【毕业学位论文】（Word原稿）G-CSF改善子宫内膜状况的临床及机理研究

兰州大学硕士研究生学位论文 善子宫内膜状况的临床及机理研究 1 中英文缩略对照 英文缩写 英文全称 中文全称 n 外授精及胚胎移植 细胞集落刺激因子 细胞集落刺激因子受体 组人粒细胞集落刺激因子 噬细胞集落刺激因子 细胞 /巨噬细胞集落刺激因子 酸盐缓冲液 -(4,52,5甲 基偶氮唑盐比色法 甲基亚砜 牛血清 式细胞仪 介素 二醇 P 激素 泡刺激素 体生成素 体泌乳素 木精 疫组织化学 氨基联苯胺 宫内膜基底 兰州大学硕士研究生学位论文 善子宫内膜状况的临床及机理研究 2 第一章 前言 胚胎种植是人类辅助生殖过程中的关键环节，它依赖于正常的内分泌激素、多种细胞因子之间相互协调而建立的胚胎发育与子宫内膜容受 状态的同步化过程。炎症和损伤使子宫内膜的 组织结构和功能完整性受到破坏，引起内膜过薄、对雌激素及血管活性药物反应差 ，宫壁组织瘢痕粘连、宫腔变形、狭窄和闭锁，降低了子宫内膜的容受性，因此选择一种有效的改善子宫内膜容受性的措施对于促进胚胎种植，改善 娠率具有重要的意义 。目前， 输卵管因素 是造成不孕症 的主要 病 因， 一般由女性生殖系统的炎症所致。 病原微生物沿阴道上行经宫颈蔓延至子宫内膜，长期慢性的炎症，可引起子宫内膜基底 终不仅引起输卵 管的炎症、粘连，功能障碍，也影响了内膜的功能，造成胚胎着床障碍 。 哺乳动物的成功妊娠中具有重要的作用，参与了人卵泡、胎盘及子宫内膜的生长、发育，是胚胎种植过程中 不可或缺的一种细胞因子，它通过升高外周血中的白细胞，增强了机体的 免疫 力。 对纽约 2 家独立的心的 4 位患者进行了前瞻性同期研究， 4 位行 疗的患者，体外受精 现有治疗方法进行过多种尝试后，内膜厚度仍极不达标，于是使用 阴道对内膜行灌注治疗，测量指标为移植日子宫内膜厚度及妊娠率，结果发现，对之前对于激素及血管舒张药物不敏感的患者使用 腔灌注后，其子宫内膜至少长至 74 位患者胚胎移植后，均获得妊娠，其中 1 位患者因宫角妊娠而终 止妊娠。灌注后大约 48 小时内，子宫内膜增长至最小移植厚度。这提示我们 解决目前棘手的内膜过薄 、行渗出性改变、 胎反复种植失败 问题的一个新方法，但其 改善 子宫内膜的机理 仍需进一步研究。 粒细胞集落刺激因子 （ 是一种糖蛋白，含有 174 个氨基酸，分子量约为 20000。人 位于 17 号染色体的 的单个基因编码，长约2.5 5 个外显子和 4 个内含子 ,其蛋白质由 174 个氨基酸组成 ，含 30 个氨基酸的疏水信号系列 1。 要由 活化单核或巨噬细胞分泌，但在适当的刺激下可由机体多种细胞产生，这其中包括一些肿瘤细胞 ,可刺激骨髓中性粒前体细胞的增殖及分化 ,促进中性粒细胞的成熟及功能 2。对于成熟的中性粒细胞，兰州大学硕士研究生学位论文 善子宫内膜状况的临床及机理研究 3 促进其游走、吞噬、产酶、释放活性氧、杀菌能力和对外来异物的粘着作用，还可动员成熟中性粒细胞从骨髓进入外周。 目前临床 要用于预防和治疗肿瘤放疗或化疗后引起的白细胞减少症、治疗骨髓造血机能障碍及骨髓增生异常综合征、预防白细胞减少可能潜在的感染并发症、以及使感染引起的中性粒细胞减少的恢复加快。 机体抗感染机制中起着重要的作用，早在 1991 年 ， 批准了 剂用于各种非髓性肿瘤的骨髓抑制性化疗中 ， 以避免因粒细胞减少症引起的感染和死亡，此外 ,应用于其他原因引起的免疫缺陷患者 ， 可刺激嗜中性粒细胞的分化增殖 ,起到提高抗感染能力的作用 3, 4。