【毕业学位论文】（Word原稿）口腔颌面部恶性肿瘤N0期舌癌淋巴结清扫治疗与观察的系统评价

前 言 口腔颌面部恶性肿瘤中以癌最为常见，而在口腔癌中，以鳞状细胞癌最为常见，占 80%以上 1，是全球第五大最常见的癌症 2。舌鳞状细胞癌 （ 称舌癌。据统计，在口腔颌面鳞状细胞癌排第一位 3。近年的研究亦表明，舌癌的发生率有上升的趋势，且发病年龄趋于年轻化。舌癌一般恶性程度较高，生长快，浸润性强，波及舌肌，致舌运动受限，影响说话、进食。舌癌晚期波及口底、下颌骨，向后侵及腭舌弓及扁桃体；侵及舌根部或伴继发感染时发生剧烈疼痛。舌癌的发 病是多因素参与、多阶段中形成的，具体的发展机制目前尚未研究清楚，长期的临床观察与研究得出舌癌的发病与物理因素、化学因素、生物因素、神经因素、内分泌因素、遗传因素、营养因素、基因突变等有关 4。对于恶性肿瘤或舌癌的治疗，是一个综合性序列治疗 5，以手术为主联合其他治疗，根据患者的具体情况实施治疗方案。一般来说，手术切除原发病灶，但对于较大的肿瘤，可以先利用放射治疗或化学药物治疗使其缩小，待其缩小再行手术治疗；放射治疗虽可以很好控制原发病灶，保存了器官的功能，但对颈部淋巴结的转移的治疗不理想，可以术前放射提 高切除率，减少复发；手术解决的是局部病灶及手术可涉及范围内的病灶，但对于已有远处转移病例的治疗或在预防复发方面是无能为力的，这时依靠化学药物治疗或生物治疗具有一定的疗效。另外，利用中药治疗配合手术治疗、放射治疗和化学治疗可起到很好的治疗效果，因为中药治疗能提高免疫功能，从而起到提高和巩固疗效的作用 6。 祖国医学博大精深，古老而又年轻，在世界范围内正经历着迅猛的发展。已经证实，有数百种中药材具有抑制肿瘤癌细胞生长的作用，因中药毒副作用小且又能有效增强人体免疫能力等特点，加之近年医学分子生物学、中药药理学的 大发展，中药用于肿瘤方面的研究愈来愈受到世界各国研究者的青睐。在中药用于口腔颌面鳞状细胞癌研究方面，不乏报道，诸如百安、参阳、芪蓝、黄岑素、清瘤亮喉等在体外实验研究、治疗或辅助治疗口腔鳞癌中，均显示出了明显的杀肿瘤作用 7 苏木（ 别名 苏枋、苏方、苏方木、棕木、赤木、红柴、红苏木、落文树 ，中华传统中药材，在唐本草、本草拾遗、本草纲目等著名中医典籍均有收录，在中华人民共和国药典中有收录 14。苏木在我国产于两广地区、云贵地区及台湾 地区，国外产地多见于缅甸、泰国等东南亚地区及南美洲的巴西等国 15。苏木功能主治 活血祛瘀 、 消肿定痛 、 血滞经闭 、 痛经 、 产后瘀阻心腹痛 、 产后血晕 、 痈肿 、 跌 打损伤 、 破伤风 等 。在日常生活中，苏木提取物被广泛用于食品行业用于天然色素剂的添加 ， 在染色行业用于轻纺工业 ， 在临床上和实验室里和伊红一起用于组织切片 色。随着分子生物学、中药药理学等学科的大发展，苏木除传统的药用价值外，其提取物还具有舒张血管、抗氧化、抗惊厥、降低血糖、免疫抑制、对 有一定的抑制等作用及抗肿瘤作用 16苏木提取物 具有抗肿瘤作用的最早报道见于二十世纪七十年代，日本学者利用苏木提取物体外实验研究作用于人白血病 胞，随着苏木提取物的浓度的增加， 胞增殖受到抑制作用增强，初次表明苏木提取物具有抗癌作用 24。此后包括国内学者陆续研究得出苏木提取物对人白血病 胞株、胃癌细胞、人肝癌细胞 植瘤、卵巢癌细胞胞株具有抑制增长的作用，具有抗癌的功效 25但此时的研究都是以苏木提取物为一个整体来研究的，苏木提取物是个混合物，具体有哪些成分，哪些成分具有抗癌作用再次引起众多学者兴 趣。