【毕业学位论文】（Word原稿）利用DREB转录因子改良小麦耐盐性的研究作物遗传育种硕士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 学位论文 利用 录因子改良小麦耐盐性的研究 .) I .) 摘 要 盐害是小麦生产的重要胁迫因素，我国一些地区土壤盐碱化严重，所以 通过基因工程方法提高小麦的耐盐性具有重要的理论意义和应用价值。 本研究利用分子生物学的实验手段，构建了包括来源于植物拟南芥的 种逆境诱导转录因子 ,诱导相关抗逆基因的表达）基因和 用于筛选转化植株的 因（编码除草剂抗性）的表达载体。 以综合农艺性状较好的小麦品种 932 块幼穗愈伤组织为受体，用高压氦气基因枪（ e）将 因 导入小麦，经愈伤及分化筛选成功获得了 205 株再生植株 。经除草剂 性筛选，其 中有 89 株植株表现除草剂抗性。 89 株抗性植株再经 增和交鉴定，其中 50 株植株的基因组中整合有外源基因 化频率达到 取 31 株转基因小麦的后代种子继续种植，获得的 植株 经分子鉴定，结果显示 20 个后代株系的基因组中整 合 有 因，证明 因可以在转基因后代植株中相对稳定遗传。转基因植株后代种子继续种植，获得的 植株经 增和 交鉴定 ， 4 个株系中没有检测到 因 ， 而 4 个株系中 因没有发生遗传分离，其它各株系表现不同的分离比例， 进一步证明了 因在后代中可以相对稳定遗传，并且以显性形式遗传给后代。转 因的小麦植株经初步耐盐试验表明，其耐盐性明显高于对照植株。 在盐 迫条件下，转 因小麦植株叶片的细胞表面糖蛋白层较为致密，而对照植株叶片的细胞表面糖蛋白层出现细胞壁外缘脱落现象。 将 因 利用农杆菌介导法导入小麦 。以小麦幼苗的茎尖分生组织为转化受体，与农杆菌共培养后共获得 247 棵转化幼苗，经除草剂初步筛 选，有 66 棵转化幼苗存活 。经 增鉴定 ，其中 30 棵幼苗证明整合有 因 ， 转化率达到 本研究利用优化的基因枪和农杆菌介导两种基因转化体系，较好地克服了小麦转化受体的基因型障碍，提高了小麦的基因转化效率，获得了耐盐性增强的转 因小麦。 关键词： 小麦； 因；基因枪转化；农杆菌介导；耐盐性 he is an of of of so it is to s by is a of a of to is to in 32 by of 6756 by 05 on to by 00mg/l on 9 CR 50 to be of of 1 it 0 be to 2 t in T1 it in T1 in in of 1 be of In at of in of or in 6756 of 47 6 by 00mg/l 30 of of to in in an 目 录 摘 要 . I . 一章 绪论 . 究目的和意义 . 内外研究进展 . 物抗逆基因工程研究进展 . 麦转化技术研究进展 . 究内容和方法 . 第二章 小麦基因枪法转化 因的研究 . 料与方法 . 料 . 法 . 果与分析 . 物载体的构建 . 草剂抗性筛选 . 基因植株的分子检测 . 基因植株种子发芽的耐盐性鉴定 . 胞表面糖蛋白层的观察 . 结 . 第三章 小麦农杆菌介导法转化 因的研究 . 料与方法 . 料 . 法 . 果与分析 . 质粒表达载体的构建 . 粒的酶切鉴定 . 粒载体的酶切鉴定 . 小麦的转化、筛选与检测 . 结 . 第四章 讨论与结论 . 论 . 麦基因枪转化体系与转化效率 . 麦农杆菌转化体系与转化效率 . 因与小麦的耐盐性改良 . 一步研究的工作 . V 论 . 参考文献 . 致谢 . 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 第一章 绪论 究目的和意义 小麦是全世界分布范围最广、栽培面积最大、总产量最高、总贸易额最多的粮食作物，在世界经济中占有举足轻重的作用。