食品安全与微生物检验课件

1、食品安全及微生物检测技术,几个问题： 一、食品安全和控制 二、微生物基础知识 三、微生物检测的基本技术 四、培养基制作及原理、现象 五、常见生化反应，血清学反应 六、新的仪器和方法 七、食品技术网络交流,1.1 食物、食品与食品工业 1.2 食品安全和技术壁垒 1.3 食品安全事件和食品危害物 1.4 三个阶段：食品安全管理,一、食品安全和控制,1.1 食物、食品与食品工业,食物是人体生长发育、更新细胞、修补组织、调节机能必不可少的营养物质，也是产生热量保持体温、进行体力活动的能量来源。 食品经过加工制作的食物统称为食品,食品的分类,分类：食品分类的方法很多，可以按保藏方法分、按原料种类分、按

2、原料和加工方法分、按产品特点分,按保藏方法分类,dehydrated garlic flake 干藏类,芋籽冷冻类,Canned Mushroom 罐头类,黄瓜腌渍类,辐射制品,发酵制品,烟熏制品,按原料种类分,果蔬制品,肉禽制品,乳制品,谷物制品,水产制品,按加工方法分,焙烤制品,饮料,糖果,罐头制品,挤压制品,速冻制品（绿芦笋,干制品,发酵制品,按产品特点分,方便食品,疗效食品,婴儿食品,工程食品 （模拟食品,快餐食品,休闲食品,功能食品 （保健食品,食品的要求,外观 风味 营养 卫生和要求 货架寿命 方便 功能性质,食品工业,广义上讲，食品工业无论从哪个角度都是各个国家国民经济的基础或支

3、柱之一。 广义食品工业包括农业、食品制造、市场三个方面 整体而言，食品工业也是一个永不衰弱的行业，是一个非常稳定的行业，更是一个充满变化、有活力的行业,由于食品工业是国民经济的重要支柱产业和关系国计民生及关联农业、工业、流通等领域的大产业，因此，食品工业现代化水平是反映人民生活质量及国家文明程度的重要标志。 作为农产品面向市场的主要后续加工产业，食品工业在农产品加工中占有最大比重，对推动农业产业化作用巨大。 1999年全世界食品工业的销售额为2.7万亿美元，居各行业之首,我国的食品工业,我国2000年食品工业总产值、利税分别为8434.1亿元和1458.3亿元，占全国工业总产值、利税的9.8%

4、和15.3%；年出口创汇136.7亿美元。 食品工业企业达19316个，就业人数达403.7万，占全国工业企业就业总人数的7.3%。 食品工业是整个工业中为国家提供积累和吸纳城乡就业人数最多、与农业关联度最强的产业,1.2 食品安全及技术壁垒,食品量的安全(Food security) 对经济学家来说， 食品安全通常被定义为有足够的收入购买必要的食品 在中国, 食品安全较多地被定义为食品（或是更常见的是粮食）的自给自足。强调自给自足反映了当时合理的考虑: 历史上饱受饥荒之苦; 人口众多；中国的食品供应绝大多数依靠国内生产 以前担心缺乏外汇进口食品，现在无此必要。另外，中国也曾有过国外对中国实施

5、贸易禁运的担忧; 但食品禁运很难实行。 吃饱的问题 民以食为天 深挖洞，广积粮，缓称王。 联产承包。要吃粮，找紫阳，要吃米，找万里,质的安全(Food safety,WTO贸易技术壁垒（TBT）协定规定: “在涉及国家安全问题、防止欺骗行为、保护人类健康和安全、 保护生命和健康以及保护环境等情况下，允许各成员方实施 与国际标准、导则或建议不尽一致的技术法规、标准和合格 评定程序,国际贸易：技术壁垒,影响农业和食品工业竞争力,非关税 措 施,数量限制措施,贸易壁垒措施,贸易壁 垒措施,关税措施,技术贸易 壁垒措施,TBT壁垒措施,SPS壁垒措施,GBs(ETBs,IT壁垒措施,包装和标签要求,原

6、产地地理标识,计量单位制国际单位(SI)制与英制,技术性贸易壁垒的含义 技术性贸易壁垒:系指在贸易领域采取的、对正常贸易起阻碍作用的所有技术性措施，主要表现为TBT协定和SPS协定管辖的技术性贸易壁垒措施,TBT： Agreement on Technical Barriers to Trade 技术性贸易壁垒协定 SPS ：Agreement on the Applications of Sanitary and Phytosanitary Measures 实施卫生与植物卫生措施协定,TBT协定涵盖的领域,TBT协定涵盖所有产品，包括工业品和农产品（TBT第1.3条） TBT协定不适用于S

7、PS协定附件A定义的SPS措施（TBT第1.5条） 凡不属SPS协定管辖的，均属TBT协定管辖 （SPS第1.4条,TBT措施包括,技术法规（附件1第1条） 标准（附件1第2条） 合格评定程序（附件1第3条,TBT ：技术要求分类,技术法规,强制性要求,标准,自愿性要求,技术要求,TBT：技术要求定义（附件1第1-2条,用于描述产品特征或相关工艺和生产方法、服务或材料的一系列特征或数量要求。这些特征涉及的内容可以包括大小、尺寸、重量、功能等,什么是合格评定程序? （附件1第3条,合格评定程序：任何直接或间接用以确定某一产品是否满足技术法规或标准中的相关要求的程序。 合格评定程序包括：抽样、检验

8、和检查；评估、验证和合格保证；注册、认可和批准以及各项的组合,由食品、饮料、饲料中的添加剂、污染物、毒素、致病有机体造成的风险,因虫害的传入、定居或传播所造成的损害,国家,人类生命,植物或动物携带的病害造成的风险,人类或动物生命,保护,免遭,SPS措施的定义（附件A,动物或植物生命,虫害、病害、致病有机体造成的风险,产品标准 检疫措施 加工要求 认证,检验 测试 健康标签,所有具有上述SPS目的的措施，包括,SPS措施有哪些型式,化学危害：生物毒素、农药残留、兽药残留、食品添加剂、重金属,物理危害：玻璃、金属异物等,1.3 食品危害物,生物危害：微生物、寄生虫,危害（Hazard）： 指存在于