也有研究 5表明 有抗细胞凋亡及抑制炎症反应的作用 。 目前 ， 临床应用主要有以下几方面 3 用于骨髓移植治疗免疫性疾病：自体外周造血干细胞移植，应用 重组人粒细胞集落刺激因子（ 将患者造血干细胞动员至外周血 ， 并经过采集分选等处理后重新输回患者 ,使其造血和免疫重建；用于各种肿瘤 ,如急性白血病的化疗和严重粒细胞减少症；用于非血液系统肿瘤的治疗和治疗感染性疾病； 于心肌保护和神经保护有功效 。 较高同源性，具有相似的生理作用及功能， 近几年有文献 9, 10报道 创面、溃疡的愈合也有很好的疗效，具有促进粘膜细胞增殖的作用。不同浓度 胎儿口腔粘膜成纤维细胞的增殖及 成有刺激作用，在 80ng/成纤维细胞生长达到最佳状态，可能机制为 卵巢颗粒细胞、睾丸 胞、胎盘、子宫内膜细胞中均有表达，可能参与了人卵泡颗粒细胞、胎盘及子宫内膜细胞生长、发育的调节，也是胚胎着床的调节因子之一 11。小鼠研究 12表明一定浓度的 通过旁分泌方式调节子宫内膜基质细胞活化数目，调节子宫内膜蜕膜化，利于胚胎着床，但其具体 机制尚不清楚。 此外，有研究发现 13 支气管哮喘、慢性阻塞性肺病、脓毒血症、结肠炎等疾病均有不同程度的治疗作用，在脑、肾缺血再灌注中能够促进血管的生成。 兰州大学硕士研究生学位论文 善子宫内膜状况的临床及机理研究 4 图 图 2 生物活性图 兰州大学硕士研究生学位论文 善子宫内膜状况的临床及机理研究 5 图 3. 神经细胞 的 作用机制图 图 4 白质的一级结构 兰州大学硕士研究生学位论文 善子宫内膜状况的临床及机理研究 6 对健康男子进行的静脉点滴及皮下注射给药（ 1 g/的研究结果表明：静滴 30 ，其 为 h，并有随剂量的增加而延长的倾向，药时曲线下面积为 ngh/下注射，血药峰浓度出现于给药后 h， 为 时曲线下面积为 ngh/物利用度是 下注射 4 h 以后，血药浓度比同一时间静滴时为高。静滴或皮下注射连续给药 6 h，血药浓度变化均与单次给药时无明显差异。无论哪种给药方法及用量，给药 48 h 后，血药及尿药浓度均在检出界限以下 17。 能会有以下不良反应 18： 1. 偶有皮肤 发红、皮疹，有时会有食欲不振、恶心、呕吐等消化道反应及肝功能损害；还可引起骨痛、腰痛、胸痛等；还可能引起碱性磷酸酶，低密度脂蛋白升高及发热、头痛、倦怠、心悸、尿酸和肌酐升高等。 2. 对孕妇及早产儿、婴儿的安全性尚未确认。 3. 对本品或其它基因重组制品有过敏反应的患者忌用本品。 4. 有药物过敏史、有过敏体质以及有肝、肾、心、肺功能重度障碍的患者，需慎用。临床前研究表明，无论哪种给药途径，单次给予本品对大鼠、狗和猴的 在 3000 g/10 g/（ kgd）连续静注 4 周、 1 g/（ kgd） 连续静注 13 周无不良影响。 生物学作用是通过与效应细胞表面特异性受体 （ 合而产生的。在髓祖细胞，髓性白血病细胞、成熟中性粒细胞、血小板、单细胞及某些 T， B 淋巴细胞均有不同密度的受体存在 19某些非造血细胞 ， 如血管内皮细胞、胎盘细胞、小细胞、肺癌细胞系及滋养层细胞等 ， 也有 在 。 粒系祖细胞 数量随着细胞的成熟而增加，人类成熟粒细胞表面有200 1 000 R/细胞，有一单一的高亲力位点，其解离常数 （ 值约为 200 500 ，交联试验表明 白分子量约为 130 000 150 000 道尔顿，仅需少量 合即可诱发最大 物效应。 