经研究，苏木提取物中成分众多，具体分为五大类：苏木素类、原苏木素类、苏木查耳酮类、苯丙素类和高异黄酮类，而这五大类中又分小类 。 到目前为止，已测得的苏木提取物中成分大概有 60 多种 29国内学者赖镇源在苏木提取物中分离各单一的化合物分别作用人白血病 胞和人脑胶质瘤胞的实验中得出苏木中氧化苏木素、 336。 图 1 巴西苏木素结构式 分子式 莉莉等分析苏木抗癌的有效成分，并利用这些有效成分对人膀胱癌 苏木素类中的主要成份，对人膀胱癌 胞具有显著的抑制作用；抑制移植裸鼠体内瘤体的生长，证明了巴西苏木素能诱导膀胱癌细胞发生凋亡 37。通过对 数据库的搜索，尚未见苏木、苏木提取物及苏木提取物后的有效抗癌成分在口腔癌方面的研究，巴西苏木素用于口腔癌方面的研究亦未见报道，鉴于此，本课题将巴西苏木素用于口腔鳞状细胞癌的研究，为临床治疗提供一定的理论基础。 平阳霉素（ 称 是我国自 行研发生产的一种与博莱霉素相近的抗生素， 博莱霉素为复合药，主要成份为 单一组分 以又称平阳霉素为博莱霉素 一种抗生素类抗肿瘤药物，是博莱霉素类抗肿瘤药物的一个品种 38。 平阳霉素为细胞周期非特异抗肿瘤药物，具有抗肿瘤活性强、抗肿瘤谱广等特点。其抗肿瘤的 作用机制亦与 博莱霉素 相似，主要抑制 胸腺嘧啶核 掺入 合 后 ，破坏 板，阻止 制 ,从而促使肿瘤细胞 变性、 发生 坏死 ,具有细胞毒性；除此之外，近几年相关学者经研究证实平阳霉素杀肿瘤细胞的机制还包括诱导细胞凋亡 39。 平阳霉素口服无效，需在静脉注射、静脉点滴、肌肉注射或瘤腔注射，静脉注射后 30 分钟血液中药物浓度达到最高峰，其后迅速下降，广泛地分布在肝、脾、肾、皮肤等组织中，在组织中经酰胺酶水解，经肾脏排泄，成人半衰期 为 时；在化疗时成人每次剂量8周给药 2，一个疗程的总剂量为 240研究表明，对 大肠癌细胞 、 裸鼠移植的人肝癌和胃癌 和 裸鼠移植的食管癌和鼻咽癌，平阳霉素有很好的抗瘤体生长作用 40从 1978 年被应用于临床以来，平阳霉素在大量的临床应用研究中取得了很好的效果，临床回顾性研 究分析表明，平阳霉素抗癌谱广，对 乳腺癌 、皮肤癌 ，肝癌 、 食道癌 、 宫颈 癌、阴茎癌、外阴癌 、 坏死肉芽肿 、 恶性淋巴肉瘤 及头颈部各部位鳞状上皮癌等有效，是一种目前在临床上普遍使用的抗肿瘤药物 ,此外在对翼状胬肉、尖锐湿疣的治疗也有较好的治疗效果 43平阳霉素在口腔临床应用或是口腔实验室中应用均很广泛，最常见的就是平阳霉素治疗颌面部血管瘤，将稀释的平阳霉素注射进瘤腔，破坏血管内皮细胞的生长，使血管瘤退化，在国内的研究中得到研究者们的肯定，此外还见报道用于治疗舌淋巴管瘤和舌下腺囊肿。在治疗口腔鳞状癌方面，平阳霉素 是很常见一种化疗药，在口腔的术前化疗及术后化疗中起到了一定的作用。平阳霉素局部或全身用药后，其不良反应也是不可忽视的，可引起肺炎或肺纤维化、高热、皮肤反应 （皮疹 、 皮炎、色素沉着、角化增厚） 、胃肠道反应、肢体麻木、多发、口腔炎、过敏等反应，近几年有报道使用平阳霉素可引起严重的过敏性休克，值得临床医生警惕 47。平阳霉素的实验室的研究多用于新药的对比测试，鉴于此，本研究亦使用平阳霉素做实验研究的对照组。 在药物作用细胞的抑制增长实验中， 色法 能检测出药物对细胞毒性和药物作用后对细胞杀伤力的变化，这种方法 的 原理是活细胞中线粒体琥珀酸脱氢酶与 用后形成蓝紫色结晶后被二甲基亚砜溶解，在酶联免疫检测仪下特定的波长下测定光吸收值，间接反映药物作用后活细胞的数量，从而能间接反映药物对细胞的杀伤力。