9、食品中的具有潜在损害的生物、化学和物理因子,瘦肉精 毒大米 蔬菜农残,食品安全问题,大肠杆菌 O157:H7,吊白块,疯牛病,二恶英,阜阳奶粉事件,毛发水酱油,三无产品： 无商标、无生产日期、无生产地址 无毒 无害 无营养,微生物危害,美国，每年约有7200万人发生食源性疾病， 造成3500亿美元的损失,2001年，江苏、安徽等地，肠出血性大肠杆菌O157:H7， 造成177人死亡，中毒人数超过2万人,1999年，宁夏，沙门氏菌污染肉品，食物中毒暴发， 发病人数上千人,80年代，上海，毛蚶，甲型肝炎爆发，累及30万人,美国沙门氏菌发病案例报告,英国食源性疾病发病报告,澳大利亚食源性疾病发病报告

10、,欧洲食源性疾病,弧菌病趋势,沙门氏菌（禽、畜肉） 副溶血性弧菌（水产品） 蜡样芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌（剩饭） 肉毒梭菌（发酵制品、肉制品） 单核细胞增生李斯特菌（乳制品、冷藏食品） 大肠杆菌O157:H7（肉制品）等,我国微生物性食物中毒常见的致病菌和食物,全国食品污染物监测网 食源性致病菌主动监测 四年结果统计分析 （2000、2001、2002、2003,全国6类食品中三种致病菌连续监测阳性率变化,全国6类食品中三种致病菌连续监测阳性率变化,全国食品中三种致病菌连续监测阳性率变化,全国食品中三种致病菌连续监测阳性率变化,连续监测对食源性致病菌暴发流行有预警意义。大肠肝菌O157:H7在

11、 局部流行区与非流行区阳性率与毒力不同。 连续四年的监测数据显示三种致病菌对食品的污染普遍存在，污染最为严重的为肉与肉制品、水产品 。 大肠肝菌O157:H7的污染率变化不大，沙门氏菌、李斯特氏菌的污染率持续增长,根据WHO估计,发达国家食源性疾病的漏报率在90%以上,发展中国家食源性疾病的漏报率95%以上,冰山一角,1.4 食品安全控制与管理,安全卫生惯例，行为规范（Practices） 着重生产及加工的整体卫生 危害分析和控制（HACCP） 着重食品中的病原、危害控制 风险评估，风险分析（Risk analysis） 着重整个食品链,三次浪潮：惯例、危害、风险,食品安全管理的第一次浪潮,行

12、为规范 GHP; GMP; SSOP; The WHO Golden Rules for Safe Food Preparation; The WHO Five keys to safer food; USDA/FDA Four steps to Food safety,良好卫生规范 (GHP)(一,GHP是遵循国际食品法典委员会制定的食品卫生通则而建立的规范 ; 国际食品法典委员会（CAC）于1969年制定食品卫生通则，到1999年已经作了第4次修订 ; 良好卫生规范涉及世界各国范围内应当遵循的食品安全和食品适宜性的各项要求，其目的是使食品生产涉及的所有条件和措施能确保食物链中各个阶段食品的

13、安全性和适宜性,良好卫生规范 (GHP)(二,审查的范围有： 初级产品的生产; 食品生产经营企业的设计; 食品生产企业的操作规程; 食品生产经营操作的控制及其规范; 食品生产经营企业的维护及卫生管理; 个人卫生; 运输; 产品信息; 培训,良好生产规范 (GMP,美国于1963年正式将其引入药品生产; 美国于1969年制定了适用于食品生产的GMP; 1969年第22届世界卫生大会上，WHO建议各成员国的药品生产采用GMP，以保证药品质量; GMP有3种,即药品GMP、食品GMP及医疗器械GMP； GMP是生产和质量控制程序结合，以保证产品生产的一致性，达到其规格要求,良好卫生操作规范（GMP,

14、食品GMP的管理要素包含四个M： 人员（Man） 要由适任的人员来制造与管理。 原料（Material） 要选用良好的原材料来制造。 设备（Machine） 要采用标准的厂房和机器设备。 方法（Method） 要遵照既定的最适方法来制造,国内外GMP所包含内容的对比,结论,通过对国内外各类GMP内容的对比，可以看出，我国的出口食品厂、库卫生要求及出口食品加工企业卫生注册规范与其它的GMP在内容、法律效率方面是一致的,卫生标准操作程序 （SSOP,SSOP是一个书面方法，由企业根据GMP制定 ； SSOP的目的是防止产品受到各种危害的污染；控制不当温度条件而引起的微生物生长；以及保证维护和保养设

15、备的程序到位,卫生标准操作程序 （SSOP,一份SSOP书面计划包括多个卫生标准操作程序，每个卫生标准操作程序书写内容又大致包括5个方面： 标准的要求； 卫生标准操作程序； 监测； 修正措施； 记录,SSOP的八个方面,1)水和冰的安全性 2)食品接触表面的清洁和卫生 3)防止交叉污染 4)洗手, 手的消毒和卫生间设施的维护 5)防止外来污染物造成的掺假 6)有毒化合物的处理, 贮存和使用 7)雇员的健康状况 8)昆虫与鼠类的扑灭及控制,GMP与SSOP的关系,SSOP 指企业为了达到GMP所规定的要求，保证所加工的食品符合卫生要求而制定的指导食品生产加工过程中如何实施清洗、消毒和卫生保持的作

16、业指导文件。它没有GMP的强制性，是企业内部的管理性文件。 GMP 的规定是原则性的，包括硬件和软件两个方面，是相关食品加工企业必须达到的基本条件。 SSOP 的规定是具体的，主要是指导卫生操作和卫生管理的具体实施，相当于ISO9000质量体系中过程控制程序中的“作业指导书”。制定SSOP计划的依据是GMP，GMP是SSOP的法律基础，使企业达到GMP的要求，生产出安全卫生的食品是制定和执行SSOP的最终目的,世界卫生组织的十大黄金法则,其内容包括: 选择安全加工的食品; 彻底烹调食物; 做好的食物应立即食用; 小心存放已烹调好的食物; 剩余的食物在食用前要重新完全加热; 避免生食物与熟食接触