我国小麦 最大播种面积在 4 亿亩左右，约占全国粮食播种面积的26%，为仅次于水稻的第二大主要粮食作物。在小麦播种面积中，约有 2/3 为中低产田，这正是10 多年来全国小麦单产水平虽有 770 多公斤的高产纪录，但平均亩产却只有 260 公斤左右的主要原因之一。生产实践证明盐渍干旱是严重影响小麦生产的逆境因子，并已成为大幅度提高我国小麦单产及总产水平的主要瓶颈。我国有 15 亿亩可耕地，盐渍化耕地 1 亿亩左右，另外还有约 5亿亩的盐碱荒地。近年来由于黄河年年断流，水资源日益贫乏，盐碱旱地有增无减。我国人多地少，粮食生产有待进一步提高，而盐碱 干旱地区的农业生产水平低，发展潜力大，因此，努力提高该地区的农业生产水平迫在眉睫。实践证明，培育抗旱耐盐的农作物新品种是提高盐碱旱地农业生产水平最经济、最直接、最有效的途径之一。所以，培育抗旱耐盐的小麦新品种将具有广泛的社会、经济和生态效益。 杂交育种仍是目前作物新品种培育的主要方法，但是传统的育种方法已不能满足当前以及未来育种工作的需要。近 20 年来，随着植物组织培养技术， 外重组技术，基因克隆技术及遗传转化技术的发展，植物基因工程育种已成为作物育种的新途径。 分子生物 学 的发展，使人们能够在基因组成、表 达调控及信号传导等分子水平认识植物对逆境胁迫的耐（抗）性机理。现已克隆到来自 微 生物 植物 等有机体的编码生化代谢关键酶和逆境胁迫信号传导的一些重要基因，采用重组转基因技术向栽培植物导入这些外源目的基因，已发展成为改良植物耐（抗）胁迫性的新途径。 与植物的抗虫、抗病等其它性状比较，植物的耐盐性、抗旱性等抗逆性状要复杂得多。植物对干旱、高盐及低温耐性的强弱往往不取决于某一单个因子，其性状受到许多因子的影响。利用单一基因，如脯氨酸合成酶基因或甜菜碱合成酶基因进行转化，虽能在一定程度上改善植物的耐盐性或耐旱性，但 不能使植物的抗逆性得到较为理想的综合改良。因此，从改良或增强一个关键的转录因子调控着手，是使植物抗逆性得到综合改良的有效的途径和方法。 是这样一种转录因子，它 可以调控多个与植物干旱、高盐及低温耐性有关的功能基因的表达。因此 ,利用转录因子 良小麦耐盐性等抗逆性状 ,预期能获得较好的改良效果。 内外研究进展 物抗逆基因工程研究进展 干旱、盐碱、高温、冷（冻）害和涝害等逆境条件是严重影 响栽培植物生长发育的非生物胁迫因素。随着人口增长环境资源恶化，愈来愈多的研究集中在如何改良植物对逆境胁迫的耐（抗）性。由于植物的胁迫耐性大多属于数量性状，现有可利用的种质资源匮乏，采用常规育种技术改中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 良植物的胁迫耐性，耗时费力，困难大，至今尚未培育出真正的耐胁迫品种。 目前， 人们在基因组成、表达调控及信号传导等分子水平 上 认识植物对逆境胁迫的耐（抗）性机理 ， 克隆 了 来自 微生物等有机体的编码生化代谢关键酶和逆境胁迫信号传导的一些重要基因， 并利用 重组 转基因技术向栽培植物导入 了 这些外源目的基因 （见表 。与传 统育种方法相比，转移外源目的基因 对 改良植物胁迫耐性更为直接迅速和有效。目前，应用于植物胁迫耐性改良的外源目的基因 依据其产物的作用可分为两大类 (刘强等， 2000)。 表 用于改良植物胁迫耐性的外源基因 he to of s to 因（来源） 表达产物 转化植物 功 能 .) 甜菜碱醛脱氢酶 草莓 水稻 甜菜碱累积，抗盐碱 . 胆碱脱氢酶 烟草 马铃薯 抗盐碱、冷（冻）胁迫 胆碱单加氧酶 烟草 甜菜碱累积，抗盐碱 抗冻蛋白 烟草 提高抗冷（冻）性 . 胆碱氧化酶 拟南芥 增强对低温和盐的耐性 . 9烟草 增强耐赛性 . 