隆是 1990 年报告的， 分子克隆对阐明作用机理有极其重要的价值。人类 由 813 氨基酸组成的单一胯膜区的多肽链分子组成的，与小鼠 的 核酸水平有 源性，在氨基酸水平有 同源性，与 体之间的同源性相对小的多。 1 个胞外区、胯膜区及胞浆内区组成，结构分析表明， 州大学硕士研究生学位论文 善子宫内膜状况的临床及机理研究 7 息传导蛋白等，其特点是胞外区有 4个保守的半胱氨酸残基和一个 题序列 23。 胞外区 6 氨基酸组成的免疫球蛋白样结构 （ 结构 ） ，是配体与受体结合的部位；紧接其后是 （ 97，在 的 N 端有一 个富含 列，其 C 端有 题序列， 缺失分析表明 是配体与受体结合所必需的结构，若无此区配体结合后不能形成寡聚结构，因此 结构及 是 受体结合所必不可少的区域。 与胯膜区之间 （ 310由 3 个重复的 型纤维蛋白结构 （ 区 ） 组成。 胞内区由 183 成， 种突变化的研究表明：近膜区的 55 增殖及生存信号转导所必须的，该区域内有两个功能亚区，称为 基， 亚基中有很强的保守性，且都参与细胞增殖及生存信号的转导。之后的 30 56，有显著扩大受体介导的有丝分裂信号的作用，提示该区内可能存在另外的功能亚区。 内 8 转导细胞成熟信号必需的区域。近年来发现，该区域也是 导的细胞凋亡所必不可少的区域，在髓系细胞中能抑制增殖信号的转导。这一区域内有一保守序列称为 样存在于 号传导蛋白 ， 能诱导正常小鼠骨髓粒细胞集落的形成，并能诱导 血病细胞向成熟细胞分化，说明区可能通过与之相关的特异的细胞底物直接参与了调控细胞成熟的过程24。 迄今为止，已发现 5 种不同类型的 异构体 （ ，主要是由于 同的剪接方式造成的，各种变构体的生物学作用及其表达的调控目前尚不十分明确。 5发现 1 例 因上有 1 个 突变，而使 胞 异体的表达明显增加，而变化了的 能转导细胞成熟的信号，只能传导增殖信号。推测白血病的发生与 突变有一定关系。先天性粒细胞缺乏的患者也发现类似 常的情况，因此对各种 不同细胞表达情况的研究对揭示粒细胞性疾病的发病机理有重要的意义。 兰州大学硕士研究生学位论文 善子宫内膜状况的临床及机理研究 8 第二 章 料与方法 例资料 选择内膜对雌激素及血管活性药物反应极差，至少 3 个周期监测示内膜厚度未超过 0.7 子宫内膜基底完全低回声，之前有过 1 次或多次因内膜因素 败的患者共 60 例行 腔灌注治疗，其中 7 人既往孕早中期胚胎停育史；选择同期内膜情况相似患者 30 例作为对照。 2 组患者的年龄、不育时间、体质量指数（ 胚胎质量及灌前内膜评分均无统计学差异（ P见表 1。 表 1 间断停药组与未停药组一般情况 组别 n 年龄（岁） 不育 时间（年） kg/ 胚胎质量 灌前内膜评分 灌注组 60 照组 30 子宫内膜回声评分 在内膜增生中晚期，若形态为 A 型，记 4 分， B 型 3 分， C 型 2 分，若因内膜过薄呈线性，记 1 分；宫腔无积液，记 1 分，存在宫腔积液，记 0 分；纵切位暴露全子宫，基底低回声面积 1/3，记 4 分，介于 1/3 与 2/3 面积，记 3 分， 2/3记 2 分，完全低回声时，记 1 分。各项相加的总分为子宫内膜回声评分。 疗方案 根据患者的具体情况选择在早卵 泡期、晚卵泡期，或围排卵期进行 者憋尿后取截石位于检查床上，用窥阴器暴露宫颈；碘伏消毒外阴及阴道。腹超监测子宫。