17、; 反复洗手; 保持厨房所有表面的清洁; 防止食物受到昆虫、鼠害及其他动物的污染； 使用安全的水,WHO保障安全食物的五个关键,其内容包括: 保持清洁： 生食与熟食分开； 彻底烹调食物; 在安全温度下保存食物； 使用安全的水和安全的原料,美国USDA/FDA食品安全的四步法,其内容包括: 清洁； 防止交叉污染； 烹调； 冷藏,食品安全管理的第二次浪潮,危害分析关键控制点是一个鉴别、评价和控制食品安全危害的系统 ; 危害分析关键控制点是一个世界公认的、系统的预防方法，通过预测和预防而不是依赖于终末产品的监督和检验来消除微生物、化学和物理性危害,Hazard Analysis and Critic

18、al Control Point 危害 分析 与 关键 控制 点 HACCP:食品安全卫生预防控制体系,HACCP发展,60年代末始创于美国宇航食品,93年 EU 委员会HACCP决议/指令,美国 95年 颁布水产品HACCP法规,97年 CAC 颁布HACCP法规,美国 97年 颁布禽、肉法规,美国 2001年 颁布果蔬汁HACCP法规,92年美国NACMCF提出HACCP应用原则,养殖业、饲料加工业、餐饮业、行政管理,1973美国发布低酸罐头HACCP法规,我国2002年发布食品企业HACCP管理规定,美国国家食品微生物学标准顾问委员会,HACCP七个原理,1. 危害分析与预防控制措施(H

19、A) 2. 确定关键控制点(CCP) 3. 建立所确定的关键控制点极限值(CL) 4. 对关键控制点进行监控(M) 5. 建立纠偏程序(CA) 6. 建立有效的记录及保存系统(R) 7. 建立验证程序(V,HACCP体系的特点,HACCP体系是一种预防性控制体系，而非反应性的体系； HACCP不是一个孤立的体系，必须建立在GMP和SSOP基础之上； HACCP体系具有特异性； HACCP体系不是一个零风险的体系，但它是目前国际上公认的控制食品安全危害的最有效的体系； HACCP和ISO9000一样需要持续改进,GMP、SSOP与HACCP的关系,GMP、SSOP 是制定和实施HACCP计划的基

20、础和前提。没有GMP、SSOP，实施HACCP计划将成为一句空话。SSOP计划中的某些内容也可以列入HACCP计划内加以重点控制。 GMP、SSOP控制的是一般的食品卫生方面的危害，HACCP重点控制食品安全方面的显著性危害。 仅仅满足GMP和SSOP的要求，企业要靠繁杂的、低效率和不经济的最终产品检验来减少食品安全危害给消费者带来的健康伤害（即所谓的事后检验）；而企业在满足GMP和SSOP的基础上实施HACCP计划，可以将显著的食品安全危害控制和消灭在加工之前或加工过程之中（即所谓的事先预防）。 GMP、SSOP、HACCP的最终目的都是为了使企业具有充分、可靠的食品安全卫生质量保证体系，生

21、产加工出安全卫生的食品，保障食品消费者的食用安全和身体健康,GMP,SSOP,8个方面,7个基本原理,HACCP,4M,食品安全管理的第三次浪潮,风险分析 :Risk Analysis. 风险分析（Risk Analysis）的概念于80年代末被应用于食品安全管理 ; 1997年，在意大利罗马召开的FAO/WHO食品标准、食物化学及食品贸易会议上作出了“在评价时继续以适当的科学原则为基础并遵循风险评估的决定” 风险（Risk）指人群暴露于食品危害后造成不良影响的可能性和严重性,风险分析,食品风险分析是针对国际食品安全性应运而生的一种宏观管理模式 ； 风险分析是保证食品安全的一种新模式，同时也是

22、一门正在发展中的新兴学科； 风险分析已被认认为是制定食品安全标准的基础。 风险分析包括三部分：风险评估、风险管理、风险信息交流,风险评估,风险评估是利用现有的科学资料，对食品中某种生物、化学或物理因素的暴露对人体健康产生的不良后果进行识别、确认和定量。它分为4个阶段：危害识别、危害特征描述、暴露评估以及风险描述,风险管理,风险管理是根据风险评估的结果，同时考虑社会、经济等方面的有关因素，对各种管理措施的方案进行权衡，并且在需要时加以选择和实施。风险管理的首要目标是通过选择和实施适当的措施，尽可能有效地控制食品风险，从而保障公众健康。措施包括制定最高限量，制定食品标签标准，实施公众教育计划，通过

23、使用其他物质、或者改善农业或生产规范以减少某些化学物质的使用。 风险管理可以分为4个部分：风险评价、风险管理选择评估、执行管理决定、以及监控和审查,风险情况交流,风险情况交流是指在风险评估人员、风险管理人员、消费者和其他有关的团体之间就与风险有关的信息和意见进行相互交流。风险情况交流应当包括国际组织(包括CAC、FAO和WHO、WTO)、政府机构、企业、消费者和消费者组织、学术界和研究机构、以及媒体。其中一个特别重要的方面，就是将专家进行风险评估的结果以及政府采取的有关管理措施告知公众或某些特定人群(如老人、儿童、以及免疫缺陷症、过敏症、营养缺乏症患者)，以及建议消费者可以采取的自愿性和保护措

24、施等,风险分析与HACCP体系的区别与联系,风险分析是一种宏观管理模式，是政府行为；是制定食品标准的基础。 HACCP是一种“预防性”的风险管理措施 ，是企业行为,食品安全三次浪潮之间的关系,第一次浪潮以GHP为代表,重点是食品生产加工的一般卫生原则， 第二次浪潮（HACCP）的重点是鉴别、评价和控制食品中危害因子； 第三次浪潮（Risk analysis）的重点是人类健康和整个食物链,2.1 认识微生物 2.2 常见微生物指标菌及致病菌 2.3 微生物检测的一般流程,二、微生物基础知识,微生物是一个通称,种类多、分布广 繁殖快 适应性强 易变异,形体微小，结构简单的低等生物,病毒、细菌、放线

