实验室玻璃器皿、培养基的灭菌技术

玻璃器皿、培养基的灭菌技术,概念,消毒：杀死物体上病原微生物的方法,并不一定 能杀死含芽胞的细菌或非病原微生物。灭菌：杀灭物体上所有微生物的方法。 无菌：不存在活菌的意思。 防腐：防止或抑制体外细菌生长繁殖的方法。,一、消毒与灭菌的方法,物理的方法：加热、过滤、辐射化学的方法：用化学试剂抑制或杀灭微生物。主要破坏细菌代谢机能。如重金属离子，磺胺类药物及抗生素等。,物理方法,干热灭菌又称热空气灭菌，是利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固变性的原理。湿热灭菌法是指用饱和水蒸气、沸水或流通蒸汽进行灭菌的方法，由于蒸汽潜热大，穿透力强，容易使蛋白质变性或凝固，所以该法的灭菌效率比干热灭菌法高。,物理方法,辐射：利用辐射进行灭菌消毒，可以避免高温灭菌或化学药剂消毒的缺点，所以应用越来越广。,物理方法,1）紫外线：波长200300m的紫外线具有杀菌作用。 杀菌机理：干扰DNA的复制与转录。 特点：穿透力不大。距照射物1.2m为宜。 应用范围：空气消毒。例如，手术室、传染病房、细菌实验室不耐热物品的表面消毒。 注意事项：对眼睛和皮肤有刺激作用。,物理方法,2）电离辐射：包括高速电子、X射线和 射线杀菌机理：产生游离基,破坏DNA。 应用范围：一次性医用塑料制品的消毒食品的消毒不破坏其营养成分,物理方法,过滤：采用机械方法，设计一种滤孔比细菌还小的筛子，做成各种过滤器。通过过滤，只让液体培养基从筛子中流下，而把各种微生物菌体留在筛子上面，从而达到除菌的目的。这种灭菌方法适用于一些对热不稳定的体积小的液体培养基的灭菌以及气体的灭菌。它的最大优点是不破坏培养基中各种物质的化学成分。但是比细菌还小的病毒仍然能留在液体培养基内，有时会给实验带来一定的麻烦。,过滤注意事项：1、压力适当； 2、无菌条件下进行； 3、防止渗透现象。,一般化学药剂无法杀死所有的微生物，而只能杀死其中的病原微生物，所以是起消毒剂的作用，而不是灭菌剂。,化学方法,各种消毒剂的种类,各种消毒剂的应用,干热灭菌,适用范围： 用于高温下不损坏、不变质、不蒸发物品的灭菌；用于不耐湿热的器械的灭菌；用于蒸汽或气体不能穿透物品的灭菌，如玻璃、油脂、粉剂（遇水结块）和金属等制品的消毒。,干热灭菌,干热灭菌法又分为烧灼和焚烧、干烤、红外线、微波等几种方法。,干热灭菌,（1）烧灼和焚烧：烧灼是直接用火焰杀死微生物，适用于实验室的金属器械（镊、剪、接种环、接种针等）、玻璃试管口和瓶口等不怕热的器材灭菌。焚烧是彻底的消毒方法，但只限于处理废弃的污染物品，如无用的衣物、纸张、垃圾等。焚烧应在专用的焚烧炉内进行。,干热灭菌,（2）干烤：在干烤箱内进行，加热至160170维持2小时，可杀灭包括芽胞在内的所有微生物。此方法适用于耐高温的玻璃器皿、瓷器、玻质注射器等。,干热灭菌,（3）红外线：是波长为770nm1000m的电磁波，以1m10m波长的热效应最强。亦被认为一种干热灭菌。红外线由红外线灯泡产生,不需要经空气传导，所以加热速度快，但热效应只能在照射到的表面产生，因此不能使一个物体的前后左右均匀加热。红外线的杀菌作用与干热相似，利用红外线烤箱灭菌的所需温度和时间亦同于干烤。多用于医疗器械的灭菌。,干热灭菌,红外线灭菌注意事项：人受红外线照射较长会感觉眼睛疲劳及头疼；长期照射会造成眼内损伤。因此，工作人至少应戴能防红外线伤害的防护镜。,干热灭菌,（4）微波：波长为1mm1000mm的电磁波统称为微波，可穿透玻璃、塑料薄膜与陶瓷等物质，但不能穿透金属表面。