使用移植管及 2 射器组合而成的灌注器抽吸00 2 白，山东齐鲁制药）。移植管经阴道进入宫颈口，穿过宫颈内口即可将灌注液缓慢推入患者宫腔内，腹超监测。阴道窥撤出阴器后，兰州大学硕士研究生学位论文 善子宫内膜状况的临床及机理研究 9 患者保持截石位 10 下床即可。灌前监测患者子宫内膜的厚度、回声、基底回声、血流动力学等指标，灌注后连续监测内膜厚度及回声的变化，灌注后48 h 再次监测血流动力学指标，根 据内膜的改善情况决定灌注的次数，所有患者灌注次数为 1。根据内膜情况，决定移植与否及移植日，选择 2优质胚胎进行移植，移植后 14 16 d 验血 定生化妊娠，移植后 30 d 阴道超声检查确定临床妊娠。所用仪器为美国 9 彩色多普勒超声诊断仪，经阴道探头频率范围 5量部位：纵切位全面暴露子宫，观察内膜线性，前后壁基底区各选择两点测血流，待出现至少连续 4 个稳定的波形图后再作测量，取其平均值为该患者子宫基底区动脉的血流动力学值。 计学方法 所有数据采用 行统计分析，数据经正态性检验，如为正态分布，用均数 标准差表示，组内前后比较用自身配对 T 检验，组间比较采用重复测量方差分析。如为非正态分布，组内前后比较采用非参数 号秩检验，组间比较采用 参数检验。 基底区动脉 8 h 后较前增加，差异有统计学意义（ 基底区动脉 8 h 后较前增加，差异有统计学意义（ 在灌后 96 h 内膜厚度及基底回声评分有统计学差异（ 见表 6、 7，图 5、 6。 表 6 围排卵期灌注前子宫内膜厚度、基底回声及血流变化的比较 组别 n 灌注前 内膜厚度 回声 I 对照组 10 注组 19 7 围排卵期灌注后 48 h 及 96 h 子宫内膜厚度、基底回声及血流变化的比较 组别 n 灌注后 48h 灌注后 96h 内膜厚度 回声 I 内膜厚度 回声 对照组 10 注组 19 与对照组相比较 *P灌注前相比较 P 5 不同时期子宫内膜厚度及回声评分变化图 兰州大学硕士研究生学位论文 善子宫内膜状况的临床及机理研究 12 图 6 不同时期子宫内膜 动脉 化图 组妊娠率的比较 在已行胚胎移植的患者中，灌注组的妊娠率为 35/56），对照组的妊娠率为 9/27），差异有统计学意义（ P 注前后血清细胞因子检测 灌注组与对照组相比，血清 D 值增高， 低，差异具有统计学意义， D 值无明显变化，差异无统计学意义。则可反应血清浓度，即：灌注组血清 度 增高 ， 低 。 见表 8。 表 8 灌注前后两组血清细胞因子 变化幅度表 对照组 注组 与对照组相比较 *P州大学硕士研究生学位论文 善子宫内膜状况的临床及机理研究 13 论 胚胎着床既需要胚胎具有良好的发育潜能，又需要子宫内膜具有良好的容受性，子宫内膜容受性受激素、细胞因子、神经免疫因素等多方面的调控。慢性子宫内膜炎、子宫内膜息肉、宫腔粘连的情况在 常有存在，使子宫内膜在形态学、受体及相关因子的表达上发生变化 ,降低了其容受性。子宫内膜超声形态如厚度、回声、基底回声、血流灌 注等是反应子宫内膜状况最直接的指标。超声显示正常子宫内膜种植窗时期厚度一般约在 910 容积不小于 2 超声下内膜面积多在 5 宫腔有效空间减少或内膜过薄都会影响胚胎着床与发育，黄体中期时，子宫内膜厚度 7 严重影响受精卵的着床 26。内膜回声变化应均匀一致并具备与卵泡发育的同步性变化，否则会影响妊娠率27，在内膜增生期可以观察到清晰的 三线征 ，而中重度子宫内膜炎，无论结核性或非结核性，其炎性渗出物往往造成内膜回声不均或基底低回声，是影响成功妊娠的内膜因素之一。