【毕业学位论文】（Word原稿）无尾两栖类晶状体发育及再生过程中Sox2基因和αA-，βB1-晶状体蛋白的表达研究

兰州大学硕士学位论文 无尾两栖类晶状体发育及再生过程中 因和 1 第一章 前言 状体的发生 状体的决定和诱导 胚胎晶状体起源于神经板附近的外胚层。当神经管闭合后，预定视网膜区域从前脑外突形成视泡，随后视泡与表面头部外胚层的预定晶状体直接接触，几个小时后，外胚层增厚形成晶状体板，晶状体板中的细胞开始合成晶状体特异性的晶状体蛋白 1。在实验胚胎学出现前， 19 世纪的生物学家认为，晶状体的发育依赖于预定晶状体组织和周围组织的相互作用，尤其是它和发育中的视网膜的相互作用，因为在视杯从覆盖在其上的外胚层脱落的不正常的人类和动物胚胎中，或者在无眼畸形的情况下，如果视杯缺失，则晶状体也会缺失。 1901 年， 神经板期胚胎的预定视网膜区域，这些胚胎的眼和晶状体都未发育 ，而晶状体是起源于实验中未受到损伤的外胚层，因此，他认为视泡与外胚层的接触是晶状体形成所必需的。此后， 实验进一步使这一晶状体诱导的基本观点成形。 视泡移植到 侧面外胚层下，结果晶状体在这个位置形成。这些结果表明，眼原基对于晶状体诱导是充分条件。后来，有人重复 实验时，得到了相反的结果。 80 年代末期， 人使用世系追踪技术证明在 R. 胎侧面异位表达的晶状体仅仅来源于污染的供体细胞，这些细胞携带在移植的视泡上。因此 ，视泡对于晶状体诱导并不是充分条件。晶状体的发育过程远比 观点复杂 2, 3。实际上晶状体的决定 开始于更早的时期，在原肠胚形成时，有一个短暂的时期中外胚层首次对来自预定神经板前部的晶状体诱导信号起反应。有人提出，在原肠胚晚期及神经板形成时期，当预定晶状体区域暴露于晶状体诱导信号，预定晶状体外胚层发生了变化，从而产生了形成晶状体的倾向性。与此同时，一些重要的调节基因在预定晶状体区域表达，包括视网膜和晶状体形成所必需的 , 4。晶状体外胚层具有形成晶状体倾向性的假设来源于一个移植实验。在这个实验中，从原肠胚期到神经管期，预定晶状体外胚层被移植到另一个宿主胚胎的预定晶状体区域，覆盖在新形成的视泡上。研究结果表明，视泡是一兰州大学硕士学位论文 无尾两栖类晶状体发育及再生过程中 因和 2 个非常弱的晶状体诱导子，实际上，原肠胚外胚层基本不能对来自视泡的信号起反应。而这个外胚层被移植到更早时期胚胎的结果与此相反，在更早时期的胚胎中诱导信号更强烈。然而，当更后时期的预定晶状体外胚层被移植到诱导 环境弱的神经管期胚胎中，产生了增强的晶状体形成反应 5。这个结果表明，在这些中间时期中，预定晶状体外胚层状态发生了变化，使其预先具有晶状体形成倾向。有实验证实，在非洲爪蟾和 ，晶状体外胚层及其毗邻的头部表面外胚层在神经胚期获得形成晶状体的倾向 1。实验证明，只有中期和晚期的外胚层具有对神经板前部的信号起反应的感受性，这种感受性被认为是外胚层自身固有的，不是被周围组织所诱导的。有人将晶状体的决定划分为三个时期：感受性，倾向性和最后的决定。感受性是对起初的诱导信号起 反应的能力，它被认为是在外胚层中独立存在的过程，前神经板提供形成晶状体的倾向性，最后的决定则是由视泡诱导的。 状体的形态发生 视泡与预定晶状体外胚层接触后预定晶状体外胚层的细胞开始伸长形成晶状体板，增厚的晶状体板随后向视泡内陷形成晶状体窝，最后离开头部表面外胚层形成晶状体泡。大多数脊椎动物的晶状体发生过程是基本相同的，但两栖类动物不经过晶状体窝的阶段，增厚的晶状体板分为内层和外层，内层发育成中空的晶状体泡，而外层发育成预定角膜上皮。