【毕业学位论文】（Word原稿）β-甘露聚糖酶高产菌株筛选及酶的纯化与性质研究农产品加工微生物学硕士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 硕士学位论文 I 摘 要 对 本项目组 现有菌种资源进行提纯复壮，采用透明圈法和发酵液 实效 酶活力比较法， 筛选出高产 欧文氏杆菌变异 菌株 采用单因子和多因子相结合的统计方法，获得该菌株最佳生长培养基配方 ： 萄糖、 芋精粉、 肉膏、 母膏和 白胨；适宜 发酵培养基配方： 芋精粉、 肉膏、 母膏、 白胨和 采用 对该菌株 果表明：适宜条件下培养 9h 出现产酶高峰，发酵液粗酶活力达 3050U/应 为 适 反应 温度为 65 ，最适底物为 2mg/芋胶，缓冲液为 柠檬酸 磷酸氢二钠。 采用超滤和凝胶柱层析对 泌的 果表明： 超滤分离合适的膜包孔径为 10 50浓缩倍数可达 活力总回收率为 蛋白质纯化倍数为 10； 胶柱层析从超滤浓缩液中分离出 13 个蛋白质峰，其中仅 1 个具有酶活力； 泳检测出单一优势带。由此说明，采用膜分离技术加层析方法这样一个简单流程即可获得单质 对纯化的 果表明： 量为 定 为 稳定温度范围在 70 以下； 1 的 、 、 、 同浓度的 槐豆胶为底物时， m 和 别为 2000以魔芋胶为底物时， 别为 关键词： 欧文氏杆菌， 透明圈，酶学性质，分离纯化 y to of in in of in of By it is 050U/it h in is pH 5 , mg/ml By as 0 50, of 0. 13 of is be by a to By as 8.2 pH is 0 . is by is m m ml 000 is m m ml 录 第一章 绪论 . . 1 究的目的和意义 . 1 露聚糖 . 1 . 1 . 2 . 2 . 3 . 3 内外有关 . 4 . 4 . 4 . 4 . 5 . 5 . 7 . 7 定及测定 . 8 第二章 研究内容 . . 9 验方法和材料 . 9 株 . 9 要仪器 . 9 要化学试剂 . 10 要溶液 . 10 养基 . 12 验方法 . 12 种培养流程 . 12 长培养基优化 . 12 酵培养基优化 . 13 酶液制备 . 13 萄糖标准曲线制作 . 13 露糖标准曲线制作 . 14 . 14 白质标准曲线制作 . 15 . 16 析 . 16 . 17 . 17 验结果与分析 . 18 甘露聚糖酶高产菌株筛选 . 18 养基优化 . 19 长培养基优化 . 19 酵培养基优化 . 19 . 21 活力测定体系优化 . 21 物浓度对酶促反应的影响 . 21 . 22 度对酶促反应的影响 . 22 . 23 白酶抑制剂的选择 . 23 活力及蛋白质含量测定法检验超滤效果 . 23 泳法检验超滤效果 . 24 胶层析分离蛋白质 . 25 . 27 . 27 . 27 . 27 属离子对 . 28 m 和 . 28 第三章 讨论 . . 30 酶的生产效率评价 . 30 滤条件的选择 . 30 . 30 第 四 章 结论 . . 32 参考文献 . . 33 致谢 . . .