气泡；(3)、以转移缓冲液润湿胶面，小心将硝酸纤维素薄膜准确平放于凝胶

17、上。从凝胶一边开始轻轻放下，可避免气泡；（4）、在硝酸纤维素薄膜上放2张润湿的滤纸，用一玻璃移液管作滚筒轻轻滚过凝胶-硝酸纤维素薄膜 “三明治”以挤出所有气泡。（5）将另一块海绵垫用转移缓冲液完全浸透后，放在凝胶-膜 “三明治”上， 关上转移盒并插入转移池。以上各步接触凝胶和薄膜时，均需带手套。转移缓冲液最好预冷，并且在转移槽的冰盒中放入冰避免转移过程中产生大量的热。3)、电转移：倒满转移缓冲液，稳压100V转移1h。 （f）免疫检测1）、封闭：关闭电源，拆下转移装置，用镊子把硝酸纤维素薄膜放入可加热封口的塑料袋中，根据滤膜面积以0.1 m1cm2的量加入封闭液（约8ml），尽可能排除里面的气

18、泡，然后密封袋口，平放在平缓摇动的摇床上于室温温育3060min。应保证薄膜与封闭液充分接触。2)、洗膜：倒掉封闭液，用TBS洗膜三次。3)、加入抗体：将封闭过的硝酸纤维素薄膜放入另一个塑料袋中，按薄膜面积0.1 mlcm2 (约8ml) 加入稀释的EGFP抗体，小心除去气泡，密封袋口，平放在摇床上室温温育1 h或过夜。4)、洗膜：将薄膜转移至盛有TBS的培养皿中，于室温平缓摇动，漂洗56min，重复2次。 5)、显色：将薄膜转移至盛有显色液的培养皿中，细心观察反应过程。一旦蛋白带的颜色达到要求(5-30min)，即取出滤膜，用去离子水漂洗3次，每次10min。将薄膜用吸水纸吸干水分，记录条带

19、位置，拍摄照片，留作永久实验记录。拍摄应在一周内进行，因为随着时间推移，条带会变浅，薄膜会变黄。结果：GFP 基因的PCR产物的电泳结果如图所示：最左边和最右边的条带均为marker，中间分别为不同组GFP 基因的PCR产物的电泳条带，有三组条带出现异常，其余条带均为720bpGFP基因条带。扩增出少量目的基因，说明试剂、仪器没有问题，可能操作有问题。而GFP基因条带周围的微弱条带是由于pcr中基因的非特异性扩增。重组菌的阳性筛选如图所示：图中阳性对照中培养基长满菌，实验组中长了一部分菌，阴性对照组中没有菌。加有氨苄青霉素的培养基能对具抗氨苄青霉素抗性进行筛选。阳性对照组中接种腭转化的大肠杆菌

20、细胞都具有抗性，故能长满菌；实验组中接种的一部分大肠杆菌细胞内含有外源质粒因此具有抗性，一部分大肠杆菌内不含外源质粒不具抗性，故实验组只长了少量的菌落，阴性对照组中接种的细胞不具抗性，故在培养基中不能生长。阳性转化菌落的鉴定如图所示：2.3.2重组蛋白的亲和纯化及SDS-PAGE检测构建表达载体时，在GFP的N端引入6个组氨酸标签。亲和层析柱的NTA填料有4个金属螯合位点，能牢固螯合Ni2+，而Ni2+有两个开放的互补位点可与组氨酸结合。当组氨酸与Ni2+结合后，使得带有His6标记的蛋白质就受到阻滞，挂在层析柱上。利用咪唑与目的蛋白竞争金属离子结合位点的特性，通过提高洗脱液中咪唑的浓度，与H

21、is6标记蛋白竞争Ni2+结合位点，从而将组氨酸标记蛋白洗脱下来。利用此原理纯化目的蛋白EGFP。SDS-PAGE电泳检测结果如下图：以上是我们第二组同学SDS跑胶出来的结果图，效果并不是很好，主要原因是刚开始的时候电压稍微大了一点，泳动速度太快了，没有达到很好的分离效果，我们下面再粘一张一组同学的结果，比我们的要好很多：然后是western的结果图，我们组的在洗脱脂牛奶的时候没有洗干净，再加上之前跑胶结果不是很理想，所以条带特别浅，出现的时间也特别慢，我们借用一组同学的结果：下面是单独一条带（颜色比较浅）：重组蛋白的Western Blotting检测实验利用重组表达的GFP蛋白与源于小鼠的GFP抗体结合（融合蛋白上具有抗X press抗体结合序列，可供免疫学方法检测），抗体上经辣根过氧化物酶（HRP）标记，其能与底物氯萘酚反应生成蓝粉色物质。但如图所示最后Western Bl