铁 烟草 保护光系统和膜 肪酸去饱和酶 烟草 提高耐寒性 . 胚胎发生后期富集蛋白 水稻 维持受胁迫植物高的生长率 . 锰 烟草 苜蓿 在细胞中减少活性氧的破坏 . 1烟草 拟南芥 水稻 积累甘露醇，提高耐盐性 . 1 6水稻 积累甘露醇和 山梨醇 ，提高耐盐性 b. 果聚糖转移酶 烟草 果聚糖累积，干旱时保持高的生长率 s. 海藻糖合成酶 烟草 在低浓度时提高干旱需性 . 吡咯啉 5烟草 脯氨酸累积，增强对低温和盐的耐性 . 谷胱甘肽 谷胱甘肽过氧化物酶 烟草 增加被氧化的谷胱甘肽 , 加快幼苗生长 u,谷胱甘肽还原酶 /铜锌超氧物岐化酶 烟草 抗氧化性 . 血红蛋白 烟草 抗低氧和缺氧 H+ 反向运输蛋白基因 小麦 转运 蛋白 ，合蛋白 烟草 激活了一些具有抗盐效应的下游基因 转录因子 拟南芥 诱导抗旱、盐、冻基因表达 转录因子 拟南芥 小麦 诱导抗旱、盐、冻基因表达 转录因子 拟南芥 诱导抗旱、盐、冻基因表达 类可利用基因 第类可利用基因包括编码直接保护细胞免受水分胁迫伤害的功能蛋白（如 白、渗调蛋白和伴侣蛋白等）基因；编码渗 透调节因子（如脯氨酸、甜菜碱和海藻糖）的合成酶基因；以及毒性降解酶（如谷胱甘肽转移酶、超氧化物歧化酶和过氧化物氢酶等）基因等，这些编码产物可以使细胞在逆境中各种生理生化代谢活动维持正常进行 (俞嘉宁等 ,2002)。 透调节物质合成酶基因 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 干旱、低温和盐渍等环境胁迫都直接或间接地造成植物细胞水分亏缺 (1993), 即诱发渗透胁迫 (为保证细胞内水分平衡，多数生物体都会在细胞内合成和积累被称为渗透保护剂或渗调剂的小分子化合物。 一般认为这些渗透保护剂 (渗调物(合成、积累既可提高细胞的渗透势，又能稳定细胞膜或大分子化合物的结构，以抵御逆境胁迫 (沈义国等， 2001)。这些物质包括甘油、山犁醇、甘露醇等多元醇；蔗糖、海藻糖和果聚糖等低分子糖类；脯氨酸、甘氨酸、甜菜碱等氨基酸及其衍生物。 甜菜碱是一种重要的渗透调节物质，在水分亏缺或 迫下它积累在细胞原生质里形成渗透势，从而与液泡中的组分保持渗透平衡，维持植物在干旱或盐渍条件下的正常生理活动。 水稻、马铃薯、烟草等植物合成积累甘氨酸 甜菜碱这种渗透保护剂极少。将来源于大肠杆菌的胆碱脱氢酶基因即 入烟草 (. et 1996)和马铃薯，转基因植株中甘氨酸甜菜碱含量提高到 5g 干重，其耐盐碱和抗冻性明显改善。来自土壤细菌的的胆碱氧化酶是催化生成甘氨酸甜菜碱的另一关键酶。将编码该氧化酶的基因 入拟南芥，获得了耐盐碱和抗冻害的转基因植株 (. A. et 1997)。肖岗等（ 1995）从耐盐性很强的山菠菜中分离到甜菜碱醛脱氧酶（ 因，刘凤华等 (1997)、郭岩等 (1997)和郭北海等 (2000)分别将该基因导入草莓、烟草、水稻和小麦中，获得耐盐转基因植株。 胆碱单加氧酶 ( 甜菜碱经 胆碱氧化 获得的 第一步反应酶 。 李秋莉 等（ 2003） 从盐生植物辽宁碱蓬 ( 克隆 了 因并 转化 到 烟草 中， 转基因烟草的甜菜碱含量明显高于对照 ，提高了 转基因烟草的耐盐性 。 脯氨酸是另外一种有效的渗透调节和膜保护物质，对细胞内许多酶有保护效应，可保持膜结构的完整性。来源 于乌头叶菜豆的 因 是细胞中脯氨酸合成的主要酶。 (1995)把该基因导入烟草中，在干旱胁迫下，转基因植株脯氨酸含量比对照植株提高 1018 倍，胁迫耐性明显提高。 甘露醇是一种多元醇，编码甘露醇 1因导入到拟南芥后，甘露醇大量合成，可使转基因拟南芥植株的种子在高盐浓度下发芽，且发芽率提高 (C.,1995)。在 露醇合成同样增加，且在盐胁迫下该转基因植株的生物产量得到了提高(.,1993)。