目前 色法是一种筛选抗肿瘤药物最佳作用浓度、作用时间和相关毒理实验的常用的检测手段，具有操作简单、经济适用等特点。流式细胞术（ 以流式细胞仪为工具，检测药物作用细胞后细胞的大小和内部的状态等一般理化性质，还可通过对细胞体积、 量及特异性抗原基因测定 等分析细胞的凋亡情况，通过不同的染色方法确定检测 细胞 凋亡还是测细胞周期，对测定的细胞凋亡结果和细胞周期分布结果分析后，可间接判断 被 检测细胞的 增殖状态，从而反映 对细胞的增殖抑制作用。 聚合酶链反应 ( 80 年代中期发展起来的体外核酸扩增技术 ， 具有易自动化 、 特异、敏感、快速、重复性好、等突出优点 。 （ 逆转录 将 逆转录（ 灵敏且用途 广泛，用于检测细胞中基因表达水平，细胞中 量和直接克隆特定基因的 列等。 普通 区别是在 应体系中使用荧光染料，在扩增反应中，对荧光信号的实时监测来记录整个 进程，得出记录曲线，从而对起始模板 定量分析。从以上所述出发，本实验运用 测 平阳霉素 、 巴西苏木素分别作用 胞 对细胞 增殖能力的影响；流式细胞术检测 平阳霉素 、 巴西苏木素及两者联合后细胞凋亡率；实时荧光定量 测 凋亡基因 达水平 ，观察平 阳霉素及巴西苏木素体外对 胞增殖及凋亡的作用，为口腔鳞状细胞癌临床用药提供理论依据。 实验部分 一 材料与方法 验对象 人舌癌细胞株（ 上海交通大学第九人民医院建系 ， 兰州大学第一医院分子实验中心冻存。 要仪器和设备 电子天平 上海天平厂（中国上海） 恒温水浴箱 上海医疗器械七厂 （中国上海） 压力蒸汽灭菌器（ 日本 ) 定时恒温磁力搅拌器 武汉格莱莫检测设备有限公司（中国湖北） 电热恒温鼓风干燥箱（ 上海柏欣仪器设备厂 (中国上海 ) 超净工作台 （ 吴江净化设备公司（中国江苏） 细胞培养箱（ 上海智灵医药科技公司（中国上海） 超低温冰箱 （ 702型） 司 (美国 ) 普通光学显微镜 司（日本） 倒置显微镜（尼康 本） 小型离心机（ 海门市其林贝尔仪器制造有限公司（中国江 苏） 台式 低温高速离心机 国） 超纯水设备 美国） 4和 下层冰箱 （ 日本 ) 酶联免疫检测仪 华东电子医疗装备有限公司（中国江苏） 漩涡震荡仪（ 上海沪西分析仪器厂（中国上海） 流式细胞检测仪（ L） 国） 实时 荧光 定量 (80) 国） 冰盒 司 (日本 ) 要试剂及配制 注射用盐酸平阳霉素 8 天津太河制药有限公司（中国天津） 巴西苏木素 10上海铭睿生物科技有限公司 (中国上海 ) 青霉素 华北制药总厂（中国河北） 链霉素 华北制药总厂（中国河北） 小牛血清 杭州四季清公司 （中国杭州） 胰蛋白酶 上海华美公司（中国上海） 养基干粉 国） 二甲基亚砜 (国） 四甲基偶氮唑蓝 （ 国） 染 试剂盒 国） 无水乙醇 天津凯通化学试剂公司（中国天津） 异丙醇 天津凯通化学试剂公司（中国天津） 氯仿 天津凯通化学试剂公司（中国天津） 上海生工生物公司 （中国上海） 引物设计 大连宝生物工程有限 公司 （中国大连） 引物 合成 大连宝生物工程有限 公司 （中国大连） RT 连宝生物工程有限 公司 （中国大连） x 大连宝生物工程有限 公司 （中国大连） 连宝生物工程有限 公司 （中国大连） 中国北京） 阳霉素溶液的的配制：用 5管吸取 4菌注射用水（临床上供溶解头孢曲松钠用），注入密封好的 8平阳霉素的小瓶中（在此过程严格要求无菌），充分溶解，再回吸溶解后的溶液，浓度为 2mg/为母液注入到已经消毒好的青霉素小瓶中，密封封口，置于 20 冰箱中，待用。 