【毕业学位论文】(Word原稿)生防菌淡紫拟青霉多糖的分离、纯化及结构分析-生物化学与分子生物学

1 学校编码： 10384 分类号 密级 学号： 厦 门 大 学 硕 士 学 位 论 文 生防菌淡紫拟青霉多糖的分离、纯化及结构分析 of 导教师姓名： 研究员、教授 专 业 名 称：生物化学与分子生物学 论文提交日期：二零零七年九月 论文答辩时间： 学位授予日期： 答辩委员会主席 ： 评 阅 人： 2007 年 9 月 2 厦门大学学位论文原创性声明 兹呈交的学位论文，是本人在导师指导下独立完成的研究成果。本人在论文写作中参考的 其他个人或集体的研究成果，均在文中以明确方式标明。本人依法享有和承担由此论文而产生的权利和责任。 声明人（签名）： 年 月 日 3 目录 中文 摘 要 . 1 英文摘要 . 2 第一章 前言 . 4 类与生命科学研究进展 . 4 糖的分离纯化和结构分析概述 . 5 糖的分离纯化 . 5 糖的结构分析 . 6 糖的结构和活性的关系 . 8 级结构与活性的关系 . 8 子量与活性的关系 . 9 级结构与活性的关系 . 10 糖的结构修饰 . 11 青霉属真菌多糖的研究现状 . 13 拟青霉多糖（ . 13 尼拟青霉多糖 . 13 脚拟青酶多糖（ . 13 紫拟青霉多糖 . 14 紫拟青霉 . 14 题依据和本研究的主要研究内容 . 16 题依据 . 16 要研究内容 . 16 第二章 淡紫拟青霉菌株的分类鉴定及其培养特性 . 17 言 . 17 料与方法 . 17 4 试菌株来源 . 17 试菌株的鉴定 . 17 试菌株培养特性研究 . 19 果与分析 . 19 紫拟青霉 株的 鉴定 . 19 紫拟青霉 株的培养特性 . 22 论 . 29 紫拟青霉的鉴定 . 29 紫拟青霉的培养特性 . 29 第三章 淡紫拟青霉多糖的提取与 分离 纯化 . 31 言 . 31 料与方法 . 32 紫拟青霉胞内外粗多糖的提取 . 32 紫拟青霉胞内外 多糖粗提物的性质鉴定 . 32 紫拟青霉胞内外 粗 多糖的分离与纯化 . 33 果与分析 . 34 紫拟青霉胞内外粗多糖的提取 . 34 紫拟青霉胞内外多糖粗提物的性质鉴定 . 35 紫拟青霉胞内外粗多糖的分离与纯化 . 35 论 . 39 紫拟青霉胞内外粗多糖的提取与性质鉴定 . 39 紫拟青霉胞内外粗多糖的分离 . 39 紫拟青霉胞内外粗多糖的纯化 . 40 第四章 淡紫拟青霉多糖的结构分析 . 41 言 . 41 料与方法 . 42 品分子量的测定 . 42 品单糖组成分析 . 42 5 碘酸氧化及甲酸测定 . 42 解 . 42 外光谱分析 . 43 果红结合实验 . 43 果与分析 . 43 品分子量的测定 . 43 品单糖组成分析 . 44 碘酸氧化及甲酸测定 . 44 解 . 45 外光谱分析 . 45 果红结合实验分析 . 46 论 . 47 第五章 淡紫拟青霉多糖对镰刀菌的抑菌活性 . 48 言 . 48 料与方法 . 48 试菌株来源 . 48 紫拟青霉粗多糖对尖孢镰刀菌菌丝生长的影响 . 48 紫拟青霉粗多糖对尖孢镰刀菌孢子萌发的影响 . 49 紫拟青霉多糖 品对尖孢镰刀菌的抑制作用 . 49 果与分析 . 49 紫拟青霉粗多糖对尖孢镰刀菌生长的影响 . 49 紫拟青霉粗多糖对尖孢镰刀菌孢子萌发的影响 . 49 紫拟青霉多糖 品对尖孢镰刀菌的抑制作用 . 51 论 . 51 第六章 结论和展望 . 53 论 . 53 望 . 54 6 参考文献 . 55 论文研究期间发表的文章 . 62 致谢 . 