将枯草芽孢杆菌编码果聚糖转移酶的 因导入烟草，转基因烟草中累积果聚糖含量达 g 鲜重，且在干旱胁迫下植株鲜重和干重均比对照高 (995)。编码海藻糖 母基因被导入到烟草后，海藻糖过量表达，并伴随着转基因植株持水力和脱水耐性的提高 (O,1995)。王慧中等 (2000)将 6价基因整合进水稻基因组中，转基因植株表现出对 抗性。张新春等（ 2003年）也将 入水稻， 因在水稻中获得表达，提高了 水稻的耐盐性。 迫诱导蛋白的基因 植物适应逆境胁迫的另一策略是即时大量合成许多胁迫诱导蛋白 (例如，高温热击处理可诱导植物细胞合成热激蛋白 (冷响应蛋白 (低温诱导蛋白 (冷激蛋白 (水分胁迫诱导的胚胎发生后期富集蛋白 (EA (许智宏 1998)。 白是胚胎发生后期种子中大量积累的一系列蛋白，具有很中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 高的亲水性和热稳定性，能把足够的水分子捕获到细胞内，从而保护细胞免受水分胁迫（ J. 1996）。它广泛存在于高等植物中，受发育阶段、脱落酸（ 脱水信号的调节，在胁迫条件下都可诱导表达 (俞嘉宁等 ,2002)。来自大麦的 因是编码 白的基因。把该基因导入到水稻后，此转基因植株在胁迫下仍能保持很高的生长速 率，提高了渗透胁迫的耐性（ ,1996）。在某些极地鱼中发现了类型 1 抗冻蛋白 (防止组织细胞中冰晶的形成，并已通过转基因技术使 一些转基因烟草中得到表达 (D,1993)。 善膜塑性的基因 在植物的质膜中脂肪酸的不饱和程度和冷敏感性是紧密相关的。膜脂中心位置顺式双键的存在，可把相变温度降低到接近 0。有些酶可催化饱和脂肪酸中顺式双键的形成，将编码这些酶的基因导入植物体内，植株可获得抗冷性状。如将拟南芥中的叶绿体 肪酸脱氢酶基因 中，所获得的转基因植株抗冷性增强 (,1994)。蓝藻类细菌的 9此酶的基因 入烟草后，转基因烟草在 1下生长 11d，未出现缺绿症 (996)。 性氧清除酶类的基因 盐碱、冷（冻）和干旱胁迫会伴随有活性氧的产生。这些毒性分子破坏生物膜，尤其是破坏线粒体和叶绿体的膜系统，导致氧化胁迫。植物中一些清除氧自由基的酶类可以抗氧化胁迫，例如 氧化物酶、过氧化氢酶和谷胱 甘肽还原酶 (R)。 几乎所有植物抗氧化胁迫防御体系的重要成份。 工酶根据它们的金属辅助因子的不同可以分为 3类：锌、锰和铁。现已将来自一种烟草 入到苜蓿中，通过三年的大田试验观察，转基因植株的产量和存活率都明显提高 (D,1996)。源自拟南芥的 已成功在转基因烟草中得到表达，当被定位到叶绿体中时，它可保护质膜和光系统免受超氧化物累积的破坏 (,1996)。转移 可以增加植物抗氧化胁迫耐性。把这些来自于E. 水稻的基因导入烟草中，得到的转基因植株比野生型对照植株对氧化胁迫所受危害小(,1995)。 码低氧 涝害常常引起氧胁迫，呼吸作用和叶绿素的合成等代谢受到影响。植物已进化出应付低氧胁迫的各种策略，如改变根的构造，通过大的通气组织加快内部氧的运输，酶的诱导，以及产生氧结合蛋白质等。血红蛋白是在豆科植物固氮根瘤中发现的，它是一种氧结合蛋白。在转血红蛋白(因的烟草中发现，血红蛋白有促进氧扩散的作 用 (.,1997)。 它基因 有些植物耐盐性的差异取决于细胞中 排除能力。来自拟南芥的 H+反向运输蛋白基因 (有增强植物耐盐性的功能。楚秀生等 (2003)用 耐盐筛选获得了转基因小麦植株。 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 类可利用基因 第类基因包括编码传递信号和调控基因表达的转录因子（如 因；编码感应和转导胁迫信号的蛋白激酶以及在信号转导中起重要作用的蛋白酶等基因（ et 2002;et 1996）。 