核酸分子杂交的种类及应用

1、核酸分子杂交 摘要：核酸分子杂交技术是基因工程中重要的研究手段， 是目前生物化学、 分子 生物学、和细胞生物学研究中应用最广泛的技术之一。 也是现阶段定性、 定量和 定位检测 DNA 与 RNA 序列片段必须掌握的基本技术和方法。本文主要介绍了 核酸分子的原理，分类以及它的相关应用。关键词 ：核酸分子；分类；应用；1. 核酸杂交技术的原理核酸分子（DNA、RNA）是由许多单核苷酸分子通过 3, 5磷酸二酯键相互 连接所形成的生物大分子。 DNA 分子双链的形成， DNA 的复制，以及 RNA 的 转录等都遵循碱基互补配对原则。 DNA 是由两条互补配对的单核苷酸链通过氢 键连接的双链分子。 双

2、链结构的核酸分子在加热、 偏碱环境或受尿素、 甲酰胺等 氢键解离剂的作用，则形成单链分子，称为核酸“变性”。两条单链核甘酸若有 同源顺序，则在一定条件下，他们的碱基互补配对，从而形成双链分子，称为核 酸“复性”或核酸“杂交” 1 。核酸分子杂交是用核酸分子的变性，复性等理化 性质而设计的一种常用技术。 通常利用一种顺序已知， 并被放射性同位素标记的 核酸片段看作为探针， 与未知样品的核酸进行分子杂交， 如果样品中的核酸与探 针有碱基互补顺序就能形成杂交分子。 此时标有同位素或生物素的探针则固定在 标本上，用放射性自显影法或免疫组化法可显示出探针2。核酸分子杂交可分为液相杂交、固相杂交和原位杂交

3、 3。2. 固相分子杂交 ：将待测的靶核甘酸链预先固定在固体支持物（硝酸纤维素膜或尼龙膜）上， 而标记的探针则游离在溶液中， 进行杂交反应后， 使杂交分子留在支持物上， 然 后再进行检测和计算。固相分子杂交又可分为：Southern印迹杂交、Northern印迹杂交、Western印迹 杂交、斑点杂交、菌落原位杂交等。2.1 Southern印迹杂交1975 年建立的一种 DNA 转移方法。该法利用硝酸纤维素膜 （或经特殊处理 的滤纸或尼龙膜 ）具有吸附 DNA 的功能。首先用酚提法从待检测组织中提取 DNA ，然后以限制性内切酶消化待测的 DNA 片段，接着进行琼脂糖凝胶电泳使 DNA 按分

4、子量大小分离， 电泳完毕后， 将凝胶放入碱性溶液中使 DNA 变性，解 离为两条单链。再在凝胶上贴上硝酸纤维素膜，使凝胶上的单链 DNA 区带按原 来的位置吸印到膜上。 然后直接在膜上进行核酸探针 （已被同位素标记） 与被测 样品之间的杂交，再通过放射自显影对杂交结果进行检测 4。2.2 Northern印迹杂交1976 年 Alwine 建立了该方法。这是一种将 RNA 从琼脂糖凝胶中转印到硝 酸纤维素膜上的方法。其检测过程与 Southern 转移杂交基本相同，所不同的是 用 DNA 探针检测经凝胶电泳分开的 RNA 分子。它主要用于研究基因的转录活 性及表达 5 。2.3 Western

5、印迹杂交Western印迹是指将蛋白质样品经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，然后转移至到 固相载体上，然后用抗体通过免疫学反应检测目的蛋白，分析基因的表达程度。固相载体以非共价键形式吸附蛋白质， 且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学 活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应， 再与酶或同位素标记的第二抗体起反应， 经过底物显色或放射自显影以检测电泳 分离的特异性目的基因表达的蛋白成分 6。2.4 斑点杂交将待测核酸样品进行 DNA 或 RNA 变性处理后，直接点在硝酸纤维素滤膜 上，经烘烤固定后， 与同位素或生物素标记的探针进行杂交， 杂交后放射性双链 DNA 可使 X 光

6、胶片感光，形成自显影斑点。2.5 菌落原位杂交 将培养基上长出的菌落通过影印方法转移到硝酸纤维素膜上， 碱变性破坏细 菌的细胞壁使其释放出 DNA ，并经变性处理使双链 DNA 解链，经烘烤固定后， 用同位素标记的探针进行杂交，最后放射自显影。如果底片上出现蝌蚪状黑点， 即证明相应的菌落中具有与探针 DNA 同源的核酸片段。3. 液相分子杂交 5液相分子杂交是将待测的核酸样品和同位素标记的 DNA 探针同时溶于杂交 液中进行反应， 然后分离杂交双链和未参加反应的标记探针， 用仪器检测并计算 分析杂交结果。4. 原位杂交 将标记探针与细胞或组织中的核酸按碱基配对原则进行特异性杂交， 并应用 组织

7、化学或免疫组织化学方法在显微镜下进行细胞定位或基因表达的检测技术。5. 应用5.1 基因诊断、传染病病原体的检测 核酸分子杂交具有很高的灵敏性和特异性，因而该技术目前已用于多种遗传 性疾病的基因诊断、 恶性肿瘤的基因分析、 传染病病原体的检测等领域中， 其成 果大大促进了现代医学的进步和发展。例如，我们可以用 DNA 杂交技术来检测 某人是否感染了乙肝病毒（乙肝病毒的遗传物质是 DNA ）。方法是拿一个用荧 光或同位素标记的 DNA 分子探针（这个探针就是乙肝病毒 DNA 分子），如果 被检测的 DNA 分子和探针杂交了，或者说杂交的部位非常多，则说明被测者感 染了乙肝病毒； 如果被检测的 D

8、NA 和探针没有杂交， 或者说杂交的部位非常少， 则说明被测者没有感染乙肝病毒。5.2 在生物合成代谢研究中的应用用逆转录酶可以在体外以 mRNA 为模板合成 DNA ，此种 DNA 称互补 DNA（cDNA） 。用 cDNA 作为探针，可以检测细胞中的 mRNA 。它的敏感性比直 接测定蛋白质要高 1000 倍。以 cDNA 作为探针的原位杂交技术结合蛋白测定技 术，可以了解单个细胞内 mRNA 的翻译水平，即蛋白质合成能力，从而可以了 解组织器官的代谢和功能状态，以及器官组织内不同细胞群的功能差异,并能同时进行形态学观察。参考文献1 .王 平，核酸分子杂交技术及其应用J.井冈山医专学报.1996, 3 (2): 15-17.2 .宋胜华.核酸分子杂交技术及其应用J.临床与实验病理学研究.1987, 3(3): 185-188.3 .尹和平，张世荃.简述核酸分子杂交技术J.生物学通报.1992,6:16-48.4 .易先平.核酸杂交技术及其