63 7 .of .of 5 of . of .of . . .of .of . . . . .7 . .of of . of .8 he of . of . of . of . of . of .of . 31 . of of . of . of of . of . of . of . of .of . 41 .9 . . . . . . . . . . . .of to . of . of to . of to . 49 . of to . of to .10 51 . .of . 63 生防菌淡紫拟青霉多糖的分离、纯化及结构分析 1 摘要 筛选到一株对枯萎病病原菌 性物质初步筛选结果表明其胞外粗多糖具有抑菌活性。 本论文对该菌株的胞内、外多糖进行了提取、纯化研究，并对纯化所得的两个单组分多糖 行了结构分析以及抑菌活性测定。 1、 通过形态学和 列分析，鉴定出分离保存的菌株为淡紫拟青霉。对其培养特性进行了研究。 2、 淡紫拟青霉发酵液的胞内、胞外物质经过醇析法加乙醇 3 倍即可得到多糖粗提物。经过测试反应验证，该粗提物为多糖，并具有凝胶多糖的理化特性。进 一步的分离实验中，发现经 脱蛋白 35 次后，可以使淡紫拟青霉粗多糖中的蛋白质含量低于 脱蛋白后的胞内、外粗多糖经凝胶柱层析纯化后各自得到一个组成分 外光谱检测两者已不含蛋白质、核酸等非多糖类物质。纯化后的淡紫拟青霉多糖同样具有凝胶多糖的特性。 3、在对淡紫拟青霉胞内、外多糖 分子结构分析中，证明两者均是以 13 葡萄糖苷键连接的单糖组分单一的无分支结构的多聚葡萄糖；R 凝胶层析求得 品的平均分子量分别 为 果红结合实验结果表明 品在稀碱溶液中（浓度分支度（有无分支度、分支度大小） 单糖组成（均多糖或杂多糖、杂多糖中单糖种类多少）。 主链结构与活性的关系 -（ 1大多数文献报道的活性多糖都是 构型的多聚糖则大多没有生物活性或活性很弱，但是也有部分具有较强生物活性的 H. 3和 T. 4等人报道了一种 -（ 1外汪艳等人 25从稻糠中提取纯化得到了一种具有 -（ 1 -（ 1苷键结构，且具有较显著抑制肿瘤生长作用的米糠多糖（ 。 在单糖的连接位置，具有 13 连接方式的多糖大多具有生物活性，部分 16连接方式的多糖也具有生物活性，而 12 连接、 14 连接等方式的多糖则很少具有活性。 构型不同的葡聚糖其作用不同，一般认为 -（ 13 ） -（ 14 ） -（ 13 ） 茯苓多糖和昆布多糖都有这种结构，但 却无抗肿瘤活性。以下是几种目前正在临床试验和应用的具有生物活性的食药用真菌多糖及其基本结构 26。 表 分食药用真菌多糖 的 结构 源 多糖 结构 菇多糖（ L） -（ 13 ）； -（ 16 ）三股螺旋 芝多糖（ -（ 13 ）； -（ 14 ）； -（ 16 ）蛋白复合物 褶菌多 糖（ -（ 13 ）； -（ 16 ）三股螺旋 树花多糖 -（ 13 ）； -（ 16 ）蛋白复合物 生防菌淡紫拟青霉多糖的分离、纯化及结构分析 9 分支度与活性的关系 多糖分支度与活性的关系并不是一种线性关系，分支度适中的多糖往往具有较高的活性，而分支度过高或过低的多糖其活性都有限。活性很强的裂褶菌多糖和香菇多糖仅在 有分支，分支度为 自担子菌类 分支度为 肉瘤 抑制率是裂褶菌多糖的 94%。另一些活性多糖的分支度分布为 变化较大。 7以及 伊藤和枝 28对几 十种葡聚糖的分支度与其抗肿瘤活性进行了比较，认为分支度（ -（ 13 ） 有更高的活性。具有更高分支度的 （ 聚糖抗肿瘤活性是有限的。具有分支度的薄盖灵芝（ 聚糖（ 仅具有微弱的活性29。表 3 是一些有生物活性的食药用真菌多糖和它们的分支度 30。 