西苏木素溶液的的配制：同平阳霉素的配制方法和步骤类似，操作过程要注意无菌，均在无菌超净台中进行，将密封好的浓度为 2mg/母液巴西苏木素置于 20 冰箱中，待用。 养液的配制： 取两袋 粉剂 共 取碳酸氢钠 霉素和链霉素各两支，均倒入 3000量瓶中，加双蒸水定容至 2000置在磁力震荡搅拌器上充分搅拌至充分溶解，调节 ， 在超净工作台中用灭菌好的过滤器过滤后封装于无菌的 250格的玻璃瓶中，置于4 冰箱中，待用。 小牛血清的灭活：从 20 冰箱 中取出小牛血清，放在常温下任其解冻，再在恒温水浴箱中 56水浴半个小时，封装在容积大约 10右的小瓶中，密封好后置于 4冰箱中，待用。此过程要求在超净工作台中无菌操作。 冲溶液的配制：用电子天平称取氯化钠（ 化钾（ 酸氢二钠（ 酸二氢钾（ 接倒入容量瓶中 ，加入双蒸水定容至 1000置在磁力震荡搅拌器上充分搅拌至充分溶解，即配制成 冲溶液。 蛋白酶溶液的配制 :用电子天平称取 蛋白酶粉末，量筒量取事先配制好的 液 100室温下充分溶解，用 0右小瓶中，置于置于 4 冰箱中，待用。此过程亦要求无菌操作。 液的配制：用电子天平称取 末 (最好避光操作 )，量筒量取事先配制好的 液 100起倒入容量瓶中，容量瓶外套一个黑色塑料袋避光， 放置磁力震荡搅拌器上充分搅拌至充分溶解后，转移至超净工作台，关掉灯管光，在用 P 管中，置于 4 冰箱中可保存两周，置于 中可长期保存。 冷乙醇溶液的配制：用量筒量取无水乙醇 70后逐渐加入双蒸水至 100可得冷乙醇，浓度为 70%的冷乙醇，倒入大玻璃瓶中，置于 4 冰箱中保存。 的配制 :用量筒量取 1000蒸水，倒入玻璃瓶中，往玻璃瓶中加入 1匀，避光后使用。 理水的配制：量取 1000 蒸水与 1入玻璃瓶中混合均匀后，置于 121 的压力蒸汽灭菌器的 30样去除残留的 得到 理水。 验方法 胞的复苏、培养与冻存： 备好细胞培养的培养瓶等试验器材，在紫外灯下消毒 30液氮中取出冷冻好的 胞，立即放在恒温水浴箱中37 的水温条件下水浴，细胞冻存液完全溶解后，在超净工作台中将冻存液转移 至离心管中，在离心管中加入 10养液。然后对离心管进行离心（ 1000r/分钟 ，离心完毕，倒掉离心管中的上清，用 5头吸取 9养液和 1小牛血清，反复轻轻吹打离心管底部，使离心后的细胞重新混匀，吸取混匀后的细胞混合液到 75消毒好的玻璃培养瓶中，松松地旋上瓶盖，将其平放在恒温培养箱中，恒温培养箱应保持在 37 和 5 恒定条件。隔日应在倒置显微镜下观察细胞，观察细胞是否已经贴壁生长，及时更换培养液，一般在培养传代两三代，待细胞贴壁生长稳定后可用于实验。 胞经传代培养后，生长旺盛，在倒置显微镜下观察，可见细胞铺满大部分培养瓶底， 这时从培养箱中取出，倒出培养瓶中液体，加入 蛋白酶进行消化，在倒置显微镜下观察细胞间隙，当细胞间隙变大，加入 1止胰蛋白酶过度消化细胞，再加入 9养液，用 5轻轻地吹打培养瓶底，如此反复数次，留取 1胞液，加入血清和培养液继续传代培养。剩下的 9胞液收取至准备好的离心管内，放在离心机中离心，弃去离心后的上清，加入备好的细胞冻存液，再次轻轻地吹打，使离心后的细胞重新混匀，分装到无菌的细胞冻存管中，用胶布密封好冻存管的盖子，将其放在 4 冰箱 一小时，再移至 冰箱两小时后，用一层厚厚的棉卷裹好冻存管，放置于 冰箱中过夜或者不超过三天，标记好细胞的名称、冻存日期及操作人员后，放入液氮罐中，备用。 