25、菌、真菌,2.1 认识微生物,真核细胞型微生物细胞核分化程度高，有核膜和核仁，细胞器完整。如真菌。 原核细胞型微生物细胞核的分化较低，仅有原始核，无核膜、核仁。细胞器很不完善。DNA和RNA同时存在。这类微生物众多，有细菌、放线菌、支原体、衣原体、立克次体、螺旋体。 非细胞型微生物是最小的一类微生物。无典型的细胞结构，只能在活细胞内生长繁殖。核酸类型为DNA或RNA。病毒属之,球菌(coccus,脑膜炎奈瑟菌,双球菌(diplococcus,链球菌(streptococcus,球菌(coccus,球菌(coccus,葡萄球菌(streptococcus,球菌(coccus,四联球菌(tetra

26、d,球菌(coccus,八叠球菌(sarcina,杆菌(bacillus,不同杆菌的大小、长短、粗细很不一致,杆菌的形态多样,杆菌(bacillus,杆菌(bacillus,杆菌的形态多样,分枝杆菌,双歧杆菌,螺形菌(spiral bacterium,微生物从不知到知的过程,酿酒、天花，列文虎克、巴斯德、 科赫,远古人类发现，吃剩的米粥数日后变成 了醇香可口的饮料人类最早发明的酒,酒池肉林史记,列文虎克 荷兰,1673年 自制显微镜 “小动物”的微生物世界,法国科学家巴斯德,彻底否定了自然发生说,证实发酵由微生物引起,免疫学预防接种,发明巴氏消毒法,巴 斯 德 的 雁颈瓶实验,巴斯德发现免疫现

27、象,减毒疫苗： 炭疽杆菌：1881 狂犬病疫苗：1885，9岁男孩梅斯特,1940,第一次用科学的方法证明某种特定的微生物是某种特定疾病的病原,培养出炭疽杆菌、霍乱弧菌、结核杆菌等病原微生物,德国科学家科赫,要判定一种病原体，必须同时满足四个条件： 第一，必须在所有病人身上发现病原体； 第二，必须从病人身上分离并培养出病原体； 第三，把培养出的病原体接种给动物， 动物应该出现与病人相同的症状； 第四，从出现症状的动物身上能够分离培养出同一种病原体,科赫原则 和 SARS病原,2003年2月18日，中国疾病预防中心认为非典型肺炎病原体为衣原体。 他们是通过电镜从2例尸解标本中发现衣原体样颗粒。正

28、确么,2.2 常见卫生指标及致病菌,细菌总数 大肠菌群和粪大肠菌群/耐热大肠菌群 肠道杆菌 大肠杆菌 沙门氏菌 金黄色葡萄球菌 单增李斯特氏菌 肉毒梭菌 致病性弧菌 霉菌和酵母菌,2.2.1 细菌总数：菌落总数,菌落(colony)：生长在固体培养基上，来源于一个细胞，肉眼可见的细胞群体,菌落形成单位CFU(colony forming unit,平板菌落计数TPC(total plate count,菌落总数(total colony number)：通过平板菌落计数的方法，对被检样品单位重量、容积、面积的活菌在普通营养琼脂平板上形成的菌落进行计数，所得到的所有嗜中温的、需氧和兼性厌氧的细菌

29、菌落总数。是活的细胞总数。 细菌总数(total bacteria number)是死的、活的细胞的总数,指标说明,某产品出口欧盟，欧盟的要求： 细菌总数： m: 10000 M: 100000 n: 5 c: 2,梯度问题,编号 10倍 100倍 1000倍 结果 1 360 380 200 243 146 191,2.2.2大肠菌群,卫生指标和意义,定义,MPN值：Most Probable Number Method,报告：大肠菌群MPN3/克,3个大肠菌群/1L饮水 100个细菌总数/1ml饮水,我国饮用水卫生标准,平板计数问题,8大肠菌群固体培养基测定法 8.2.1选取适宜的三个连续

30、稀释度的样品液,每个稀释度接种两个灭菌平皿,每皿1mL。 另取1mL稀释剂加入一个灭菌平皿中,作空白对照。 8.2.2将冷至450.5的结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)1015mL倾注于每个平皿中。小 心旋转平皿,将培养基与样液充分混匀。 8.2.3待琼脂凝固后,再加34mL VRBA覆盖平板表层。 8.2.4翻转平板,置于361培养1824h。 8.2.5选用有30150个菌落的平板,计数平板上出现的典型大肠菌群菌落。典型菌落为 紫红色,菌落周围有红色的胆盐沉淀环。菌落直径为0.5mm或更大。 8.2.6证实 8.2.6.1从VRBA平板上挑取10个不同类型的典型和可疑菌落,移种于BGLB肉

31、汤管内, 36 1培养24h和48h,观察产气情况。 8.2.6.2将出现产气的肉汤管判为大肠菌群阳性。对形成菌膜的阳性管,应进行革兰氏 染色,以便排除革兰氏阳性杆菌。 8.2.7结果报告 经最后证实为阳性(产气,革兰氏阴性杆菌) 的试管百分比乘以于8.2.5条中计数的平 板菌落数,再乘以稀释倍数,即为每克(毫升)样品中大肠菌群数。 例：10*-4样品稀释液1mL,在VRBA平板上有100个典型和可疑菌落,挑取其中10个接种BGLB肉汤管,证实有6个阳性管,则该样品的大肠菌群数为： 1006/1010*4/g(mL)6.010*5/g(mL,北美国家一般使用“粪大肠菌群”概念，如AOAC、FD

32、A。SN中的“粪大肠菌群”概念为等同采用AOAC方法，故而使用粪大肠菌群概念；而欧洲使用“耐热大肠菌群”概念，较少使用“粪大肠菌群,项目 依据 耐热大肠菌群 NMKL、ISO 粪大肠菌群 NMKL AOAC,定义 在44.5培养，24h内能产酸产气的细菌 在胰蛋白胨肉汤中于44.5，24h内产生吲哚的耐热大肠菌群 于LST中36培养48h内产气，并于EC内培养4424h产气的一群细菌,作为一种卫生指标菌，耐热大肠菌群中很可能含有粪源微生物，因此耐热大肠菌群的存在表明可能受到了粪便污染，可能存在大肠杆菌。但是，耐热大肠菌群的存在并不代表对人有什么直接的危害。 作为粪便污染指标菌，耐热大肠菌群与大