微波能使介质内杂乱无章的极性分子在微波场的作用下，按波的频率往返运动，互相冲撞和磨擦而产生热，介质的温度可随之升高，因而在较低的温度下能起到消毒作用。,干热灭菌,一般认为其杀菌机理除热效应以外，还有电磁共振效应，磁场致力效应等的作用。消毒中常用的微波有2450MHZ与915MHZ两种。微波照射多用于食品加工。在医院中可用于检验室用品、非金属器械、无菌病室的食品食具、药杯及其它用品的消毒。,干热灭菌,微波长期照射可引起眼睛的晶状混浊、睾丸损伤和神经功能紊乱等全身性反应，因此必须关好门后再开始操作。,干热灭菌,干热灭菌的注意事项：待灭菌的物品在干热灭菌前应先洗净，防止造成灭菌失败或污物炭化；玻璃器皿灭菌前应洗净并干燥；灭菌时勿与烤箱底部及四壁接触，灭菌后要待温度降到40以下再开箱，以防止爆裂；,物品包装不能过大，不超过10厘米10厘米20厘米，物品不能超过烤箱的高度的2/3，物品间应留有充分的空间（可放入一只手）；油剂、粉剂的厚度不得超过0.6厘米；凡士林布条厚度不得超过1.3厘米。温度高于170时，有机物会炭化，故有机物品灭菌时，温度不可过高。,干热灭菌,电热恒温干燥箱（俗称“烤箱”）的使用1.装料：将带灭菌的物品包扎好放入电热恒温干燥箱。注意物品不能摆得太挤，以免影响热空气流通。用纸包扎的物品不能接触内壁。2.升温：接通电源，打开排气孔，排除箱内湿空气；旋动恒温调节器，让温度逐渐上升。当温度升至100摄氏度，关闭排气孔。,干热灭菌,3.恒温：当温度升到160摄氏度时，利用恒温调节器的自动控制，保持温度1h。灭菌物品用纸包扎或带有棉塞时温度不能超过170摄氏度。4.降温：达到规定的时间后，切断电源，自然降温。5.取料：待箱内温度降到60摄氏度，打开箱门，取出灭菌物品。箱内温度未降到70摄氏度，切勿打开箱门，以免骤然降温导致玻璃器皿破裂。,湿热灭菌,湿热灭菌,适用范围： 用于耐高温、耐高湿的医疗器械和物品的灭菌。,湿热灭菌,湿热灭菌法分为煮沸法、流通蒸汽灭菌法、间隙灭菌法、巴氏消毒法、高压蒸汽灭菌法等几种灭菌方法。,湿热灭菌,（1）煮沸法：煮沸100，5分钟，能杀死一般细菌的繁殖体。许多芽胞需经煮潮56小时才死亡。水中加入2%碳酸钠，可提高其沸点达105。既可促进芽胞的杀灭，又能防止金属器皿生锈。煮沸法可用于饮水和一般器械（刀剪、注射器等）的消毒。,湿热灭菌,（2）流通蒸汽灭菌法：利用100左右的水蒸汽进行消毒，一般采用流通蒸汽灭菌器（其原理相当于我国的蒸笼），加热15到39分钟，可杀死细菌繁殖体。消毒物品的包装不宜过大、过紧，这样以利于蒸汽穿透。凡不耐高温的物质，如糖类、明胶、血清、牛乳及鸡蛋等可用此方法灭菌。,湿热灭菌,（3）间歇灭菌法：又称分段灭菌法。适用于不耐热培养基的灭菌。方法是：将待灭菌的培养基在100下蒸煮30-60min，以杀死其中所有微生物的营养细胞，然后置室温或20-30下保温过夜，诱导残留的芽胞萌发，第二天再以同法蒸煮和保温过夜，如此连续重复3天，即可在较低温度下达到彻底灭菌的效果。例如，培养硫细菌的含硫培养基就是应用间歇灭菌法灭菌，因为其中的元素硫经常规的高压灭菌(12l)后会发生熔化，而在100的温度下则呈结晶状。,间歇灭菌法的注意事项：使用间歇法灭菌时必须在灭菌物里外都达到100后开始计算灭菌时间。间歇法灭菌时应在每次加热后，迅速降温，然后在室温放置24h，再第二次加热。如果降温慢，往往使未杀死的杂菌大量滋长，反面导致灭菌物变质，特别是包装过大时，靠近中心部分更易发生这种情况。