组成晶状体泡后壁的细胞随后伸长并分化形成初级晶状体纤维细胞。这 个分化过程包括细胞周期阻滞，细胞去核以及晶状体蛋白的急剧上调。晶状体泡的前部细胞形成一个单层的晶状体上皮包围着晶状体纤维。晶状体赤道区域的晶状体上皮细胞持续分裂并最终分化成次级晶状体纤维细胞。成熟的初级晶状体纤维细胞和次级晶状体纤维细胞在晶状体内逐步伸长，最后填充于整个晶状体中。而位于晶状体赤道区域前方的细胞始终保持为晶状体上皮细胞。在晶状体泡形成的过程中，视泡也形成了视杯，由神经视网膜和视网膜色素上皮层内外两层组成 6。 图 1脊椎动物晶状体发育图示 7 of in 州大学硕士学位论文 无尾两栖类晶状体发育及再生过程中 因和 3 视泡（ 头部表面外胚层（ 晶状体板（ ，视杯（ 晶状体窝（ 视网膜（ 晶状体泡（ 晶状体上皮（ 晶状体发生相关的转录因子 晶状体的发生是一个阶段性的过程，伴随着很多转录因子的相继激活。根据它们的功能，可以将这些转录因子归纳为三类。第一类由基板前基因组成，它们涉及基板前外胚层的形成，基板前外胚层是头盖感觉组织的共同原基。第二类由晶状体 特化基因组成，它们在基板前外胚层内建立了晶状体区域。第三类由晶状体分化基因组成，它们在视泡与预定晶状体外胚层接触后促进晶状体的形态发生6。在原肠胚形成末期，包围神经板前部的基板前外胚层表达“基板前基因”，包括 , 9， 0， 1， 2， 3, 4， 5也在基板前外胚层的前部表达。基板前基因表达后，在神经板期，晶状体特化基因 始在预定晶状体外胚层表达 12, 16。 开始在包括预定晶状体和鼻外胚层的基板前外胚层表达，但随着发育的进行，最后定位在预定晶状体外胚层。神经管闭合后，预定视网膜区域从前脑外凸形成视泡。当视泡与预定晶状体外胚层相互作用时， 预定晶状体区域被激活 17, 18。预定晶状体外胚层与视泡接触后，预定晶状体外胚层细胞伸长形成晶状体板，这一过程中“晶状体分化基因” 被激活，包括 9， 0， 1，2， 2， 3， 7和 4。基板前基因，比如 0，5， 6， 4和 5的表达在晶状体板形成时被关闭。随后晶状体泡后部的细胞伸长并分化成初级晶状体纤维，在晶状体板中表达的基因中， 7， 2和 7在晶状体纤维细胞中维持表达。与晶状体纤维细胞不同的是，晶状体上皮细胞中持续表达 3， 8， 9，9， 0， 1和 2。 状体再生 蟾晶状体再生 非洲爪蟾具有晶状体再生的能力， 1963 年， 出非洲爪蟾的再生晶状体来源于外角膜内层。他将非洲爪蟾晶状体再生的形态发生过程划分为 5 个时期（如图 1第一个阶段，爪蟾外角膜的内层细胞从鳞状转变成立方状；第二个阶段，外角膜的内层细胞形成两到三层厚的细胞团；第三个阶段，细胞团形成晶状体泡，这个过程又可以分为早期中期和晚期三个亚期；第四个阶段，晶状体兰州大学硕士学位论文 无尾两栖类晶状体发育及再生过程中 因和 4 泡的后端形成初级 晶状体纤维；第五个阶段，初级晶状体纤维被次级晶状体纤维包围 30。变态前的非洲爪蟾蝌蚪的晶状体被摘除后，外角膜内层中间区域的细胞转分化形成新的晶状体细胞。存在于玻璃体中的诱导因子在这个过程中起到重要的引导作用，这种因子被认为来源于视网膜，称为玻璃体因子，它可以在外角膜细胞和角膜周围上皮细胞中诱导晶状体分化。外角膜和角膜周围上皮共同构成了一个晶状体形成区域，这个区域的大小大概是眼睛直径的两倍 30, 31。研究表明，将外角膜和角膜周围上皮的碎片移植到眼睛的玻璃体腔中并暴露于玻璃体因子，它们能转分化成晶状体组织，在这些实验中，原有的晶状体保留在原处，新的异位晶状体从移植物上生长出来 32, 33。