检测巴西苏木素、平阳霉素对 胞增长抑制作用 : 阳霉素的母溶液，均为 2mg/照实验设计的需要，将巴西苏木素配成一定梯度溶液组，即 50ug/100ug/50ug/200ug/阳霉素配成一定梯度溶液组，即 1ug/10ug/00ug/ 胞，调节细胞溶液浓度，以 4105个 /密度接种于 96 孔板中。 6 孔板中中间竖行设计空白对照组 ,此组不加药，空白组两侧从低到高分别加入一定梯度巴西苏木素溶液组，即 50ug/100ug/150ug/00ug/一定梯度平阳霉素溶液组，即 1ug/10ug/100ug/组设置 5 个复孔，总体系 200 4h、 48h、 72h。 E、在相应的时间内，在 96 孔板中每孔加入事先配制好的 液 10光操作），再放入孵箱中继续培养 4h。 6 孔板倾斜放置，小心吸取溶液，完毕各孔均加入 150甲基亚砜 ，放在震荡器上震荡 10 于酶联免疫检测仪中，以 570长检测各孔的光吸度值。 5 孔平均值，按照公式，抑制率)=(对照组数值 ) 100%，绘制出药物浓度与生长率关系曲线，依据 选出确定巴西苏木素与平阳霉素的最佳作用药物浓度。各组实验均需重复三次 。 式细胞仪检测药物作用后细胞凋亡率： 检测药物浓度后，利用检测计算后的结果，在流式细胞术中设计实验组，及空白对照组（未加入药物，只加等体积培养液）、巴西苏木素组(150ug/平阳霉素组 (10ug/巴西苏木素与平阳霉素联合组 (150ug/10ug/积各一半 )。 2h，之后胰蛋白酶消化细胞，将四组细胞收集于离心管中，放在离心机中以 1000r/4 环境中离心 5 分钟，倒掉上清，用涤至清亮为止，但不宜清洗次数过多，以免 破坏正常细胞，一般清洗两次即可，最后倒掉上清。 若不能检测，可向离心管中加入70冷乙醇 1行固定，放置 4 冰箱过夜。 染试剂盒染色，在细胞悬浮液中加入 5轻混匀后于 2避光条件下孵育 15 分钟，再加入 10轻轻混匀于 2光条件下孵育 5 分钟。 式细胞仪激发波长采用 488测收集的波长为 630 时荧光定量 检测细胞中 将所有使用的实验器具严格刷净消毒，除去污染的 ，玻璃器具置于 180 下干烤一个小时，塑料器具用 处理，然后再在 120中高压半小时，除去残留的 基因库中查找目的基因 内参基因 （ 基因序列，采用专业 上海生物工程公司进行合成。 因引物： 正义链： 5反义链： 5因引物： 正义链： 5反义链： 5 因引物： 正义链： 5反义链： 5C. 设计实验组，及空白对照组（未加入药物，只加等体积培养液）、巴西苏木素组 (150ug/平阳霉素组 (10ug/巴西苏木素与平阳霉素联合组(150ug/ 10ug/积各一半 )，均作用 72h。 作过程中应采取严格的措施，防止污染提取物作用 72h 小时后，向各实验组的瓶中各加入 00l，用 移液枪反复吹打，混匀，应无明显沉淀，然后放在室温下静置 5此时的细胞裂解液移至 中，再向各组 中加入 160l 氯仿，盖紧盖子，用手捏紧，防止盖子弹开，使劲摇晃震荡 15s，至 中溶液未见明显分层，放在室温中放置 5各组 放置离心机中 4 以 12000g 的条件离心 15 分钟，可见管内液体从上至下分为三层，即无色上清层、白色蛋白质层、红色有机层。将无色上清层小心吸取并转移至新的 中。在各组新的 中加入与中上清液等体积的异丙醇，盖紧 盖子，进行上下颠倒使其充分混匀，放在 室温中静置 10 分钟，静置之后再次将各组 放置离心机中 4 以 120000 分钟，离心之后取出各组 ， 的底部可见有沉淀物，吸掉沉淀物上层的上清液，在各组 中加入 75%的乙醇 1紧 盖子，进行上下颠倒，接着将各组 放置离心机中 4 以 12000g 的条件离心 5 分钟，取出后吸掉上层的乙醇，不能碰到沉淀部分，置于室温中进行干燥（充分挥发乙醇） 10，再向各组 中加入 20 l，轻轻吹打沉淀使其溶解充分，此时可将这时的 中 取物放在 冰箱中进行长期保存。 