表 3 部分食 药用真菌多糖 的 分支度 of 源 多糖 分支度 苓多糖 苓多糖 菇多糖（ L） 树花多糖 褶菌多糖（ 木耳 分子量与活性的关系 多糖的活性在很大程度上取决于其分子量大小。一般来说分子量在100200间的多糖片段有较高的生物活性，而相同来源的分子量在 51 0分子量大于 100裂褶多糖具有较强的抗肿瘤活性，而其低分子量（ 80）下形成的凝胶不可逆 。 表 紫拟青霉 胞外及胞内多糖粗提物的物理性质 of 品 溶解性 外观 成胶性 蒸馏水 1N N 、酮、醚、 内多糖 不溶 不溶 易溶 不溶 微溶 深褐色粉末 较强 胞外多糖 不溶 不溶 易溶 不溶 微溶 褐色粉末 较强 表 紫拟青霉 胞外及胞内多糖粗提物的 化学性质 of 品 蒽酮试剂 剂 剂 酚 碘液 胞内多糖 粗提物 蓝绿色 紫红色 玫瑰红 蓝色 橘红色 不变色 胞外多糖 粗提物 蓝绿色 紫红色 玫瑰红 蓝色 橘红色 不变色 淡紫拟青霉胞内外粗多糖的分离与纯化 淡紫拟青霉胞内外粗多糖的分离 脱蛋白次数对多糖含糖量、含蛋白量及得率的影响见表 着脱蛋白次数的增多，所得到的胞内、外多糖半纯品中的含糖量增加， 含氮量减少。脱蛋白 3 次后，得到的半纯化淡紫拟青霉 胞内、外多糖 半纯品中含糖量的增加幅度和含氮量的减少幅度都趋于平缓，此时胞内、外半纯品多糖 蛋白含 量分别为 而多糖的得率着随着脱蛋白次数的增加持续减少。因此，淡紫拟青霉粗多糖的脱蛋白次数应以 3 次为宜。 生防菌淡紫拟青霉多糖的分离、纯化及结构分析 36 表 脱蛋白次数对淡紫拟青霉多糖分离的影响 of of on 蛋白次数 含糖量（ %） 含氮量（ %） 得率（ %） 胞内多糖 胞外多糖 胞内多糖 胞外多糖 胞内多糖 胞外多糖 1 胶柱层析 淡紫拟青霉胞内外粗多糖经过 层析，分部收集液用酚 到的洗脱曲线见图 图可见，胞内外粗多糖均含有多个不同分子量的组分，但以其中一个分子量较大的组分占绝对的优势地位，分别记为 洗脱峰也较为尖锐对称。因此我们选择对进行这两个组分进行下一步的研究。 00 . 20 . 40 . 60 . 811 . 21 . 41 . 61 . 80 20 40 60 80 100洗脱体积 ( m L )90图 内粗多糖 层析图谱 of 生防菌淡紫拟青霉多糖的分离、纯化及结构分析 37 00 . 511 . 522 . 530 20 40 60 80 100洗脱体积 ( m L )90图 外粗多糖 层析图谱 of R 凝胶柱层析 上一步得到的 分，分别经过 R 柱层析，分部收集液用酚 到的洗脱峰依然为单一的对称峰（如图 收集主峰含糖部位，经透析、醇析、冷冻干燥后得白色的胞内外多糖样品 0 40 60 80 100洗脱体积 (m L)90图 内多糖 品 R 柱层析图谱 of R 生防菌淡紫拟青霉多糖的分离、纯化及结构分析 38 0 40 60 80 100洗脱体积 (m L)90图 外多糖 品 R 柱 层析图谱 of R 品纯度鉴定 品再次经 R 柱层析，实验结果仍显示为单一的对称峰。验证了 为分子量均一的多糖。 紫外吸收光谱的测定 品在 190800行紫外光谱分析，结果如图 示。在 260 280长处均无显著吸收峰，说明样品中 已基本去除蛋白质、多肽、核酸类等杂质物质。 图 内多糖 品 紫外扫描光谱 of 防菌淡紫拟青霉多糖的分离、纯化及结构分析 39 图 外多糖 品 紫外扫描光谱 of 结论 淡紫拟青霉胞内外粗多糖的提取 与性质鉴定 淡紫拟青霉发酵液的胞内、胞外物质经过醇析法加乙醇 3 倍后 ，得到大量的多糖粗提物。经过验证，该粗提物 具有多糖的常见颜色反应。