而来自于晶状体形成区域外的上皮碎片则不会形成晶状体。正常情况下，晶状体本身和内角膜形成的物理屏障使外角膜细胞不能与玻璃体因子接触。如果用微孔滤器屏障代替晶状体，角膜转分化也不发生，表明玻璃体与外角膜物理接触的破坏阻碍了再生 34。 在非洲爪蟾中，外角膜再生新的晶状体的能力在 50期和 58期之间逐渐减弱，59 期后几乎没有，到变态后完全消失。研究表明，晶状体再生能力减弱主要是因为内角膜的快速愈合阻碍了视网膜因子到达外角膜，从而抑制了外角膜的晶状体转分化过程，而外角膜在爪蟾晶状体再生能力丧失后仍具有一定程度的形成晶状体的能力 35。同为爪蟾属的热带爪蟾不能正常再生晶状体，正是因为这个种的内角膜愈合迅速，而热带爪蟾的角膜是具有转分化的能力的，有人将其角膜移植到玻 璃体腔证明了这点，这表明角膜转分化涉及的因子和应答通路在热带爪蟾和非洲爪蟾中是保守的。不过热带爪蟾角膜对玻璃体因子应答的区域更集中，只有中央的角膜细胞可以转分化，而周围角膜细胞不能 36。为了研究非洲爪蟾蝌蚪外角膜这种再生晶状体的能力是由引导晶状体形成倾向性和预定晶状体外胚层的晶状体分化的早期诱导因子产生的，还是由引导角膜形 成的晚期诱导因子产生的，或是由二者共同产生的，有人将经历了不同时期的诱导因子的外胚层表皮或角膜移植到玻璃体腔中并检测再生能力，研究表明，两种诱导因子都与外角膜的这种能力有关并且任何一种因子都能单独诱导这种能力 37。角膜 两个过程的形态分化似乎是相同的。晶状体是从胚胎头 部表面外胚层发生的，外角膜也是从这个区域衍生的。转分化需要与神经视网膜相互作用，而在胚胎晶状体发生的后期视泡和预定晶状体外胚层也有相互作用。鉴于这两个过程间的这些相似处，有研究者比较了 6晶状体发生和再生过程中的表达模式，研究发现这些基因在两个过程中都有表达，这表明这两个过程是紧密联系的，这些基因的重复表达可能是角膜 38。 兰州大学硕士学位论文 无尾两栖类晶状体发育及再生过程中 因和 5 图 1洲爪蟾蝌蚪晶状体再生过程图示 30 of 蝾螈晶状体再生 蝾螈具有晶状体再生的能力，再生的晶状体来源于虹膜背缘色素上皮细胞，这个过程被称为 生。具体过程是：晶状体摘除后，背缘虹膜的色 素上皮细胞去分化，即这些细胞失去原有的细胞特性例如色素化。巨噬细胞也被募集到这个区域介导这个过程。去分化同时标志着重新进入细胞周期，这个对于增殖是非常重要的。在晶状体摘除后 4 天可以观察到增殖的第一个高峰期，大概晶状体摘除后 10 天，去分化的细胞在虹膜背缘形成一个有内外两层的囊泡 39。晶状体摘除后 12时，囊泡的内层开始增厚，细胞伸长并分化成初级晶状体纤维细胞，这个时候可以观察到增殖的第二个高峰期，并且晶状体蛋白开始合成。随着再生过程的进行，初级晶状体纤维继续在囊泡内层形成，次级晶状体纤维也开始在晶状体囊的外层。晶状体摘除 18时晶状体蛋白继续合成。晶状体摘除后 25 天，一个完整的包含晶状体上皮和晶状体纤维细胞的完整的晶状体形成 40。 它物种的晶状体再生 晶状体再生现象并不是只限于两栖动 物，在其它脊椎动物中也有发生。有研究报道，在鸡胚中，晶状体从靠近脉络膜的虹膜边缘的一层细胞再生。与蝾螈类似，有些有种类的鱼能通过虹膜背缘转分化再生晶状体。其它的脊椎动物，如小鼠，兔子，和猫也能再生晶状体，但是与其它动物不一样，这些哺乳动物不是通兰州大学硕士学位论文 无尾两栖类晶状体发育及再生过程中 因和 6 过转分化再生晶状体，而是由残留在晶状体囊上的晶状体上皮细胞再生而来，如果没有晶状体囊，晶状体再生则不能发生 41。 