此外， 子宫内膜的血管活动呈周期性改变，子宫血流舒张末血流逐渐升高，黄体中期达高峰，阻力指数 （ 明显下降，利于胚胎着床。如果子宫动脉 持续增高 ,血管阻力高 ， 组织血液灌注减少 ， 子宫内膜的血供不良 ,影响子宫内膜的发育，胚胎则不能着床或着床后稳定性差 28。 一种糖蛋白，主要作用于中性粒细胞系促进其增殖、分化和活化，对成熟的中性粒细胞可促进游走、吞噬、产酶、释放活性氧、提高杀菌能力和对外来异物的粘着作用。临床主要用于预防和治疗肿瘤放化疗后引起的白细胞减少症、治疗骨髓造血机能障碍及骨髓增生异常综合征、 预防白细胞减少可能潜在的感染并发症、以及促进由感染引起的中性粒细胞减少的恢复。它与同类的巨噬细胞集落刺激因子（ 粒细胞 生殖系统及粘膜修复中也起到一定的作用：对创面、溃疡的愈合有较好的疗效，具有促进粘膜细胞增殖的作用 29。对于生殖系统，集落刺激因子参与了卵泡发育及排卵过程 30、调节卵巢 31及调节颗粒细胞功能 32，调节子宫内膜蜕膜化 33、促进子宫内膜细胞增殖 34及胚胎种植 35。近年的研究发现 刺激周期可以改善低反应 患者卵巢敏感性 38， 是卵子及胚胎种植潜能的一种标记物 39，能够降低复发性流产风险 35,40，是预测 局的指标之一 31，且对自兰州大学硕士研究生学位论文 善子宫内膜状况的临床及机理研究 14 身免疫性疾病具有抑制作用 41。 34对 4 例内膜反应性差、雌激素及血管活性药物抵抗的患者进行了报道，发现当子宫内膜厚度小于 7 ，使用 300 ug/度的 行宫腔灌注对子宫内膜厚度及容受性具有明显的改善作用，提示 能具有促进子宫内膜细胞增生及刺激内膜血管网再生等作用。我们的研究基于 的报道，选择内膜厚度不足、基底低回声、反复种植失败的患者作为研究对象，给予 宫腔灌注，在早卵泡期及晚卵泡期，对于子宫内膜厚度及基底回声改善明显，围排卵期宫腔灌注并不能改善内膜的厚度，但对基底回声仍然有效，可能与 激了子宫内膜血管网中白细胞的生成及成熟，增加了抗炎作用有关；对于子宫内膜基底区血流动力学的影响，主要在于增加了基底区动脉的血流灌注，使得搏动指数增加，然而，并未使得阻力指数下降，但这只是灌注后 48 h 的血流，而我们尚未对多次灌注后、或胚胎移植日的血流动力学做监 测，目前的研究结果显示， 腔灌注可改善子宫内膜的厚度及基底回声，对于内膜较薄、基底低回声及胚胎反复种植失败的患者具有较好的临床治疗效果。 受体（ 人类子宫内膜细胞上广泛分布， 受体表达于人类子宫内膜的上皮细胞，基质细胞、白细胞及滋养层细胞 42, 43及蜕膜化组织等， 由巨噬细胞和 胞所分泌 44, 45。研究发现正常非妊娠妇女的子宫内膜基质细胞可分泌少量的 而所分泌的 以在 88作用 下显著增加。 认为对妊娠滋养层细胞的增值具有促进作用 46，据报道，蜕膜化的子宫内膜基质细胞可产生丰富的非蜕膜化内膜基质细胞只产生很少量 47从而解释 腔灌注对于既往胚胎停育患者的具有治疗作用的原因。有研究显示过量的 通过抑制子宫内膜基质细胞向分泌泌乳素（ 基质细胞分化，从而抑制了8导的蜕膜化，而适量的 能够促进基质细胞向分泌 加 分泌 50。由于子宫内膜基质细胞有多种分泌类型， 如普通基质细胞，分泌 基质细胞，分泌泌乳素的蜕膜化细胞等等，而 子宫内膜容受性的调节可能是通过改变不同分泌类型的细胞数量，从而使内膜分泌的各种生物活性因子达到更利于胚胎植入的状态。