1 试剂盒组分 试剂盒组成 使用总体积 (25 次 ) 5l 50l 10 M） 60l 10 M） 60l ml 0 l 反应体系： 表 2 总体系为 20l， 需在低温下操作， 反应组分 如下 ： 组成成分 使用体积 l 2l 10 M） 2l 1l l 模板 l 按照比例在冰上将总 释成实验要求的模板量，根据反应系的要求配置溶液，充分混匀后放在震荡器上震荡，再进行离心，放在冰板上，再加入已经稀释好的模版 匀，震荡，再次进行离心，放在 器中，在 37 恒温条件下 孵育 60 分钟，得到 表 3 反应体系： 试剂组分 使用体积 终浓度 x （ 2） 10l 1 . 2M*1 板 2l *2 总体系 20l 增程序： 表 4 在本实验中 增 使用了 3步法 ， 反应条件如下： 阶段 温度 /时间 重复 预变性 95 30s 1 95 5s 62 20s 40 溶解曲线分析 95 10 30s 反应结束后，对记录各实验组的扩增曲线和溶解曲线进行数据分析。 计学处理 所 有实验均需要重复三次， 数据整理后，计量资料均以 x s 表示 ,件和 件 对所有数据 进行处理， 用 件绘图，以双侧 p p断统计学意义及显著性水平。各组间数据比较采用两样本的 t 检验及多样本单因素方差分析进行统计学处理。 二 实验结果 测巴西苏木素与平阳霉素作用 胞的生长抑制作用 西苏木素作用 胞 不同浓度的巴西苏木素（ 50ug/100ug/150ug/200ug/在恒定的时间内对 胞的增殖影响不同，浓度越高，抑制作用越强；同种浓度下的巴西苏木素在不同的时间（ 24h、 48h、 72h）对 胞的增殖影响不同，时间越长，抑制作用越强，浓度为 50ug/作用 24h 无明显影响（ p随时间延长和浓度增高，抑制率增高。随时间延长和浓度增高，抑制率增高。根据增殖抑制率可算出 72 小时 146ug/近 150ug/作为本实验 巴西苏木素的最佳作用浓度。各时间段各浓度下增殖抑制率如表 5，抑制率曲线如图 2 表 5 各浓度巴西苏木素各时间点细胞增殖抑制率（ %）（ X S ）（ n=3） 组别 24 小时 48 小时 72 小时 对照组 0ug/100ug/ 150ug/ 200ug/ *与对照组相比， P *与对照组相比， P 图 2 各浓度 时间点细胞增殖抑制率曲线图 阳霉素作用 胞 不同浓度的平阳霉素（ 1ug/10ug/100ug/在恒定的时间内对 胞的增殖影响不同，浓度越高，抑制作用越强；同种浓度下的平阳霉素在 不同的时间（ 24h、 48h、 72h）对 胞的增殖影响不同，时间越长，抑制作用越强，浓度为 作用 24h 无明显影响（ p 随时间延长和浓度增高，抑制率增高。根据增殖抑制率 72 小时 16ug/近 10ug/作为本实验平阳霉素的最佳作用浓度。各时间段各浓度下增殖抑制率如表，抑制率曲线如图 表 6 各浓度平阳霉素各时间点细胞增殖抑制率（ %）（ X S ）（ n=3） 组别 24 小时 48 小时 72 小时 对照组 1ug/ 10ug/ 100ug/ *与对照组相比， P *与对照组相比， P 图 3 各浓度 时间点细胞增殖抑制率曲线图 式细胞术检测的细胞凋亡 流式细胞术结果显示，作用 72h 后，与空白组（ A）相比，巴西苏木素组 (B)、平阳霉素组 (C)以及联合组 (D)的细胞凋亡率都显著提高 （ p，且显示联合组的细胞凋亡率明显高于其它两组，其细胞凋亡如表 7， 如图 4、 5、 6、 7。 