状体再生的分子生物学研究 晶状体再生相关的信号途径 血酶信号途径 损伤可以导致脉管系统中凝血素的释放，然后凝血因子激活 凝血酶。凝血酶在蝾螈细胞重新进入细胞周期中起到重要作用。用凝血酶处理蝾螈骨骼肌小管可以诱导增殖，而小鼠的肌小管没有这种反应 42。有人推测，这种物种特异性的反应说明凝血酶与再生组织中的有丝分裂后的细胞重新进入细胞周期相关，并发挥重要作用。 研究支持了这一推测，他们的研究表明，在体外用凝血酶处理成体蝾螈背缘和腹缘的色素上皮细胞，可以使它们重新进入有丝分裂的 对于凝血酶在晶状体再生中作用的最有力的证据来自于 研究。 他们的研究表明，在蝾螈晶状体摘除后 20 分钟到大约 7 天的时间内，凝血酶在背缘虹膜瞳孔缘被激活，在不能再生晶状体的虹膜腹缘则没有凝血的激活 43。凝血酶的抑制导致虹膜背缘细胞不能重新进入细胞周期，晶状体再生不完全或被抑制 43, 44。 号途径 其受体对于晶状体发育有重要作用。 控制晶状体蛋白基因表达及调节表达的时空模式中起到支配性的作用。另外，它们在晶状体纤维分化和维持中也发挥重要作用。在鸡中 远端视泡的表达导致晶状体区域的扩大 45。在转基因小鼠中过量表达 致晶状体上皮的不正常分化 46, 47。许多体与晶状体再生相关。用 理晶状体摘除后的蝾螈眼睛可以诱导虹膜背缘产生具有不正常极性的晶状体和两个晶状体的形成 48。 于虹膜背缘上皮细胞体外再生晶状体是必需的。体外培养的背缘虹膜细胞只有在 处理时才形成晶状体 49。 人的研究表明，眼内注射组体能诱导虹膜背缘在没有摘除原有晶状体的情况下再生晶状体。 ，如 0。眼内注射 而在背缘虹膜形成晶状体样结构 51。 非洲爪蟾晶状体再生中也发挥重要作用。体外培养的非洲爪蟾蝌蚪外角膜在 在的情况下发生分化。不同的 体也在晶状体再生中有重要作用，包括 8, 52, 53。研究发现， 表达限定在去分化的背缘虹膜，在调节晶状体再生中发挥作用。将蝾螈培养在 无尾两栖类晶状体发育及再生过程中 因和 7 这种能抑制 身磷酸化的化学物质的溶液中，晶状体再生和纤维分化被抑制，这表明 号在晶状体再生中起到关键作用 52。用 理背缘虹膜色素上皮细胞团也能抑制这些细胞团的晶状体再生 49。将 染至培养的蝾螈背腹缘虹膜色素上皮细胞，然后移植到宿主蝾螈中，并不能诱导腹缘虹膜再生，虹膜背缘再生晶状体也没有收到影响，这表明 号对于晶状体再生并不是充分的 50。 号途径 号途径，尤其是 脊椎动物眼睛和晶状体发育中起重要作用 54, 55。研究表明， 晶状体再生中也发挥重 要作用。有研究报道，抑制 处理可以诱导没有再生能力的腹缘虹膜再生晶状体 56。在这个实验中，研究者用重组型鼠腱蛋白或者截短的没有信号能力的人类 理蝾螈虹膜外植体来抑制 号，然后再将其重新抑制到宿主蝾螈中。两个处理均能诱导正常情况下无再生能力的腹缘虹膜再生晶状体。另外，研究发现被 理 的背缘虹膜外植体的晶状体再生能力减弱。 号途径 在晶状体发育中， 号途径对于晶状体上皮分化成晶状体纤维细胞是必需的 57 受体基因的纯合子突变小鼠的晶状体上皮不能进行充分分化 58。另外， 号能导致 小鼠胚胎眼周外胚层的功能缺失导致异位类晶状体的形成 59。为了研究 号在晶状体再生中的可能作用，研究者使用了 抑制剂以及 白复合物的小分子拮抗物 60, 61，不过使用这些分子并不能决定性地说明 号在晶状体 再生中的作用，因为 多种作用并且存在多种 号途径。