这也可能兰州大学硕士研究生学位论文 善子宫内膜状况的临床及机理研究 15 是 腔灌注可改善子宫内膜状况机制之一。 腔灌注能够对雌激素及血管活性药物抵抗的子宫内膜的厚度、不明原因基底低回声的内膜有所改善，对子宫内膜炎症具有治疗作用、促进了子宫内膜细胞增生以及改善了子宫内膜容受性。 孕妇及早产儿、婴儿的安全性尚未确认，现有的研究表明，在安全剂量下静滴或 皮下注射 影响人体健康；无论哪种给药方法及用量，给药 48 h 后，血药及尿药浓度均在检出界限以下。 脉及皮下注射时存在一些风险及不良反应，可能引起骨痛、腰痛、胸痛、发热、头痛、倦怠、心悸等不适，偶有皮肤发红、皮疹；食欲不振、恶心、呕吐等消化道反应及肝功能损害；偶尔可能引起碱性磷酸酶，低密度脂蛋白升高及尿酸和肌酐升高等。对于疼痛可口服消炎痛半片或肌注非那根半支对症治疗；其余不适无需特殊处理。在我们行宫腔灌注的 60 例患者中，有 1 人发生轻度骨痛，第二天缓解， 2 人出现眼睛红肿干涩，休息后缓解， 2 人 有脱发症状，其余患者无不适。在经过 复宫腔灌注治疗后，对于内膜状况较前改善的患者择期解冻胚胎进行移植，取得了较好的妊娠率，由于本研究的样本量有限，观察时间尚短，期待今后大样本的临床实验能够进一步证实 子宫内膜厚度、回声的改善及对作用机制进行更深入的研究。 兰州大学硕士研究生学位论文 善子宫内膜状况的临床及机理研究 16 第 三 章 料与方法 织标本的获取 选取 2012 年 12 月 4 月在兰州大学附属第一医院妇产科因子宫肌瘤（肌壁间）行全子宫切除术的患者 6 例，平均年龄 40 岁，所有患者术前 3 个 月均未用过激素治疗。在行全子宫切除术后，无菌条件下切取子宫内膜，浸于加有双抗（青霉素 +链霉素）的生理盐水中， 30 运往实验室进行分离培养。 要仪器 高压灭菌仪 日本 司 4 冰箱 青岛海尔有限公司 冰箱 青岛海尔有限公司 离心机 美国 司 摇床 北京恒奥生物科技有限公司 酶联免疫检测仪 美国 司 英国 司 倒置相差显微镜 日本 司 超净工作台 济南鑫贝西生物有限公司 96 孔细胞培养板 美国 司 6 孔细胞培养板 美国 司 直径 10胞培养皿 美国 司 细胞计数板 上海求精生化试剂仪器有限公司 粘附载玻片 上海卧宏科技有限公司 要试剂 12 培养基 美国 司 胎牛血清 美国 司 胰蛋白酶 美国 司 兰州大学硕士研究生学位论文 善子宫内膜状况的临床及机理研究 17 胶原酶 美国 司 国 司 鼠抗人 克隆抗体 美国 司 国 司 海谱振生物科技有限公司 抗人角蛋白抗体 美国 司 抗波形蛋白抗体 美国 司 剂盒 武汉博士德生物工程有限公司 色剂 武汉博士德生物工程有限公司 垢剂 美国 司 记 国 司 宫内膜细胞组织块培养法 用无菌生理盐水冲洗内膜组织 3，超净台内在 60 养皿中用眼 科剪将内膜组织剪碎至糊状（约 1 加入适量 养液，用 1 入培养皿，再加入适量培养液将皿中的组织块吹打均匀，置于 37 二氧化碳培养箱静置培养 3 天， 3 天后用倒置显微镜观察细胞贴壁情况。 宫内膜细胞 分离及接种 基质细胞分离 待子宫内膜细胞贴皿底达 80%以上时进行分离，用培养液冲洗皿底 3 次，加入 蛋白酶 3-5 化 3-5 显微镜下观察细胞变圆，成悬浮细胞后，加入完全培养基吹打终止消化。收集细胞悬液至无菌刻度离心管中放入离心机， 以 500 r/心 3 集上清液，主要为基质细胞，以1200 r/心 10 上清液即得基质细胞，加入适量完全培养基，重悬细胞以 1106/密度接种细胞。 