33、肠菌群、大肠杆菌相似，主要以其检出情况来判断食品是否受到了粪便污染。粪便是肠道排泄物，有健康者，也有肠道病患者或带菌者粪便，所以粪便中既有正常肠道菌，也可能有肠道致病菌（如沙门氏菌、志贺式菌、霍乱弧菌、副溶血弧菌等）和食物中毒者。因此，食品既然受到粪便污染就有可能对食用者造成潜在的危害。 通常情况下，耐热大肠菌与大肠菌群相比，在人和动物粪便中所占的比例较大，而且由于在自然界容易死亡等原因，耐热大肠菌群的存在可认为食品直接或间接的受到了比较近期的粪便污染。因而，耐热大肠菌群在食品中的检出，与大肠菌群相比，说明食品受到了更为不清洁的加工，肠道致病菌和食物中毒菌的可能性更大,2.2.3 肠道杆菌(e

34、nteric bacilli,一大群居住在人和动物肠道中 生物学性状近似的革兰阴性杆菌,属于肠杆菌科,多数是肠道的正常菌群,至少有30个菌属，120个以上的菌种,少数为致病菌，是胃肠传染病的最重要病原菌,肠杆菌科中与医学有关的常见菌族和菌属,埃希菌族 埃希菌属 大肠杆菌 志贺菌属 痢疾志贺菌 爱德华菌族 爱德华菌属 迟钝爱德华菌 沙门菌族 沙门菌属 伤寒沙门菌 枸橼酸菌属 佛劳第枸橼酸菌 克雷伯菌族 克雷伯菌属 肺炎克氏菌 肠杆菌属 产气肠杆菌 哈夫尼亚菌属 蜂窝哈夫尼亚菌 沙雷菌属 粘质沙雷菌 变形杆菌族 变形杆菌属 普通变形杆菌 摩根菌属 摩氏摩根菌属 普罗威登斯菌属 雷氏普罗威登斯菌 耶

35、尔森菌族 耶尔森菌属 鼠疫耶尔菌 欧文菌族本 欧文菌属 草原居民欧文菌,菌族 菌属（菌种数） 代表种,乳糖发酵试验,共同特性,1、相似的形态染色,2、简单的培养条件,3、活泼的生化反应,重要试验,初步鉴别肠道致病菌和肠道非致病菌,肠道致病菌,肠道非致病菌,多数不发酵乳糖,多数发酵乳糖,5、抵抗力,不强,6、易变异,溶源性转换,生化反应性变异,通过,引起,耐药性变异,毒力性变异,转导,接合,4、抗原构造复杂,2.2.4 大肠杆菌,埃希氏菌属 Escherichine,是人类和动物肠道中的正常菌群,出生后数小时就进入肠道，并终生伴随,以大肠埃希氏菌（E.coli）最为重要,在环境和食品卫生学上，

36、常被用作粪便污染的检测指标,卫生学指标,在分子生物学和基因工程实验中,重要的实验材料和研究对象,大肠杆菌也是重要的实验材料和研究对象,正常菌群，一般不致病,1、条件致病,某些带有致病基因的血清型，引起肠道感染,两大原因可以致病,细菌居住部位改变引起的肠外感染,尿路感染最常见,2、致病菌株,大肠杆菌O157,侵袭性大肠杆菌（EIEC,致泻性大肠杆菌,肠毒素性大肠杆菌（ETEC,致病性大肠杆菌（EPEC,出血性大肠杆菌（EHEC,致病性大肠杆菌引起的腹泻,日本再度发生O157病菌感染事件 - 新华网东京月日专电日本最近再度发生病原性大肠杆菌集体感染事件，到日为止，东京、千叶、埼玉、神奈川、茨木、群

37、马等地已有人受到感染。 这次集体感染于月日首先在千叶县柏市被发现。诊断和调查结果表明，患者是由于食用了一些工厂生产的不洁净的食品而被感染的。 日本曾于、年前首次发生病原性大肠杆菌集体感染事件。患者有发烧、恶心、呕吐等症状,2001年4月9日17:29新华网报道,其中许多为人畜共患病,一大群人与动物肠道中的寄生菌,菌群菌型甚多，仅少数对人致病,2.2.5 沙门氏菌,广泛存在于动物 肠道、内脏中,引起中毒的主要是 动物源性食品,常见沙门菌的主要生化特性,1、致病物质,致病性与免疫性,侵袭力,O抗原,VI抗原,毒 素,内毒素,2、所致疾病,伤寒副伤寒,食物中毒,败血症,外毒素-肠毒素,胆囊-肠道-粪

38、排菌 皮肤-血拴出血-玫瑰疹 肾-尿 肝脾-肿大 骨髓-受抑制,伤寒和付伤寒的致病过程,伤寒和付伤寒杆菌,小肠上部粘膜,肠系膜淋巴结,固有层淋巴结,进入血液,再次进入血液,第一次菌血症,第二次菌血症,病愈后免疫力较牢固，主要是细胞免疫,3、免疫性,沙门氏菌的预防措施： SSOP、GMP控制个人卫生习惯，严格洗手、消毒以及防止粪便污染水源， 加强加工用水的消毒。 食用前充分加热以及防止交叉污染,沙门氏菌在SS平板上,多数不分解乳糖,2.2.6 志贺氏菌 shigella,是人类细菌性痢疾最为常见的病原菌,通称痢疾杆菌dyseatery bacteria,无荚膜、无鞭毛，有菌毛,生化反应,低于其他

39、肠道杆菌，对酸敏感,形态,对理化因素的低抗力,抗原与分类,根据O抗原分类,分为4群39个血清型（包括亚型,致病性,人类是唯一的患者和带菌者,粪口传播,感染灶局限于结肠粘膜层，一般不入血,病后免疫期短，也不巩固,致病物质,1、侵袭力,菌毛有利于菌粘附至肠粘膜,2、毒 素,加重局部和全身症状,内毒素,作用于肠壁,通透性增加,粘膜炎症、溃疡,局部,全身,内毒素血症,外毒素（A群1型,与内毒素协同作用,临床表现,急性细菌性痢疾,急性典型：发热、腹痛、脓血粘液便,非急性典型：小儿中毒型 成人易误漏诊,慢性细菌性痢疾：病程迁移二月以上,中毒性痢疾病人,2.2.7 金黄色葡萄球菌,急性化脓性感染,食物中毒,