在以上两种情况下，背缘和腹缘的虹膜外植体在体外培养中被处理，然后被移植到摘除晶状体的蝾螈眼睛中。这两种处理对 号的激活或抑制均没有影响晶状体再生，这表明 号在晶状体再生中没有发挥决定性的作用。 类视黄醇及其受体在晶状体发育和再生中都起到重要作用 28, 62。小鼠胚胎的视黄酸缺陷导致晶状体板的形成和视泡内陷失败，最终导致小眼性状。视黄酸受体在 外，视黄酸及它的其它类似物调节晶状体细胞中的基因表达，并在维持上皮中起到重要作用 47。在发育过程中，视黄酸还能控制神经视网膜细胞的命运 63, 64。外源的视黄酸能导致异常的晶状体分化 65。视黄酸及视黄酸受体在蝾螈晶状体再生中起到关键作用。晶状体摘除后，用视黄酸受体的拮抗物处理蝾螈严重减弱了背缘虹膜的再生能力 39, 兰州大学硕士学位论文 无尾两栖类晶状体发育及再生过程中 因和 8 66。 晶状体发 育及再生相关的转录因子 因家族编码的转录因子包含一个进化上保守的 泛分布在脊椎动物和无脊椎动物中，在发育过程中起到重要作用 67。根据序列同源性，可将 68，其中 69。在鸡胚中，通过 析证实， 晶状体中主要表达的 因。鸡胚中，视泡和表皮头 部外胚层接触后， 始在与视泡相对的外胚层表达，同时表达 细胞开始形成晶状体板并且表达 后形成晶状体， 晶状体的形成过程中持续表达。在小鼠的晶状体发育过程中， 表达情况与在鸡胚中的类似，不同的是，当小鼠的晶状体分化完成后， 表达量急剧减少 70。 已经有 实验证明， 结合起始 1而起始晶状体的分化。在鸡胚的侧面头部外胚层，通过电转实验同时导入表达 表达载体，发现在眼睛以外的胚胎表面形成了表达 1些细胞团具有晶状体板的一些特性 ,即有增厚的上皮结构并且表达作为晶状体标志的 171，这表明 复合物不只是激活 1际上还起始晶状体从头部外胚层发生 。 相互作用还调节晶状体发育的其它步骤。有实验发现，在表达 头部外胚层，外源性的和异位的 表达导致 达的稳定性 71，这表明 维持机制依赖 作用。 因上维持 达的基因元件已经被识别，这个元件是由 结合而激活的 72。在鸡的晶状体发育中， 白，尤其是 73，而研究表明 ， 转录是由 复合物激活的 74，一旦 白的基因被激活， 白和 2 3 又协同作用增强 75。在小鼠晶状体发育中， 白（ 2 3）和 白相互作用激活 70, 76, 77。在爪蟾中， 且在早期发育过程中， 表达限制在中枢神经系统。在用成纤维细胞生长因子处理的动物极中， 过量表达诱导神经分化标志的产生，另外， 显性负性突变子的过量表达导致神经分化标志的减少，这些表明 爪蟾的神经发育中是必不可少的 78, 79。通过测到 爪蟾胚胎 11期开始表达直到 38期。通过 in 实验发现，爪蟾胚胎 28期时 大脑和视泡表达，35 期时 大脑神经视网膜和晶状体表达 78。在正常蝾螈虹膜中， 是晶状体摘除后， 虹膜背缘的表达水平提高，尤其兰州大学硕士学位论文 无尾两栖类晶状体发育及再生过程中 因和 9 是晶状体再生出来后， 达水平显 著提高 80。另外，有研究通过 现，在爪蟾晶状体摘除后 42角膜的表达量急剧上升 81。 晶状体发育中发挥非常重要的作用。 杂合子突变导致人的无虹膜畸形及小鼠的小眼性状 4, 82。在果蝇和爪蟾中， 过量表达诱导异位眼睛的形成 83, 84。在预定晶状体上皮定向表达 显性负性突变体可以抑制 而导致晶状体板形成失败 74。研究发现，在蝾螈中， 晶状体再生的早期活动相关，调节细胞增殖和晶状体纤维分化。 