在浓硫酸存在时，加热可以与。 作用，界面处呈现红紫色环 ；与酚 与蒽 酮试剂反应可以生成蓝绿色得复合物 ；多糖粗提物 在水解前与 示蓝色 ； 水解后与 剂呈阳性反应，产生棕红色氧化亚铜沉淀 ； 与碘 、 碘化钾无颜色反应 ；将 多糖 粗提物的水悬 浊液点于滤纸上，用 剂染色呈现玫瑰红色斑点。 粗多糖不溶于水、酸和醇、酮、醚等常见的有机溶剂，能溶于碱液。多粗糖的悬浊液受热或透析时 会形成凝胶状，用玻璃棒不容易搅碎、破坏凝胶状态，凝胶用碱溶解可以恢复溶液状态，但高温（ 80）下形成的凝胶具有不可逆性。 以上 理、化 性质 表明淡紫拟青霉多糖符合 凝胶多糖的特性 ，因此初步推测为其为凝胶多糖 。 淡紫拟青霉胞内外粗多糖的 分离 脱蛋白 35 次后，可以脱去绝大多数蛋白，淡紫拟青霉粗多糖中的蛋白质含量低于 并且可避免多糖的降解。 蛋白后流水逆向透析对去除色素、残留的有机溶剂及其他小分子物质有很好的效果。 生防菌淡紫拟青霉多糖的分离、纯化及结构分析 40 淡紫拟青霉胞内外粗多糖的 纯化 脱蛋白后的多糖样品往往还是不同 分子量多糖的混合物，本实验采用凝胶柱层析操作，使多糖得到较好的分离和纯化结果。纯化后得到淡紫拟青霉胞内、外粗多糖主成分 过紫外光谱检测， 品不含蛋白质、核酸等非多糖类物质。 品为白色粉末，理化性质与粗多糖相近，同样具有凝胶多糖的特性。 生防菌淡紫拟青霉多糖的分离、纯化及结构分析 41 第四章 淡紫拟青霉多糖的结构分析 引言 多糖的结构是其生物活性的基础，认识和了解多糖的结构有助于对其进一步的开发利用。就多糖的一级结构与其生物活性关系而言，多糖的糖组成和糖苷键类 型对其生物活性有一定影响，如细菌活性多糖一般是由葡萄糖构成的，而且葡萄糖主链上的 -（ 1， 3） 是多糖类复合物的研究要比蛋白等的研究困难得多。因为单糖分子比氨基酸分子有更多的功能基团，以单糖为单体聚合起来的寡聚物和多聚物，结合方式更多而分析分离的难度要更大，纯化糖链样品即使得到相对较纯的样品，实际上也不是一种单分子结构，还包含有微不均一性。因而从同一生物材料出发分离纯化而得的多糖，不同的实验室也会有不同的结构。 对于糖复合物的结构方面的测定，主要涉及到复合物分子量的测定、糖链组成的测定、糖链的结构分析以及糖昔键的确定等方面的内容。 目前大多采用化学方法和物理方法结合，即可阐明某一多糖一级结构的大致特征，而用于高级结构分析的方法主要是物理方法，诸如 磁共振、电子衍射等 92。 表 糖 结构测定常用的方法 of of 定项目 常用方法 分子量测定 凝胶层析（ 质谱（ 蒸汽压法 单糖组成和分子比例 薄层层析（ 气相色谱（ 高效液相色谱（ 组成单糖为吡喃型或呋喃型 红外光谱（ 连接次序 选择性酸水解、糖苷酶顺式水解、核磁共振（ -， 糖苷酶水解、核磁共振（ 红外光谱（ 羟基被取代情况 高碘酸氧化、甲基化 谱（ 糖链 单糖与氨基酸组成、稀酸水解、肼解反应 生防菌淡紫拟青霉多糖的分离、纯化及结构分析 42 由于实验条件和时间所限，本章只对淡紫拟青霉胞内外多糖主要组分 行了结构方面的测定。 材料与方法 品分子量的测定 32 采用 R 凝胶层析柱， 脱，流速 24mL/h。取 系列 标准葡聚糖各 10于 5离子水中上柱，每 5集一管。酚 出现最大吸收时的体积为洗脱体积 以 000 测定柱外水体积 0 为横坐标， 纵坐标，绘制 同浓度待测 品于同样条件上柱洗脱，根据 0 值从标准曲线上查算分子量。 品单糖组成分析 93 取多糖溶液 2 管， 100 水解 8h， 和，离心取上清，浓缩后作纸层析。以 葡萄糖、果糖、木糖、甘露糖、鼠李糖、半乳糖标准品为对照，乙酸乙酯：吡啶：水