40、正常人带菌，30-80,通过工人手和呼吸道污染食品,金黄色葡萄球菌在生牛奶、熟肉制品及冰激凌等3类食品中的检出率为19.67%；前两种食品的污染率分别为25.13%和20.33,浙江CDC 2000-2004年监控结果,金葡感染,染色观察,在BP平板上的典型菌落,大阪市政府日宣布的调查结果显示，因食用日本雪印乳业公司大阪工厂生产的乳制品而中毒者已逾万人。 在大阪府和京都府以及附近县，因食用雪印乳业公司大阪工厂生产的乳制品而中毒发病者已达人，其中有人被送往医院，目前还有人在医院接受治疗。 据化验，该工厂生产的一些乳制品中含有黄色葡萄球菌，这种细菌可产生使人出现腹泻、呕吐症状的型肠毒素。该厂乳制品

41、染菌是生产设备没有按规定定期清洗而造成的。 目前，日本各地超市和食品店都已停止销售雪印牌乳制品，一些地方政府已下令禁止食用雪印牌食品。大阪雪印厂已被当地政府勒令无期限停产，并且大规模回收月下旬出厂的几种染菌食品。 总部设在北海道首府札幌市的雪印乳业公司是日本著名乳制食品厂家。该公司在全国共拥有家工厂，其中家工厂加工生产牛奶、牛奶饮料、酸奶等奶品,媒体关于日本雪印牛奶金黄色葡萄球菌中毒事件的报道,日本因食用染菌乳制品中毒者已逾万人 (2000年7月6日12:39,2.2.8 单增李斯特氏菌,人、畜共患，4生长，冷藏食品,预防措施： 充分烹调产品，对于经过热处理的食品应防止交叉污染,耐盐，在10%

42、的盐中也可生长,革兰氏阳性短小杆菌,2.2.8 肉毒梭菌,厌氧性梭状芽胞杆菌属,肉毒毒素,神经毒素,腊肠、火腿、鱼及鱼制品和罐头食品,充分加热，控制产品中的pH值， 改变水活度值（0.93以下），但不能达到完全控制 控制温度（冷藏）以及时间（巴氏消毒后冷藏3.3以下） 食品中添加盐或亚硝酸盐,主要包括霍乱弧菌、副溶性弧菌和创伤弧菌。 大多数弧菌源于海洋，是嗜盐菌，嗜温性。 预防措施： 彻底烹调或预煮，并防止交叉污染 控制原料收购 产品的冷藏适宜,2.2.9 致病性弧菌,弧菌属（Vibrio,弧菌是一大群菌体短小，弯曲成弧形的革兰阴性菌,形态与染色,涂片中,呈穿梭样,运动非常活泼,液体中,排列整

43、齐,呈鱼群状,革兰染色阴性,弧型或逗点状,单鞭毛,霍乱弧菌（V.cholerae,培养特性,耐碱不耐酸,碱性琼脂平板上生长良好,在pH8.89.0的,碱性蛋白胨水,根据O抗原不同,抗原构造与分型,现已有155个血清群,其中O1群、O139群引起霍乱,根据表型差异,O1群霍乱弧菌的每一个血清型,还可分为2 生物型,古典生物型,El Tor生物型,霍乱弧菌考核问题,抵抗力,El Tor生物型和其它非01群霍乱弧菌,不耐酸，在正常胃酸中仅能存活4分钟,在外环境中的生存力较古典型为强,水中存活长，河水、井水、海水中1-3周,怕热，1001-2分钟死亡,1霍乱肠毒素,致病物质,激活GS，使细胞内cAMP

44、 水平升高，主动分泌Na+、K+、HCO3和水，导致重 的腹泻与呕吐,B亚单位,A亚单位,与小肠粘膜上皮细胞GM1神经节苷脂受体结合，介导A亚单位进入细胞,结合亚单位,毒性亚单位,霍乱肠毒素的作用机理,1,2,3,4,霍乱肠毒素的作用机理,鞭毛运动,鞭毛、菌毛,普通菌毛,有助于细菌穿过肠粘膜表面粘液层 而接近肠壁上皮细胞,是细菌定居于小肠所必须的因子,剧烈腹泻和呕吐（米泔水样腹泻物）， 大量水分和电解质丧失 ，低容量性休 克及心力不齐和肾衰竭（死亡率高达60,烈性肠道传染病，为我国的甲类法定传染病,传播途径,主要是通过污染的水源或食物经口摄入,所致疾病,传染源,临床表现,霍 乱,病人、无症状感

45、染者,上吐下泻,霍乱病人,免疫性,感染霍乱弧菌后,机体可获得牢固免疫力,生物学特性,嗜盐（halophilic） 在培养基中以含3.5%NaCl生长最为适宜,在“我妻琼脂平板”上产生溶血现象,神奈川现象（Kanagawa phenomenon,副溶血弧菌（V. parahaemolyticus,防治,致病性,食物中毒，该菌经烹饪不当的海产品或盐腌制品所传，播潜伏期572小时，可产生自限性腹泻至中度霍乱样病症,治疗可用抗菌药物,食品卫生管理,03年共采集41份鱼虾标本，检出副溶血性弧菌24份，检出率为58.58%。 其中鱼类中副溶血性弧菌的检出率为42.86%（9/21）；虾类副溶血性弧菌检出率

46、为75%（15/20）。在三份市场活虾的副溶血性弧菌的污染量达24000 MPN/100g、15000和11000MPN/100g。 监测结果表明主要肠道病原菌的菌相为副溶血性弧菌，占总病原菌的85.65%。显示目前我省城市居民肠道病原菌以弧菌为主,浙江CDC系统2003年 海水产品副溶血性弧菌定量检测,2.2.10 霉菌和酵母,评价食品卫生质量的指示菌,造成腐败变质,pH低、湿度低、含盐和含糖高的食品,霉菌菌落周围出现抑制萄葡球菌生长的抑制现象,产黄青霉菌落,细菌生长 抑制区域,正常细菌 生长区域,2.3 微生物检测的一般流程,致病菌检测： 增菌（直接增菌或选择性增菌）-筛选-纯化-生化反应