背腹缘虹膜的增殖细胞中均有表达， 达的下调使虹膜色素上皮细胞的增殖显著减少，从而阻碍了晶状体再生，但是背缘虹膜的去分化诱导没有受到抑制。在晶状体再生的早期敲除 致晶状体蛋白的表达受到抑制，阻碍了晶状体纤维分化。但是，一旦晶状体蛋白表达和晶状体纤维分化开始了，缺失则不会影响晶状体蛋白的 表达和晶状体纤维的维持，而对增殖的影响依然存在 85。研究表明， 表达和爪蟾外角膜及上皮的晶状体再生能力密切相关。 外角膜及角膜周围上皮组成的晶状体形成区域表达，而在晶状体形成区域以外的不具备晶状体再生能力的头部上皮及侧面上皮则没有表达。将眼睛移植到头部上皮和侧面上皮下，只有头部上皮在移植后获得了晶 状体再生能力，能在被移植到玻璃体腔后形成晶状体，而 在覆盖移植眼睛的头部上皮中重新表达。另外，对侧面表皮注射 使其获得晶状体再生的能力，使其在被移植到玻璃体腔后形成晶状体 86。 晶状体形成所必需的一种重要的转录因子，在晶状体板及 晶状体发育后期的晶状体上皮表达 87。在青鳉胚胎 2胞期错位表达 以导致异位晶状体在耳基板形成 88，在青鳉胚胎二细胞期敲除表达导致前脑和眼睛的缺失 89。在完整的蝾螈虹膜组织， 背缘虹膜及腹缘虹膜均表达，在腹缘虹膜的表达更高。然而，在晶状体再生中， 表达只在背缘虹膜有显著增加。另外，用 黄酸处理腹缘虹膜色素上皮诱导腹缘虹膜转分化。 独并不能引起腹缘虹膜色素上皮细胞转分 化，而是需要视黄酸（ 存在。有人提出， 背腹缘虹膜表达增强到高于各自的正常阈值是诱导晶状体再生的关键，而不是 相对量 56。 果蝇转录因子 小鼠的同源物。 要在晶状体中表达，调节晶状体蛋白在晶状体纤维细胞中的表达 90。在鸡胚中， 件结合激活 91。 无尾两栖类晶状体发育及再生过程中 因和 10 还可能与晶状体上皮分化为晶状体纤维细胞的 过程相关。 除的小鼠晶状体不能发生晶状体纤维细胞的分化而维持空泡状态，晶状体后部的上皮细胞增殖异常，细胞周期抑制蛋白 表达下降，并产生不正常的凋亡。正常晶状体中 在 除的小鼠中，致晶状体后部的细胞不能延伸分化成纤维细胞。这说明，在 除的小鼠晶状体中，晶状体纤维细胞的分化能够开始，但是后期停滞，因而推测 晶状体纤维细胞终端分化及延伸过程所必须的92。在爪蟾晶状体再生过程中， 先在晶状体再生的第三阶段即晶状体摘除后 4时在新形成的细胞团中被检测到，但是在表达了 角膜周围区域没有表达，当再生晶状体开始分化， 晶状体上皮及晶状体纤维细胞中都有表达，随后，随着晶状体再生基本完成， 再生晶状体中的表达逐渐下降 93。 于晶状体蛋白 晶状体蛋白是晶状体内主要 的和特异性的蛋白质，构成了晶状体内可溶性蛋白的 90%以上。哺乳类 、 两栖类和鱼类中有三种晶状体蛋白： 晶状体蛋白， 晶状体蛋白和 晶状体蛋白；鸟类和爬行类中则有 目前 种研究结果相差很大。导致这种差异的主要原因是，复合体的分子量测定结果取决于很多参数，例如浓度，温度， 子强度，以及所研究的晶状体的年龄和物种。另外一个原因是，许多研究者用体积 排阻色谱法估量 使用这种方法得到的数据并不精确，因为蛋白与柱子之间有相互作用，洗脱液的体积依赖于洗脱分子的形状，另外还需要合适的标准蛋白进行校准 94。 人对牛的 们的研究结果显示 7稀释溶液中的平均分子量大约是 550天然状态下约为 7005。在哺乳动物晶状体中，:194。 其他组织中有微量表达， 96到目前为止，我们还没有得到 因在于 的亚单位数目在十个和四十个之间变化 94, 99。