腺上皮细胞分离 将消化的细胞悬液置于刻度离心管中放入离心机 500 r/心 3收集沉淀物，用无血清 养液漂洗后 800 r/心 5 上清，加入适量完全培养基 重悬细胞 1106/密度接种细胞；基质细胞和腺上皮细胞于培养箱中静置 3 天后均贴壁。 疫组化法鉴定 子宫内膜细 胞 用细胞角蛋白 波形蛋白抗体对腺上皮和基质细胞进行细胞爬片免疫化兰州大学硕士研究生学位论文 善子宫内膜状况的临床及机理研究 18 学染色，基质细胞及腺上皮细胞爬片 5 天后进行免疫细胞组织化学染色鉴定。一抗为兔抗人 克隆抗体，浓缩液 1： 200 稀释，鼠抗人 克隆抗体 1:200 稀释，二抗为生物素标记羊抗兔或小鼠 剂盒，试验步骤严格按照试剂盒说明书进行，具体如下： 洗标本 3 次 ， 各 1 4%多聚甲醛固定 30 气干燥 5 洗标本 3 次 ， 各 2 ） 孵育 1 次 20 洗标本 3 次 ， 各 2 3%色液体）孵育 1520 除内源性过氧化酶活性， 洗标本 3 次 ， 各 2 加封闭血清（试剂 A 蓝色液体）室温孵育 1520 去，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗孵育（滴度 1： 200，湿盒） 4 过夜或 37 23 h； 洗标本 3 次 ， 各 3 加试剂 B（黄色液体）即二抗工作液孵室温或 37 1520 洗标本 3 次 ， 各 3 滴加试剂 C（橙色液体），室温或 37 孵育1520 洗标本 3 次 ， 各 3 色（ A， B， C 依次各加一滴，避光，镜下观察至棕色 ）约 310 来水充分冲洗，苏木素复染，蘸后即刻取出，自来水洗返蓝，梯度酒精脱水 85， 95， 100%各 3 甲苯透明，蘸后即刻取出，用中性树胶封片后显微镜观察及拍片。 及 腺上皮细胞的影响 96 孔板中的细胞贴壁 24 h 后 ， 弃去培养基 ,加入 新鲜 含血清的 养基 200 分别加入不同浓度的 度 分别 为 100 pg/200 pg/500 pg/ 1000 pg/并设有空白对照组 和 阴性对照组。继续培养 ， 24 h 后加入 5mg/ 20孔 ， 孵育 4 h， 弃去培养基 ， 加入 37 孵育30速震荡 10在酶联免疫检测仪 490 长测定吸收值 （ ， 比较各组 并 绘制条图 。 可反应 细胞存活率表示 ， 即细胞存活率 =（ 实验组 空白对照组 ） /（阴性 对照组 空白对照组 ）*100%。 式细胞仪 检测 两组细胞 6 孔板中的细胞贴壁 24 h 后，弃 去培养基 ,加入 新鲜 含血清的 养基2 基质细胞和腺上皮细胞 培养孔中 分别加入 200 及 500 pg/48h 后弃去培养基，用不含血清 洗 2 遍，使用胰酶分别消化两种细胞，于显微镜下观察悬浮细胞达 80%以上时，终止消化。以 1200 r/ 800 r/速度分别离心基质细胞及腺上皮细胞，弃去上清，将沉淀物吹打均匀后，取 200 P 管中，分别加入 10 E 荧光标记的 吹兰州大学硕士研究生学位论文 善子宫内膜状况的临床及机理研究 19 打均匀，室温放置 15，上机检测。 组 细胞 3及 241 6 孔板中的细胞贴壁 24 h 后，弃去培养基 ,加入新鲜含血清的养基 2 质细胞和腺上皮细胞培养孔中分别加入 200 及 500 pg/48h 后弃去培养基，用不含血清 洗 2 遍， 进行如下操作： 取 1. 