表 7 各组别的细胞凋亡率 组别 细胞凋亡率（ %） （ x s ） 空白组（ A） 西苏木素组 (B) 平阳霉素组 (C) 联合组 (D) 注： 表示与空白组比较：表示 p显著性差异。 表示 D 与 B、 示 p显著性差异。 图 4 图 5 图 6 图 7 测结果 测 因的溶解曲线和扩增曲线（见图 8、 10）， 因的扩增曲线和溶解曲线（见图 9、 11），均显示溶解曲线为单峰，无明显杂峰，显示引物特 异性良好，扩增效率高 图 8 因的溶解曲线 图 9 因的溶解曲线 图 10 因的扩增曲线 图 11 因的扩增曲线 达量的检测结果 果显示， A、 B、 C、 D 组的 A、 B、 C、 D 组的 巴西苏木素组单独用药、平阳霉素组单独用药，巴西苏木素与平阳霉素联合组用药与空白组相比，胞的 对表达量明显升高（ p 72 小时内巴西苏木素联合平阳霉素组细胞的 达水平明显高于其它几组（ r=（见图 12、 13）。 图 12 各组 相对表达量 图 13 各组 相对表达量 三 讨 论 舌癌是口腔颌面部严重危害人类健康的常见恶性肿瘤 ,其发病率和病死率居口腔颌面部恶性肿瘤之首 ,发展快 ,复发率高 ,愈后差，舌癌的治疗主要以手术治疗为主，其他治疗方法积极配合 的综合性治疗 48。就目前来看，化学治疗在舌癌治疗中整个过程中 能 有效地控制原发灶、防止复发、减少转移机会等 49。近年医学分子生物学、中药药理学的大发展，已经证实有数百种中药有抑制肿 瘤 细胞生长作用。巴西苏木素是从传统中药材苏木中提取的， 已有研究证明其对多种肿瘤具有抑制作用。对于舌癌的化学治疗，方式多采用联合用药 模式，可以有效地延缓患者的 存活期 50 平阳霉素已经广泛地应用于临床舌癌患者的化学 治疗中，在平阳霉素作用胞增殖抑制实验中，随着平阳霉素药物浓度的增强， 对 胞的增殖抑制作用越强；随着作用时间的延长， 胞的增殖抑 制作用亦增强。这说明平阳霉素具有抑制 长的作用，与众多学者 的研究 结果是相一致的 5439。巴西苏木素作用 胞增殖实验中， 其 抑制趋势与平阳霉素作用 同，随着巴西苏木素药物浓度的增强， 胞的增殖抑制作用越强；随着作用时间的延长， 胞的增殖抑制作用越强。不同靶点药物联合应用化疗可以增强化疗药的杀伤作用，从而可以在较低浓度的情况下应用，减少了耐药的产生及药物的毒性，药物联合作用大于相加为协同作用，联合作用小于相加为拮抗作用，随着药物不同 的浓度的匹配，协同或拮抗的作用不同。 指被抑制一半时抑制剂的浓度，可以理解为一定浓度的某种药物诱导肿瘤细胞凋亡 50%，该浓度称为 50%抑制浓度，即凋亡细胞与全部细胞数之比等于 50%时所对应的浓度， 可以用来衡量药物诱导凋亡的能力，即诱导能力越强，该数值越低， 在 验中，巴西苏木素 72 小时 146ug/近 150ug/为本次实验最佳作用浓度 , 平阳霉素 72 小时 16ug/近 10ug/为本次实验最佳作用浓度，与前人作出的实验结果是相符合的。本实验 在接下来的实验中利用 验中得出的巴西苏木素和平阳霉素得出的时的药物浓度，联合应用，分组后测凋亡率与相关凋亡基因的表达。 细胞凋亡 (又称为程序性死亡，是机体生长、分化、发育和病理过程中由基因编码调控的细胞主动消亡过程。在细胞凋亡的早期，磷脂酰丝氨酸（ 从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中 一种分量为 3536 赖性磷脂结合蛋白，能与亲和力特异性结合 56将 行荧光素（ 标记了的 为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。