为了使晶状体达到必需的折射率，晶兰州大学硕士学位论文 无尾两栖类晶状体发育及再生过程中 因和 11 状体中的蛋白浓度必需非常高，例如，在人类的晶状体中心，蛋白浓度达到了450 mg/00。在典型的哺乳动物晶状体中， 5%。因此它是使晶状体达到这种必需折射率的主要蛋白成分之一 94。 胸腺和脾中也有极微量的表达。在人类中， 1 号染色体上，编码有 173 个氨基酸残基的蛋白。 码，这个基因包含三个外显子和两个内含子，其中三 个外显子分别编码： 63， 41 位， 67氨基酸残基。 因突变可以导致隐性或显性白内障，这除了与 和 101, 102。 1998 年， 人首次报道了 116C 导致一个家族的常染色体显性白内障 103。对敲除 抑制 前关于 94。 在人类中， 1 号染色体上，编码有 175 个氨基酸残基的蛋白。维持晶状体透明性起结构性的作用。如骨骼，心肌，在皮肤，脑和肾中也有少量表达，说明它有通用的细胞功能 104, 105。 透压和氧化的损害。在 纤维细胞中， 可以和变性蛋白不可逆结合，阻止大的光散射聚合物的形成。在晶状体中，它 的这种功能对于防止白内障有重要作用，因为蛋白质很容易受到渗透压和氧化应激的影响而变性和聚集 106, 107。另外，研究发现 如老年痴呆症 108，弥漫性路易体病 109，克雅氏病 110，尤其是在亚历山大症中，它形成了罗森塔尔纤维的主要成分 111。在这些疾病中， 是 清楚。 5%，是 /12。在人类中， 编码 于22 号染色体上，并有类似的基因结构。 无尾两栖类晶状体发育及再生过程中 因和 12 与其它蛋白之间的相互作用对于晶状体透明性有关键作用 113。 新生鼠晶状体中它占可溶性蛋白总量的 114，并且在晶状体上皮没有表达，但是它的表达与纤维细胞的开始伸长同时发生 115因此它是晶状体纤维分化的标志 ，且调控其转录的分子机制与纤维细胞分化的分子机制部分相同。 调控，它们结合于 同调节其表达 118。有研究表明 ，在鸡胚中 1 件（ 68） ，在晶状体细胞和非晶状体细胞中激活启动子活性。另外，鸡的 不同的细胞条件下作用不同。研究证明，在这个区域，至少有一个亲和力相对低的 合位点介导 活，两个高亲和力的点介导 抑制作用 91。 件结合，并激活 三个顺式元件都结合，并且是 转染实验中，当 转染，它们激活 此，根据这三个转录因子在晶状体发生中的时空表达，有人提出，在晶状体上皮中 制在分化的晶状体纤维中， 代 118。 5%，分为 A， B， C， D 和 E 晶状体蛋白。 N 端与 C 端相似 119。在人类中， 有一个无活性的启动子，并且在第二个外显子有一个终止突变。在 白内障中， 0 倍，大约增加到了 0%，从而引起了白内障的发生，这是第一例与假基因再激活相关的人类疾病 120。 状体蛋白的时空表达 各类晶状体蛋白的合成模式在不同动物的晶状体发育期间有时间和空间上的差异。在大鼠中， 2 天胚胎的晶状体窝细胞中合成，在14 天胚胎中，所有晶状体细胞表达晶状体蛋白。 胎的早期晶状体泡后部合成，例如预定纤维细胞中，在晶状体形态发生的后期， 121。大鼠晶状体蛋白合成的时间顺序与小鼠的类似。在 ， 无尾两栖类晶状体发育及再生过程中 因和 13 体蛋白 122。而在 正常晶状体发育和晶状体再生过程中， 123, 124。在正常鸡胚中， 125，然而在突变体 胚中， 126。大鼠中 其它被研究物种的类似。在小鼠，鸡胚和 晶状体再生过程中， 皮细胞，预定纤维细胞和纤维细胞中表达。虽然 是它在 常和突变的鸡胚中的这些位置有表达 124哺乳类中唯一在晶状体形态发生中表达 体蛋白的是大鼠。