者简历 . V 英文缩略表 (英文缩写 英文全称 中文名称 硫酸铵 烯酰胺 析纯试剂 亚甲基双丙烯酰胺 文氏杆菌系列 补 米 硫苏糖醇 ,5二胺四乙酸钠盐 g of 力加速度的倍数 g h 时 际酶活力单位 道尔顿 氏常 数 芋葡 甘 聚糖 克 升 对迁移率 r 对分子量 露聚糖酶基因 豆胶 密度 丙烯酰胺凝胶电泳 甲基磺酰氟 分钟转速 对离心力 s S 物 S of 物浓度 二烷基磺酸钠 ,N,N,N羟甲基氨基甲烷 U 活力单位 V 积 Vm of 大反应速率 W 量 摩尔 l 升 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 1 第一章 绪 论 究的目的和意义 露聚糖 甘露聚糖（ 一类以 4线状多糖。如果主链的某些残基被葡萄糖取代，或半乳糖通过 6称之为异甘露聚糖，主要有半乳甘露聚糖 (葡萄甘露聚糖 (半乳葡萄甘露聚糖(龙健儿， 1998）。 甘露聚糖广泛存在于植物中，其中魔芋、芦荟、马铃薯（马冰洁等， 2006）、番茄（ 2000）、椰子壳 （ 黄广明等， 2001） 、咖啡、长豆角、皂荚豆、槐豆角种子等甘露聚糖含量较高。 不同植物的甘露糖种类及含量有很大差异。如：皂荚豆的内胚乳中含有 半乳甘露聚糖 ， 主链是以 -(1， 4)链是以 -(1， 6)乳糖与甘露糖配比为 1:蒋建新等， 2003） ；田菁胶的甘露聚糖分子主链是 苷键连接的甘露糖，并含有 6糖苷键连接的半乳糖侧链，甘露糖与半乳糖之比为 2:1；瓜尔胶中以聚甘露糖为分子主链， 4苷键连接，甘露糖与半乳糖单元之摩尔比为 2:1；香豆胶主链是 1， 4相连的 露糖，支链为 1， 6相连的 乳糖和甘露糖的比值为 1:敏等， 2003；蒋建新等， 2005）；魔芋胶由 :2比例，通过 3苷键结合而成（王成军等， 2006）。同种植物中的甘露聚糖结构残基也不一致，库拉索芦荟中含有两种酸性多糖 糖 摩尔比为 1:糖 吉昌等， 2003）。 异甘露聚糖依据其结构，基本可分成两类：一类为半乳甘露聚糖，其主链为同质 4链为 6：槐豆胶、瓜儿豆胶、田菁胶等）；另一类为葡萄甘露聚糖，其主链为 4量 4链为 6：魔芋胶）。 甘露聚糖是一类结构比较稳定，普通方法难以去除的物质。传统工业中，采用强酸、强碱、高温、高压等极端条件才能去除。这不仅易造成环境污染，还会增加生产成本。随着生物技术的飞速发展，这个过程可以由一系列酶来完成。降解甘露聚糖主要依靠 是一类能够水解含有 4露多糖，生成甘露二糖、三糖等小分子物质的水解酶。但要彻底降解甘露聚糖，还需要甘露糖苷酶（ 半乳糖苷酶 （ 、葡萄糖苷酶 （ 、乙酰甘露聚糖脂酶 （ 等支链酶的协同作用（张运雄， 2006）。 目前甘露聚糖酶及其水解产物已被广泛应用于食品、医药 、饲料、造纸、印染、纺织、石油开采及生物研究技术等领域。例如 :作为工具酶对天然多糖的糖链结构进行分析，因为复杂糖类或中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 2 糖蛋白的糖链中常有 用 测定水解产物中寡糖类物质的种类和比例，从而可推知其多糖结构；在造纸工业中，用酶法代替碱法除去纸浆中的半纤维素，以起到脱色和漂白的作用；在纺织工业中用作天然纤维原料中半纤维素等胶质的降解，以取代常规的化学法脱胶工艺，并能有效地去除纺织印染产品上粘附的多余染料，可减少对环境的污染；在保健食品和医药方面，利用 水解含甘露聚糖来源丰富的植物（如角豆胶、瓜儿豆胶、魔芋粉等）生成含有不同单分子（ 2 10 个）组成的甘露低聚糖，具有有效降低人体胆固醇水平、减轻便秘、降低血糖、增加肠内有益菌和减少有害菌的生理功能；在饲料工业中用作饲料酶添加剂，起到消除抗营养营养因子的作用；此外， 优质生物破胶剂，具有效率高、成本低、对地层伤害小等优点（李希明， 2006）。 