由于对植物细胞如何感应干旱、高盐及低温引起的水分胁迫，如何将这些胁迫信号传导到细胞核的转录因子，以及下游的各种功能基因的表达调控等一系列的分子机理知道得甚少，因此，对第二类基因的表达特性及基因产物的调控作用的研究，成为近年来植物分子生物学研究领域的一个前沿内容。 与植物的抗虫、抗病等其它性状比较，植物的抗逆性状要复杂得多。植物对干旱、高盐及低温耐性的强弱往往不取决于某一单个因子，其性状受到许多因子的影响。利用单一基因，如 脯氨酸合成酶基因或甜菜碱合成酶基因进行转化，虽能在一定程度上改善植物的耐盐性或耐旱性，但不能使植物的抗逆性得到较为理想的综合改良。因此，从改良或增强一个关键的转录因子（第类基因的产物）的调控着手，将可能发展成为使植物抗逆性得到综合改良的有效的途径和方法。 目前 录因子的研究极为活跃，并且在获得抗逆的转基因植物方面取得了一定进展。下面就 录因子目前的研究进展作进一步的详细说明。 1992 年 等利用示差筛选方法，从干旱处理的拟南芥中克隆了一批受干旱胁迫 诱导的基因，定名为 rd(to 因。其中对 因的启动子进行分析，发现一个与干旱、高盐及低温胁迫应答有关的 9式作用元件 (序列为 ( et 并且证明 件对 胁迫条件下的表达起作用。除因外，在一些同样受干旱、高盐或低温条件诱导的拟南芥基因如 因的启动子中，也发现存在 件或 心序列的元件 ( et et 另外还发现拟南芥只受低温诱导的 因启动子中也有与 件极为相似的序列 称为 件 ( S et 在甘蓝型油菜中受低温诱导的 件的核心序列 定名为 即低温应答元件。这些结果表明 式作用元件 (或 心序列 )普遍存在于干旱、高盐或低温胁迫应答基因的启动子中（图 并且对这些胁迫条件下的基因诱导表达起调控作用。 旱、高温或低温胁迫应答基因启动子中的 式作用元件或含 心序列的顺式作用元件 he RE or RE in of by 国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 利用 因启动子的顺式作用元件和酵母单杂交方法，在低温和干旱处理的拟南芥库中已经克隆到 5 个与 合的转录因子分别定名为 M et et 利用凝胶移位分析 (对蛋白质与 结合进行鉴定，证实了上述 录因子与 式作用元件结合的特异性。从蛋白质结构分析，这 5 个转录因子都具备反式作用因子的典型特征，既它们的 N 末端都有一段核定位信号， C 末端都有异端酸性活化区域，它们都含有一段保守的 合区域，由58 个氨基酸组成，被称为 构域（刘强等， 2000）。 （ 1997）利用酵母单杂交方法在拟南芥中克隆了 件结合蛋白的 名为 来证明它与 同一 基因。刘强课题组 秦峰 等（ 2003）又 从玉米 (.) 的 库中分离到一个编码与 件结合的蛋白的基因，命名为 现在已经发现 其构域广泛存在于拟南芥、西红柿、烟草、水稻、玉米等植物中，并且可以调控许多抗逆相关基因得到表达 (图 这说明利用 录因子改良多种作物的抗逆性具有广阔的应用前景。 旱、高盐、低温 （ 信号传递 ） （ 转录调控 ） 增 强 植 株 胁 迫 耐 性 胁迫诱导的基因产物的积累 调节各种生理生化反应 转录因子 （ 基因表达 ） 细 胞 感 应 缺 水 件 胁 迫 耐 性 相 关 基 因 胁 迫 耐 性 相 关 基 因 （ 环境胁迫 ） 图 旱、高盐或低温胁迫分子应答中， 录因子 调控含有 件的抗逆相关基因的表达过程 he of RE by 引自刘强等， 2000） 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 为进 一步研究 录因子在胁迫条件下调控抗逆基因表达的作用， 999)等人把 录因子导入拟南芥中，发现 录因子超量表达，并且诱导其它抗逆相关基因的表达，提高了植株对干旱、高盐和低温的耐受能力。但是同时也发现，利用 成型启动子 35S 启动 因，在正常生长条件下，会造成植株生长受抑制，