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1、革兰氏染色法的原理及其练习摘要:革兰氏染色反应是细菌重要的鉴别特征,所以学习微生物学,进行革兰氏染色实验是很重要的。为保证染色结果的正确性,采用规范的的染色操作方法是十分必要。本实验主要对大肠杆菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus Rosenbach)、枯草杆菌 (Bacillus subtilis)进行革兰氏染色,观察它们的染色特征,辨别是革兰氏阴性还是阳性,从而掌握其染色方法。染色方法与过程很清晰,但实验结果中金黄色葡萄球菌(S.aureus Rosenbach)多组呈现假阴性。本实验的主要目的是熟悉并掌握革兰氏染色方法及原理,
2、但要想做出很好的染色得多加练习。本实验还可以锻炼显微镜操作技术和无菌操作技术。 关键词:革兰氏染色 大肠杆菌(E.coli) 金黄色葡萄球菌(S. aureus Rosenbach) 枯草杆菌(B.subtilis)引言革兰氏染色是微生物学中最重要的鉴别染色方法,它可以直接将细菌分为革兰氏阴性和革兰氏阳性。革兰氏染色法可将细菌分为革兰氏阳性(G+)和革兰氏阴性(G-)两种类型,这是由这两种细菌细胞壁结构组成与结构的差异所决定的。经过一定的染色过程后,革兰氏阳性的细菌会因为细胞壁肽聚糖的含量高,脂质含量低而保持第一次染色的蓝紫色。革兰氏阴性细菌细胞壁的脂质含量高,乙醇处理时脂质溶解,蓝色被洗脱,
3、复染后变为红色。革兰氏染色原理很简单,染色时需注意要注意使用处在活跃生长期的细菌,涂片不宜过厚,严格控制脱色时间。大肠杆菌(E.coli)是革兰氏阴性细菌,金黄色葡萄球菌(S. aureus Rosenbach)与枯草杆菌 (B.subtilis)都是革兰氏阳性细菌,染色后在显微镜下容易区别。同时它们的形态各异,可以根据具体颜色和形态差异来判断染色是否成功。本实验还涉及到高倍油镜的使用。使用油镜与用一般的镜头不同,具体使用在实验方法中描述。 1.1材料1.1.1菌种大肠杆菌16小时牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养物,金黄色葡萄球菌16小时牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养物,枯草杆菌16小时牛肉膏蛋白胨琼脂斜面
4、培养物。1.1.2 溶液与试剂 无菌生理盐水,草酸铵结晶紫染液,卢戈氏碘液,95%乙醇,番红复染夜,香柏油,二甲苯1.1.3仪器 酒精灯,载玻片,显微镜,双层瓶,接种环,滴管等1.2 方法 1.2.1 制片:取活跃生长期菌种按常规方法涂片(不要太厚)、干燥和固定。 1.2.2染色 (1)初染:滴加草酸结晶紫染液覆盖涂菌部位,染色2min,水洗至流出水无色。 (2)媒染:用卢戈氏染液冲去残留水迹,再用碘液覆盖1min,倾去碘液,水洗至流出水无色。 (3)脱色:将玻片上的水用吸水纸吸取,用滴管流加95%乙醇脱色(持续20秒),稍后立即洗去乙醇。 (4)复染:将玻片上的水用吸水纸吸去,用番红复染液染
5、色2min,水洗,吸去残水烤干。 1.2.3 镜检 分别用香柏油覆盖涂菌部位,先用低倍镜找到菌,换用100倍的物镜观察染色情况。观察结束后,用二甲苯擦洗镜头。2实验结果与分析2.2 结果分析 大肠杆菌竟革兰氏染色后呈现红色,3个图片上都是红色,因此大肠杆菌应该是革兰氏阴性细菌,与事实相符,染色成功。 金黄色葡萄球菌比较难染色,从结果中可以分析,前两个涂片的菌种可能培养的时间太长了。因为老龄的革兰氏阳性细菌会被染成红色而造成假阴性,老龄的G+细菌细胞壁老化,不能在乙醇处理的时候使肽聚糖网孔收缩而使碘-结晶紫复合物滞留在细胞壁,从而在复染时被染红。 枯草杆菌染色结果很好,蓝紫色很明显,染色成功。1.3.3 小结 1、获得本实验成功的关键:固定时烘烤要适度,太轻会在冲洗时冲走细菌,过度会破坏细菌形态;脱色的时间要严格控制,脱色不够造成假阳性,脱色过度会出现假阴性;选用新培养的菌种,涂片时不能太厚。这些问题在实验过程中几乎都有出现,尤其是对于初学者,特别需要注意。 2、 革兰氏
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