47、和血清学反应,大 肠 杆 菌 检 验 流 程,均质，接种9支LST发酵管,接种EC发酵管,EMB平板划线,可疑菌落斜面纯化,生化反应：I M V iC,报告结果,培养48小时,培养48小时,培养24小时,培养24小时,96小时,1天 + 2天 + 1天 + 1天 + 4天 = 10天,三、 微生物检测的基本技术,3.1、微生物实验的准备 3.2、微生物实验的基本操作 3.3、微生物实验的观察 3.4、空气监测和表面样品 3.5、菌种的保藏,3.1、微生物实验的准备,3.1.1 玻璃器皿的洗刷与准备,3.1.2 消毒与灭菌,3.1.1玻璃器皿的洗刷与准备,一)洁净剂及使用范围 (二)洗涤液的制备

48、及使用注意事项 (三)洗涤玻璃仪器的步骤与要求 (四)玻璃仪器的干燥 (五)玻璃器皿的包装和灭菌,一）洁净剂及使用范围 最常用的洁净剂是肥皂，肥皂液（特制商品），洗衣粉，去污粉，洗液，有机溶剂等。 肥皂，肥皂液，洗衣粉，去污粉，用于可以用刷子直接刷洗的仪器，如烧杯，三角瓶，试剂瓶等； 洗液多用于不便用于刷子洗刷的仪器，如滴定管，移液管，容量瓶，蒸馏器等特殊形状的仪器，也用于洗涤长久不用的杯皿器具 和刷子刷不下的结垢。用洗液洗涤仪器，是利用洗液本身与污物起化学反应的作用，将污物去除。因此需要浸泡一定的机会充分作用； 有机溶剂是针对污物属 于某种类型的油腻性，而借助有机溶剂能溶解油脂的作用洗除之，

49、或借助某些有机溶剂能与水混合而又发挥快的特殊性，冲洗一下带水的仪器将水洗去。如，甲苯，二甲苯，汽油等可以洗油垢，酒精，乙醚，丙酮可以冲洗刚洗净而带水的仪器,二）洗涤液的制备及使用注意事项 洗涤液简称洗液，根据不同的要求有各种不同的洗液 。将较常用的几种介绍如下。 1.强酸氧化剂洗液 强酸氧化剂洗液是用重铬酸甲（K2Cr2O7）和浓硫酸（H2SO4)配成。K2Cr2O7在酸性溶液中，有很强的氧化能力， 对玻璃仪器又及少有侵蚀作用。所以这种洗液在实验室内使用最广泛。 配制浓度各有不同，从512%的各种浓度都有。配制方法大致相同：取一定量的K2Cr2O7（工业品即可），先用约12倍的水加热溶解，稍冷

50、后，将工业品浓H2SO4所需体积数徐徐加入K2Cr2O7不溶液中（千万不能将水或溶液加入H2SO4中），边倒边用玻璃棒搅拌，并注意不要溅出，混合均匀，俟冷却后，装入洗液瓶备用。新配制的洗液为红褐色，氧化能力很强。当洗液用久后变为黑绿色，即说明洗液无氧化洗涤力。 例如,配制12%的洗液500mL。取60克工业品K2Cr2O7置于100mL水中（加水量不是固定不变的，以能溶解为度），加热溶解，冷却，徐徐加入浓H2SO4mL，边加边搅拌，冷后装瓶备用。 这种洗液在使用时要切实注意不能溅到身上，以防“烧”破衣服和损伤皮肤。洗液倒入要洗的仪器中，应使仪器周壁全浸洗后稍停一会再倒回洗液瓶。第一次用少量水冲

51、洗刚浸洗过的仪器后，废水不要倒在水池里和下水道里，长久会腐蚀水池和下水道，应倒在废液缸中，缸满后倒在垃圾里，如果无废液缸，倒入水池时，要边倒边用大量的水冲洗,碱性洗液 碱性洗液用于洗涤有油污物的仪器，用此洗液是采用长时间（小时以上）浸泡法，或者浸煮法。从碱洗液中捞取仪器时，要戴乳胶手套，以免烧伤皮肤。 常用的碱洗液有：碳酸钠液（Na2CO3,即纯碱），碳酸氢钠（Na2HCO3,小苏打），磷酸钠（Na3PO4,磷酸三钠）液，磷酸氢二钠（Na2HPO4)液等。 . 碱性高锰酸钾洗液 用碱性高锰酸钾作洗液，作用缓慢，适合用于洗涤有油污的器皿。配法：取高锰酸钾（KMnO4)4克加少量水溶解后，再加入氢

52、氧化钠（NaOH)mL。 .纯酸纯碱洗液 根据器皿污垢的性质，直接用浓硫酸（HCL）或浓硫酸（H2SO4)、浓硝酸(HNO3)浸泡或浸煮器皿（温度不宜太高，否者浓酸挥发刺激人）。纯碱洗液多采用以上的浓烧碱（NaOH)、氢氧化钾（KOH) 或碳酸钠（Na2CO3)液浸泡或浸煮器皿（可以煮沸,有机溶剂 带有脂肪性污物的器皿，可以用汽油、甲苯、二甲苯、丙酮、酒精、三氯甲烷、乙醚等有机溶剂擦洗或浸泡。但用有机溶剂作为洗液浪费较大，能用刷子洗刷的大件仪器尽量采用碱性洗液。只有无法使用刷子的小件或特殊形状的仪器才使用有机溶剂洗涤，如活塞内孔、移液管尖头、滴定管尖头、滴定管活塞孔、滴管、小瓶等。 . 洗消液

53、 检验致癌性化学物质的器皿，为了防止对人体的侵害，在洗刷之前应使用对这些致癌性物质有破坏分解作用的洗消液进行浸泡，然后再进行洗涤。 在食品检验中经常使用的洗消液有：或次氯酸钠（NaOCL) 溶液、HNO3和%KMnO4溶液。 或NaOCL溶液对黄曲霉素在破坏作用。用NaOCL溶液对污染的玻璃仪器浸泡半天或用NaOCL溶液浸泡片刻后，即可达到破坏黄曲霉毒素的作用。配法：取漂白粉克，加水mL，搅拌均匀，另将工业用Na2CO3 克溶于温水mL中，再将两液混合，搅拌，澄清后过滤，此滤液含NaOCL 为.；若用漂粉精配制，则NaCO3 的重量应加倍，所得溶液浓度约为。如需要NaOCL溶液，可将上述溶液按