从上世纪 90年代以来，甘露聚糖酶及其酶法制取低聚糖的研究引起人们极大关注。 甘露聚糖生成单糖、二糖、三糖、四糖等低聚糖。这些低聚糖为功能性糖类，在胃肠中不能被消化，但可以被人体和动物体肠道中有益细菌吸收，由此改善肠道内菌群组成，增进消化系统功能。所以在食品中添加一定量的 降低营养物质在肠道内的蓄积，改变有害菌繁殖的环境，减少肠道内有害微生物，使肠壁变薄，改善营养物质的消化吸收。 甘露低聚糖是一种水溶性膳食纤维，能降低血清胆 固 醇和三脂酰甘油的含量 。 摄 入 甘露低聚糖后不会引起血糖水平的波动，因此可作为高血压、糖尿病和肥胖症患者用甜昧剂。甘露低聚糖是一种防龋齿、低腐蚀性的 功能性甜昧剂，它不能被链球菌发酵生成不溶性葡聚糖，从而使得口腔微生物缺少沉积、产酸和腐蚀的场所（张升晖等， 2005；马俊等， 2006；龙德清等， 2003；李坚， 2005；孙沈鲁等， 2003；向进乐等， 2004）。 甘露聚糖是植物性饲料原料中除纤维素、木聚糖之外，分布最广泛、含量最高的一类半纤维素，而且在一些植物 (如魔芋 、 田菁 、槐豆 等 )中有如淀粉样的大量积累。甘露聚糖也是豆科植物种子和酵母细胞壁的主要成分。这类原料用甘露聚糖酶处理，可以生产高品质的甘露寡糖产品。饲料原料中含有这类原料时，由于畜禽和鱼类的消化酶系中不含甘露聚糖酶，对这类物质的转化利用需要添加外源酶（吕松乔， 2004；丁宏标， 2004）。 玉米 /豆粕型日粮是我国猪鸡的主要日粮，其重要的抗消化粘性多糖是甘露聚糖。大豆多糖溶涨后可吸收自身重量七倍的水，并吸附多种微量元素。因其在单胃动物的消化道内呈凝胶状，使消化道内容物具有较强的粘性，从而影响营养物质的吸收，并导致畜禽不同程度的拉稀，最终影响畜禽的生长与饲料利用率。 豆粕型日粮最有效的饲用酶制剂之一，可降解其含有的抗消化粘性多糖，消除 抗营养因子，提高饲料利用率。 此外， 够改善 畜禽肠道微生物菌群和提高肠道粘膜完整性，提高畜禽的抵抗力。这些 甘露寡糖是饲用抗生素最具竞争力的替代品。它没有抗药性，没有药物残留，是我国畜禽水产品出口，和加入 有良好的应用价值。人们对其的兴趣与日俱增（张晓军等， 2005；乔新君等， 2006；李兴鸣等， 2006）。 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 3 最近，美国科技人员进行试验，测定了添加 大豆日粮产蛋母鸡性能的影响。结果表明， 在日粮中添加 31 42周提高 43 54周提高 55 66周提高 从 66周平均提高 赵国琦等（ 2002）研究了在蛋鸡日粮中添加不同水平的 现添加一定水平的由细菌 以获得高于添加杆菌肽锌产蛋性能及其抗病力。 苎麻原料的主要组成为纤维素，其 它 化学组成还有果胶、半纤维素和木质素，麻纺行 业称为胶质，为了得到苎麻可纺纤维，必须首先脱胶。传统的脱胶工艺都是以烧碱煮炼为核心的化学脱胶，纤维可纺性能劣化，对环境的污染非常严重。近代生物技术的发展，为苎麻脱胶展示了一条全新的道路，即用生物脱胶。生物脱胶的主要方法有：在原麻中加菌或直接添加酶制剂两种。但两种方法归根结底都是生物酶作用于胶质，其中甘露聚糖酶就是关键酶之一。