碘化丙啶 (I)是一种核酸染料，它不能透过 完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞， 够透过细胞膜而使细胞核红染。因此将 配使用，就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来 58。本实验中利用流式细胞术测得结果显示，与空白对照组（ A）相比，巴西苏木素组（ B）、平阳霉素组（ C）、联合组（ D）细胞凋亡 率显著提高，具有显著性差异（ p而 D 组细胞凋亡率又明显高于 B 组合 C 组，具有显著性差异（ p B 组和 C 组之间细胞凋亡率差异不明显（ p 提示巴西苏木与平阳霉素一样，具有促进 胞凋亡的作用，联合用药后，这种促进细胞凋亡的作用增强，优于单独用药的作用，巴西苏木素诱导 亡的作用有望成为目前寻找治疗舌癌新药的热点，而巴西苏木素与平阳霉素的联合应用于治疗舌癌的研究也是很有必要。至于药物作用哪一周期，本实验未给予测定明确的作用周期，说明该实验还有扩展的空间，可设 置巴西苏木素影响胞的细胞周期的相关实验。 近年来，天冬氨酸特异的半胱氨酸蛋白酶（ 族是细胞凋亡研究的热点， 认为是细胞凋亡的中心环节和执行者。细胞凋亡从内外多因子复杂的相互作用诱导产生凋亡信号，传递至 使其活化开始，以蛋白底物裂解、细胞解体为结局，从而使细胞凋亡得以完成，而 细胞凋亡的信号途径中，处于细胞凋亡的下游，是凋亡的主要效应分子 59 4、 5、 11、 12、 13、 14作为细胞因子处理组，参与炎症反应和参与前炎性介质的成熟； 8、9、 10 作为凋亡起始组，激活 白酶截断或降解凋亡底物； 、 7 作为凋亡效应组参与细胞的凋亡激活 识别切割底物 61。 引起细胞的凋亡途径有两条：一是死亡受体途径，死亡受体主要包括 化生长因子受体（ 肿瘤坏死因子受体（ 族，在凋亡又到信号的作用下，死亡受体 与配体结合，激活上游的 要是而激活下游的效应 是线粒体途径，在细胞内外各种死亡信号的诱导下，线粒体释放细胞色素 C,细胞色素 C 与凋亡蛋白激酶激活因子（ 合，激活 而诱导激活下游的 2。另外其它相关调控基因密切相关，研究表 裂解 白，在体外从过表达 细胞中发现 体诱导细胞凋亡时， 在白环状区域的 裂解 白。被死亡受体（ ）激活的 以切割 族的 裸露的 C 末端可结合在线粒体上导致释放细胞色素 C， 割放大 胞凋亡信号，修剪后的 凋亡信号传递至线粒体，从而释放细胞色素 C63。 在放射损伤小鼠胸腺细胞时发现 参与 导的凋亡信号传导， 赖 活化 64。在 导的细胞凋亡的实验中发现 入活化状态后，能部分抑制 导的 细胞凋亡，说明 白酶家族，尤其是与了 导的细胞凋亡途径 65。这在一定程度上表明， 各种途径存在着一定的联系。 全身肿瘤相关的研究中，陆续报道在相关的癌组织中有表达， 利用 测肝细胞癌组织，发现癌组织及癌旁组织中均有 表达，用免疫组织化学检测肝癌组织时得出，所有的癌组织与癌旁组织中均有 表达 66。国内学者在对舌癌的研究中发现，舌癌组织与癌旁组织中均有有 表达，免疫组织化学测得 表达，并得出恶性度较低的高分化舌鳞癌组织中 表达较高，提示促进异常或癌变的细胞发生凋亡，并指出舌癌患者的 期越晚， 表达越低，表明 族蛋白在舌癌的发生、发展与预后中起到 了相当重要的作用，具有促进舌癌细胞的