,湿热灭菌,（4）巴氏消毒法（Pasteurization）：有些食物会因高温破坏营养成分或影响质量，如牛奶、酱油、啤酒等，所以只能用较低的温度来杀死其中的病原微生物，这样既保持食物的营养和风味，又进行了消毒，保证了食品卫生。该法一般在62C，30分钟既可达到消毒目的。此法为法国微生物学家巴斯德首创，故名为巴氏消毒法。,巴氏消毒法是一种低温消毒法，具体的处理温度和时间各有不同，一般在60-85下处理15-30min。具体的方法可分两类，第一类是较老式的，称为低温维持法，例如在63下保持30min可进行牛奶消毒；另一类是较新式的，称为高温快速法，用于牛奶消毒时只要在85下保持5min即可。但是巴氏消毒法不能杀灭引起Q热的病原体-伯氏考克斯氏体(一种立克次氏体)。,湿热灭菌,（5）高压蒸汽灭菌法：压力蒸汽灭菌是在专门的压力蒸汽灭菌器中进行的，是热力灭菌中使用最普遍、效果最可靠的一种方法。其优点是穿透力强，灭菌效果可靠，能杀灭所有微生物。,湿热灭菌,压力蒸汽灭菌器分类：根据排放冷空气的方式和程度不同，分为下排气压力蒸汽灭菌器和预真空压力蒸汽灭菌器。,干热和湿热两者比较,在同样的温度下，温热的杀菌效果比干热好，其原因有：蛋白质凝固所需的温度与其含水量有关，含水量愈大，发生凝固所需的温度愈低。湿热灭菌的菌体蛋白质吸收水分，因较同一温度的干热空气中易于凝固。,两者比较,温热灭菌过程中蒸气放出大量潜热，加速提高湿度。因而湿热灭菌比干热所要温度低，如在同一温度下，则湿热灭菌所需时间比干热短。湿热的穿透力比干热大，使深部也能达到灭菌温度，故湿热比干热收效好。,高压蒸汽灭菌器的基本构造,1.外锅 或称“套层”，供贮存蒸汽用，连有用电加热的蒸汽发生器，并有水位玻管以标志盛水量。外锅的外侧一般包有石棉或玻璃棉绝缘层以防止散热。如直接使用由锅炉接入的高压蒸汽，则外锅在使用时充满蒸汽，作为内锅保温。 2.内锅 或称灭菌室，是放置灭菌物的空间可配制铁蓖架以分放灭菌物。,3.压力表 内外锅各装一只，老式的压力表上标明三种单位：公斤压力单位(kg/cm2)，英制压力单位(1b/in2)和温度单位()，便于灭菌时参照。现在的压力表用MPa表示。4.温度计 可分为两种，一种是直接插入式的水银温度计，装在密闭的铜管内，焊插在内锅中另一种是感应式仪表温度计，其感应部分安装在内锅的排气管内，仪表安装于锅外顶部便于观察。,5.排气阀 一般外锅、内锅各一个，用于排除空气。新型的灭菌器多在排气阀外装有汽液分离器(或称疏水阀)内有由膨胀盒控制的活塞。利用空气、冷凝水与蒸汽之间的温差控制开关，在灭菌过程中，可不断地自动排出空气和冷凝水。6.安全阀 或称保险阀利用可调弹簧控制活塞，超过额定压力即自动放气减压。通常调在额定压力之下，略高于使用压力。安全阀只供超压时安全报警之用，不可在保温时用作自动减压装置。,7.热源 除直接引入锅炉蒸汽灭菌外，都具有加热装置。近年来的产品以电热为主，即底部装有调控电热管，使用比较方便。有些产品无电热装置，则附有打气煤油炉等。手提式灭菌器也可用煤炭炉作为热源。,第二节 实验内容,一、实验目的,了解湿热灭菌的原理，学习并掌握蒸汽灭菌的操作方法与注意事项。,二、实验原理,高压蒸汽灭菌是微生物学实验、发酵工业生产、以及外科手术器械等方面常用的一种灭菌方法，属于湿热灭菌。一般培养基、玻璃器皿、无菌水、无菌缓冲液、金属用具、接种室的实验服及传染性标本都可采用此法灭菌。,将待灭菌的物体放置在盛有适量水的高压蒸汽灭菌锅内。把锅内的水加热煮沸，并把其中原有的冷空气彻底驱尽后将锅密闭。