在所有的两栖动物中，无论是在正常晶状体发育过程中还是在晶状体从虹膜上皮再生的过程中， 体蛋白的表达限于预定纤维细胞和纤维细胞中 124。 状体蛋白的功能 子伴侣作用 种特性是 1992 年发现的，实验使用了纯化的牛 且与其它小热激蛋白和 赖性的分子伴侣 有这种特性。研究者还测定了 用重组蛋白，实验证实 127蛋白质在晶状体中不周转，为了维持透明度，晶状体蛋白必需在生命过程中保持稳定不变性。 着年龄的增长， 而阻止它们进一步聚集和沉淀，延缓晶状体的浑浊化。 0%，通过与其它晶状体蛋白早期未折叠的中间物结合，它可以阻止它们的聚集和不溶解化 106。 制细胞凋亡和细胞保护作用 131, 132。 经有研究证明，在肌细胞中，它在连接分化过程和细胞凋亡抑制中发挥核心作用 133。通过在应激诱导的细胞中过量表达 究者发现这种蛋白可以延缓 成熟， 参与细胞凋亡的核心酶 134。这些研究在晶状体上皮细胞中也得到证实。被诱导过量表达 催化学物和其它应激条件的抗性增强135, 136。在培养的细胞中， 136。研究证明，即使是在无应激的情况下，敲除了 137。这种作用的一个可能机制是与凋亡前蛋白如 合 138。研究者发现 ， 无尾两栖类晶状体发育及再生过程中 因和 14 亡的机制有显著差异 139。有人提出，在视网膜中， 101。 蛋白酶体相互作用 近年来的研究提出了 个功能与变性蛋白的降 解相关。 0S 蛋白酶体结合并与 C8/C8/ 20S 蛋白酶体的一个亚基，它可以影响蛋白酶体复合物的装配，促进结合在 外， 组成成分 互作用，研究证明这种相互作用对细胞周期蛋白 降解是必须的 101, 140。 细胞骨架相互作用 细胞骨架在形态发生过程中和应激条件下发生广泛的重构，因此是保护和修复的重要对象。 间丝和微管 141。在晶状体中， 142。对于晶状体蛋白质 143。在心脏中的 疫共沉淀研究显示 144, 145。在体外，重组 145。这些研究表明， 受射应激的转染细胞中， 135, 136。 （ 1） 与肌动蛋白丝直接相互作用；（ 2）与可溶性的肌动蛋白亚基相互作用。 应激条件下，心肌细胞中过量表达的 体外， 101。 与晶状体上皮细胞生长 A 基因敲除的小鼠晶状体细胞的生长比正常晶状体上皮细胞的生长慢50%，说明 135。进一步的研究表明，在敲除 管细胞骨架的形成受到影响，有丝分裂后期，分离的染色体间的微管 相比野生型细胞减少了 137, 146。并且， A 基因敲除的晶状体上皮细胞的凋亡率也比野生型细胞高。同时测量 记细胞的结果显示，这些细胞是在有丝分裂后期死亡的。在死亡的细胞中，有丝分裂后期和胞质分裂没有完 成，这与微管在分裂后期和胞质分裂期没有整合有关。在正常分裂的晶状体上皮细胞中， 些研兰州大学硕士学位论文 无尾两栖类晶状体发育及再生过程中 因和 15 究表明， 是和 明 147。另外， 而影响细胞生长 148。在小鼠晶状体上皮细胞中同时敲除胞延迟进入 S 期且 S 期延长，并且出现了严重的微管重组异常 149, 150。 验动物简介 洲爪蟾 非洲爪蟾属于两栖纲无尾目负子蟾科，爪蟾属， 学名： 洲爪蟾主要分布在撒哈拉以南非洲东南部的池塘和河流中，为完全水生中，喜好静止水域的环境。白天多潜藏在水底深处，夜晚则会爬到浅滩处。体长可达 12 厘米，雄性比雌性会小一截，后肢具有三对角质脚爪，头部和身体扁平，没有 外耳和舌头，由于没有舌头只能利用前肢搅食水中的脊椎动物。人工饲养的条件下，一般用动物肝脏或植物类的水藻进行喂养。非洲爪蟾是发育生物学的