54、比例进行稀释。 HNO3溶液和KMnO4溶液对苯并（a)芘有破坏作用，被苯并（a）芘污染的玻璃仪器可用HNO3浸泡小时，取出后用自来水冲去残存酸液，再进行洗涤。被苯并（a）芘污染的乳胶手套及微量注射器等可用KMnO4溶液浸泡小时后，再进行洗涤,三）洗涤玻璃仪器的步骤与要求 .常法洗涤仪器 洗刷仪器时，应首先将手用肥皂洗净，免得手上的油污附在仪器上，增加洗刷的困难。如仪器长久存放附有尘灰，先用清水冲去，再按要求选用洁净剂洗刷或洗涤。如用去污粉，将刷子蘸上少量去污粉，将仪器内外全刷一遍，再边用水冲边刷洗至肉眼看不见有去污粉时，用自来水洗36次，再用蒸馏水冲三次以上。一个细干净的玻璃仪器，应该以挂不

55、住水珠为度。如仍能挂住水珠，仍然需要重新洗涤。用蒸馏水冲洗时，要用顺壁冲洗方法并充分震荡，经蒸馏水冲洗后的仪器，用指示剂检查应为中性。 2. 作痕量金属分析的玻璃仪器，使用1：11：9HNO3溶液浸泡，然后进行常法洗涤。 3. 进行荧光分析时，玻璃仪器应避免使用洗衣粉洗涤（因洗衣粉中含有荧光增白剂，会给分析结果带来误差）。 4.分析致癌物质时，应选用适当洗消夜浸泡，然后再按常法洗涤,四）玻璃仪器的干燥 作实验应经常要用到的仪器应在每次实验完毕后洗净干燥备用。用于不同实验对干燥有不同的要求，应根据不同要求进行干燥仪器。 （1）晾干 不急等用的仪器，可在蒸馏水冲洗后在无尘处倒置处控去水分，然后自然

56、干燥。可用安有木钉的架子或带有透气孔的玻璃柜放置仪器。 （2）烘干 洗净的仪器控去水分，放在烘箱内烘干，烘箱温度为105110烘1小时左右。也可放在红外灯干燥箱中烘干。此法适用于一般仪器。称量瓶等在烘干后要放在干燥器中冷却 和保存。带实心玻璃塞的及厚壁仪器烘干时要主义慢慢升温并且温度不可过高，以免破裂。量器不可放于烘箱中烘。 硬质试管可用酒精灯加热烘干，要从底部烤起，把管口向下，以免水珠倒流把试管炸裂，烘到无水珠后把试管口向上赶净水气。 （3）热（冷）风吹干 对于急于干燥的仪器或不适于放入烘箱的较大的仪器可用吹干的办法。通常用少量乙醇、丙酮（或最后再用乙醚）倒入已控去水分的仪器中摇洗，然后用电

57、吹风机吹，开始用冷风吹12分钟，当大部分溶剂挥发后吹入热风至完全干燥，再用冷风吹去残余蒸汽，不使其又冷凝在容器内,五）玻璃器皿的包装和灭菌,培养皿的包装 吸管的包装(演示） 烧杯的包装,灭菌： 干热灭菌 湿热灭菌,3.1.2消毒与灭菌,3.1.2.1 基本概念 3.1.2.2 干热灭菌 3.1.2.3 湿热灭菌 3.1.2.4 其它消毒和灭菌方法,消毒： 是指应用消毒剂等方法杀灭物体表面和内部的病原菌营养体的方法。 灭菌： 是指用物理和化学方法杀死物体表面和内部的所有微生物，使之呈无菌状态,3.1.2.1 基本概念,包括： 物理方法 化学方法,3.1.2.2干热灭菌,灼烧灭菌法： 利用火焰直接

58、把微生物烧死。此法彻底可靠，灭菌迅速，但易焚毁物品，所以使用范围有限，只适合于接种针、环、试管口及不能用的污染物品或实验动物的尸体等的灭菌。 干热空气灭菌法： 这是实验室中常用的一种方法，即把待灭菌的物品均匀地放入烘箱中，升温至160C，恒温1小时即可。此法适用于玻璃皿、金属用具等的灭菌,发现的问题,巴氏消毒法： 有些食物会因高温破坏营养成分或影响质量，如牛奶、酱油、啤酒等，所以只能用较低的温度来杀死其中的病原微生物，这样既保持食物的营养和风味，又进行了消毒，保证了食品卫生。该法一般在62C，30分钟既可达到消毒目的。此法为法国微生物学家巴斯德首创，故名为巴氏消毒法。 煮沸消毒法： 直接将要消

59、毒的物品放入清水中，煮沸15分钟，即可杀死细菌的全部营养和部分芽孢。若在清水中加入1%碳酸钠或2%的石炭酸，则效果更好。此法适用于注射器、毛巾及解剖用具的消毒。 间歇灭菌法： 上述两种方法在常压下，只能起到消毒作用，而很难做到完全无菌。若采用间歇灭菌的方法，就能杀灭物品中所有的微生物。具体做法是：将待灭菌的物品加热至100C，1530分钟，杀死其中的营养体。然后冷却，放入37C恒温箱中过夜，让残留的芽孢萌发成营养体。第2天再重复上述步骤，三次左右，就可达到灭菌的目的。此法不需加压灭菌锅，适于推广，但操作麻烦，所需时间长,3.1.2.3湿热灭菌,在同样的温度下，湿热灭菌的效果比干热灭菌好，这是因

60、为一方面细胞内蛋白质含水量高，容易变性。另一方面高温水蒸汽对蛋白质有高度的穿透力，从而加速蛋白质变性而迅速死亡,超高温杀菌： 135-150C和2-8s对牛乳和其它液态食品。保持食品价值和营养成分,加压蒸汽灭菌法： 这是发酵工业、医疗保健、食品检测和微生物学实验室中最常用的一种灭菌方法。它适用于各种耐热、体积大的培养基的灭菌，也适用于玻璃器皿、工作服等物品的灭菌。 加压蒸汽灭菌是把待灭菌的物品放在一个可密闭的加压蒸汽灭菌锅中进行的，以大量蒸汽使其中压力升高。由于蒸汽压的上升，水的沸点也随之提高。在蒸汽压达到1.055公斤/厘米2时，加压蒸汽灭菌锅内的温度可达到121C。在这种情况下，微生物（包