中国农业科学院麻类研究所刘正初研究员等人早在上个世纪 80年代就筛选出高效脱胶菌 对苎麻生物脱胶机理进行研究（张运雄等， 2001）。随后麻类生物脱胶逐渐成为热门话题（刘唤明 等， 2006；刘自镕等， 2001；李德舜等， 2006）。 烟草中有相当数量的植物淀粉类物质和胶质。这些大分子多糖和胶质吸湿性强，不仅影响烟叶的燃烧性，还会产生甲醇，给烟气带来刺激性，污染环境。工业生产中，采用微波处理烟梗，同时添加外源甘露聚糖酶，可以经济有效地控制烟草胶质含量，为烟草质量控制提供有效方法（刘燕等， 2006）。 列菌株的特点 列菌株（包括 中国农业科学院麻类研究 所刘正初等采用基因工程手段，将编号为 株的质粒转化到 个 编号为 株，而获得的一系列欧文氏杆菌变异菌株。它们可以分泌 30多种胞外酶，其中以果胶酶、木聚糖酶，甘露聚糖酶含量最高，对麻类脱胶有着非常显著的效果。该系列菌株能在 8h 内完成苎麻、亚麻、罗布麻、红麻等的脱胶过程，得到松散、柔软，可以制作高档服饰的天然纤维。该系列菌株用于麻类脱胶生产工艺具有高产、优质、高效、节能、低污染等优点，由此表现出来的 “ 广谱性 ” 和 “ 高效性 ” 实属国内外罕见 。 此前，潭秀山 （ 2004） 对 胶酶活性等进行了研究；李宝坤（ 2005）对 不同碳源条件下分泌 且对 运雄（ 2006）研究了 效提取草本纤维的机理，并克隆了甘露聚糖酶基因。但是，至今未见系统比较 列菌株分泌 本研究的目的在于 通过 系统比较 列菌株产 筛选出 高产 而优化其产 究其产 建立相应的究 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 4 内外有关 国内外对 产酶培养基优化 、 酶的分离纯化和 特性研究、基因克隆与重组表达以及甘露寡糖的酶法生产等方面。 1960 年以来国际上开始有关于 要应用于多糖结构分析。 1980 年我国李欣等首次系统研究甘露聚糖的化学组成。 1985 年以后，随着 关研究竞争显著加剧， 有关 基础研究和工业应用进展相当迅速。 些动物如：蓝贝、海洋软体动物短滨螺 、 亮大蜗牛等都能产 某些豆类植物 （ 例如 ： 长角豆 、 瓜儿豆等 ） 发芽的种子 、 魔芋球茎 （ 史益敏等， 1990；杜先锋等， 2000） 、南欧紫荆 （ 陶乐平， 1995） 、番茄 （ 王傲雪， 2006）、 莴苣（ 1997） ，黄桧 （ 2000） 等都发现了 微生 物包括真菌、细菌 、 放线菌等是 已报道的微生物有：细菌中的芽孢杆菌，如嗜碱芽孢杆菌 (杨清香， 1998）、地衣芽孢杆菌 (彭爱铭等， 2004；张峻等， 2000）、 短小芽孢杆菌 ( 1990）及枯草芽孢杆菌 (崔福绵等， 1999），卵形拟杆菌 ( 1987），热纤梭菌 ( 1981） ，纤维单胞菌 ( 1999） ；真菌中的真菌齐整小核菌 ( 1998） ，曲霉如黑曲霉 (李剑芳等， 2006；朱劼， 2005）、米曲霉 （ A. ，木霉中的里氏木霉 (程池等， 2004；王和平等， 2003）、绿色木霉 ( 1978）；放线菌中的诺卡氏菌形放线菌 (吴襟， 2000）等。 育 微生物来源的 本低，来源稳定，提取方便以及比动植物更广的作用 度范围和底物专一性等显著特点，易被理论研究和工业化生产应用。要得到大量 育优良菌株是关键。 