6 孔板加入 500 上匀浆（边匀浆边暂停） 2. 转入一新 中（ 室温裂解 10. 加氯仿 200 荡混合（手摇剧烈），室温静置 5. 13000 离心 15. 转移上层水相（吸 70%）到一新 中，加等体积异丙醇 ,振荡混合，室温静置 10. 13000 离心 15. 倒掉上清，加 15%无水乙醇（ 4保存），振荡混合， 8000 离心 5. 倒掉上清，室温或 37放置 20P 管倒置在滤纸上 )使 淀干燥 9. 加 30至 中 10. 在 60孵育 3 分溶解 逆转录 1. 暂离心 2. 将 11 和 1入 内，置于冰上，使 浓度为 加入 1轻混合均匀，短时间离心 3. 将反应液置于 65 5上 1时间离心 4. 按顺序加入： 5 400糖核苷酸酶抑制剂 10mm 2转录酶 1轻混合均匀，短时间离心 5. 将混合物置于 42， 60. 70加热 5止上述反应，置于冰上 兰州大学硕士研究生学位论文 善子宫内膜状况的临床及机理研究 20 聚合酶链反应 . 物 上游引物 5 下 游引物 5 扩增片段理论长度 326 3 上游引物 5 下 游引物 5 扩增片段理论长度 262 上游引物 5 下游引物 5 扩增片段理论长度 645 5反应体系，冰上操作，稍后短时间离心 1 1 1 补至 25环 : 94 5 94 45s 45s 72 45s (从第 2 步开始循环 30 ) 72 7 4 12h 束后置于冰上开始电泳 凝胶电泳 加样 ： 样本孔：上样缓冲液 6 物 10物 =1:5） ， ：取 果 宫内膜细胞鉴定 用组织块培养法联合差速离心法对子宫内膜基质细胞及腺上皮细胞的分离兰州大学硕士研究生学位论文 善子宫内膜状况的临床及机理研究 21 成功率均达 90%以上，子宫内膜基质细胞呈长梭形，腺上皮细胞形态较不规则，呈短梭形，蝌蚪状、类圆形等。 见图 7、 8。 图 7 分离后的子宫内膜基质细胞 形态 (倒置显微镜下 40 ) 图 8 分离后的子宫内膜腺上皮细胞 (倒置显微镜下 40 ) 兰州大学硕士研究生学位论文 善子宫内膜状况的临床及机理研究 22 用免疫组化法对子宫内膜基质细胞和腺上皮细胞进行鉴定，基质细胞对波形蛋白抗体呈阳性反应，可见胞浆中棕黄色颗粒；腺上皮细胞对角蛋白抗体呈阳性反应，胞浆显示棕黄色。 见图 9、 10。 图 9 波形蛋白抗体对 子宫 内膜基质细胞的鉴定 图 10 角蛋白抗体对 子宫内膜 腺上皮 细胞的鉴定 宫内膜细胞增殖 基质细胞 如表 9、 10、 11、图 11 所示 ， 基质细胞在 004胞存活率无显著性差异，体外培养 72h 时，细胞存活率下降，且与 度呈负相关 。 兰州大学硕士研究生学位论文 善子宫内膜状况的临床及机理研究 23 表 9 加药后 24 h 子宫内膜 基质 细胞 组别 pg/ 0 00 00 00 000 10 加药后 48 h 子宫内膜基质细胞 组别 pg/ 0 00 00 500 1000 与对照组相比较 *P 11 加药后 72 h 子宫内膜基质细胞 组别 pg/ 0 00 200 500 1000 与对照组相比较 *P州大学硕士研究生学位论文 善子宫内膜状况的临床及机理研究 24 图 11 同浓度及 作用 时间 的 子宫 内膜基质细胞 增殖水平图 腺上皮细胞 如表 12、 13、 14， 图 12 所示 ， 腺上皮细胞在 00pg/8h，细胞存活率最高，差异有统计学意义（ P 表 12 加药后 24 h 子