杨幼惠等（ 2001）利用刚果红平板筛选法从芽孢杆 菌属中筛选到产 后罗强等（ 2003）利用离子注入和紫外线复合诱变 采用 “系统全而反馈实验优化技术 ”优化了发酵条件。蒙海林等（ 2006）以魔芋、番鬼芋、土壤、海水等从自然界采集到的样品为实验材料，经过摇瓶初筛、复筛，选出一株酶活 力 最高的菌株，再对该菌株进行 过分离、平板水解圈初筛和摇瓶复筛，得到一株优良变异菌，其酶活 力 是出发菌株的 2倍。 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 5 发 酵 条件优化 大量研究资料表明，不同微生物产 表 1但绝大部分微生物的 有在培养基中添加甘露聚糖（如魔芋粉 、 槐豆胶 、瓜儿豆胶 等 )时才进行合成。产酶培养基常用的碳源有角豆胶、魔芋粉、槐豆胶等，氮源有豆饼粉、蛋白陈、酵母膏、谷氨酸钠、麸皮等。不同微生物合成 些嗜碱性细菌要求较高的 延和等， 1991）；一些黑曲霉需要特定金属离子（李剑芳等， 2002）。 表 1分微生物产 糖酶的条件 of 菌 株 碳 源 氮 源 温度 ( ) 培养时间 (h) 参考文献 10 魔芋精粉 魔芋飞粉 7 24 熊郃等， 2004 芋粉 酵母粉 、 2 34 60 陈一平等， 1999 芋粉 酵母膏、 (0 25 杨新建等，2006 Y 34 魔芋粉 麸皮 0 120 江正强等，2006 芋粉 牛肉膏、酵母膏 5 36 崔福绵等，1999 Y 45 魔芋粉 大豆蛋白胨 0 96 江正强等，2005 豆胶 谷氨酸钠 10 32 48 马延和等，2001 豆胶 蛋白胨、牛肉膏 37 36 杨清香等，1998 芋粉 麸皮、 (35 96 李江华等，2002 芋粉 豆饼粉 311 84 李剑芳等，2002 接种量、通气量、搅拌速度等对 据马 延 和等（ 1992）对碱性 6 8 培养基营养物质充足的情况下，酶的合成与菌体生长密切相关，当菌体生长到对数末期时，酶的合成速度开始减慢，酶活性在 36 逐渐降低。溶氧水平直接影响好氧菌的菌体生长和产酶，高溶氧有利于菌体生长，而低溶氧有利于酶的合成。 另外，发酵罐的搅拌速度还直接影响底物的混合效果，从而影响发酵产酶，特别是以植物胶为碳源，培养基较粘稠，底物的混合程度尤为重要。 不同微生物所产 子量、 作用范围、等电点、酶动力学常数、底物专一性等都有一定差异（见表 1 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 6 表 1生物 生物种类 温度的影响 的影响 属离子的影响 mg/ 分子量 参考文献 罗尔阿太菌 最适反应温度 30 ；不超过 50 时酶活稳定 最适 定范围 金 属离子 、 、 能强烈抑制该酶活性；而 对该酶有部分的抑制作用；低浓度的 、 对该酶活无影响 42体蛋白 ) 刘洪灿等，2006 宇佐美曲霉 角豆胶为底物， 667 40 42 单体蛋白 ) 李剑芳等，2006 黑曲霉适温度为 45 ，在50 和 60 恒温水浴中存放 160 ，酶活力无明显变化 最适 角豆胶为底物， 皮雄娥等，2006 地衣芽孢杆菌 适反应温度为 60 ；不超过 40 时酶活稳定 最适 定范围 该酶有一定的激活作用；而 该酶有抑制作用 以魔芋胶和槐豆胶为底物， V 6 文博等，1995 枯草芽孢杆菌 适温 度 70 ，在 50 保温 4 60 ，4 70 的酶活半衰期为 3h 最适 范围内稳定 该酶有强烈的抑制作