再继续加热就会使锅内的蒸汽压逐渐上升，从而温度也随之上升到100以上。为达到良好的灭菌效果，一般要求温度应达到121(压力为0.1MPa)，时间维持15-30min。也可采用在较低的温度(115，即0.075MPa)下维持35min的方法。,高压蒸汽灭菌是依据水的沸点随水蒸汽压的增加而上升，加压是为了提高水蒸汽的温度。,高压蒸汽灭菌时常用的灭菌压力、温度与时间,高压蒸汽灭菌器是一个能耐压、同时可以密闭的金属锅，有立式、卧式、手提式三种。热源可以用蒸汽、煤气或电源。灭菌器上装有表示锅内温度和压力的温度计、压力表。灭菌锅还有排气口、安全活塞。如压力超过一定限度，活塞的阀门便自动打开，放出过多的蒸汽。,高压蒸汽灭菌技术关键是在压力上升之前需将锅内冷空气排尽。若锅内未排除的冷空气滞留在锅中，压力表虽指示0.1MPa，但锅内温度实际只有100摄氏度，高压结束会造成灭菌不彻底。,空气排除程度与温度关系,影响灭菌的因素,a.不同的微生物或同种微生物的不同菌龄对高温的敏感性不同。多数微生物的营养体和病毒在5065C，10分钟就会被杀死；但各种孢子、特别是芽孢最能抗热，其中抗热性最强的是嗜热脂肪芽孢杆菌，要在121C，12分钟才被杀死。对同种微生物来讲，幼龄菌比老龄菌对热更敏感；,影响灭菌的因素,b.微生物的数量多少显然会影响灭菌的效果，数量越多，热死时间越长；c.培养基的成分与组成也会影响灭菌效果。一般地讲，蛋白质、糖或脂肪存在，则提高抗热性，pH在7附近，抗热性最强，偏向两极，则抗热能力下降，而不同的盐类可能对灭菌产生不同的影响；固体培养基要比液体培养基灭菌时间长。,灭菌时的过高温度常对培养基造成的主要不良影响如下：（1）出现混浊、沉淀(天然培养基成分加热可以沉淀出大分子多聚合物；培养基中Ca、Mg、Fe、Zn等阳性离子与培养基中的可溶性磷酸盐共热沉淀)。,（2）营养成分破坏或改变（酸度较高时淀粉、蔗糖、乳糖或琼脂灭菌过程易水解；pH7.5、0.1MPa灭菌20min，葡萄糖破坏20%、麦芽糖破坏50%，若培养基中有磷酸盐共存，葡萄糖转变成酮糖类物质，培养液由淡黄色变为红褐色，破坏更为严重）。,（3）pH7.2时培养基中的葡萄糖、蛋白胨、磷酸盐在0.1MPa灭菌15min以上可产生对微生物生长的某种抑制物。（4）高压蒸汽灭菌后培养基pH下降0.1-0.2。,（5）高压蒸汽灭菌过程会增加冷凝水，降低培养基成分浓度。对于前三种不良影响，可采用低压灭菌（如在0.056MPa、30min灭菌葡萄糖溶液），或将培养基几种成分分别灭菌，临用前无菌混合（如磷酸盐与Ca、Mg、Zn、Cu等阳性离子溶液）的方法，特殊情况时可采用间歇灭菌、过滤除菌（如维生素溶液）。工业发酵生产中常采用连续加压灭菌法（135-140 C ，5-15秒）和连续蒸煮法。,三、实验材料,高压灭菌器待灭菌的培养基、无菌水、已包好的培养皿、移液管、玻璃涂抹棒等及待灭菌空试管、锥形瓶等玻璃器皿。,四、实验内容,（一）灭菌操作1.向锅内加水打开灭菌锅盖，向锅内加适量水。水量不足，灭菌锅易蒸干。2.放入待灭菌物品将带灭菌物品放入灭菌桶内，物品不要放得太紧和紧靠锅壁，以免影响蒸汽流通和冷凝水顺壁流入灭菌物品。,3.盖好锅盖将盖上的软管插入灭菌桶的槽内，有利于罐内冷空气自下而上排出，然后加盖，上下螺栓口对齐，采用对角方式均匀旋紧螺栓，使锅密闭。,4.排放锅内冷空气及升温灭菌打开放气阀，加热，自锅内开始产生蒸汽后3min再关紧放气阀（或喷出气体不形成水雾），此时蒸汽已将锅内的冷空气由排气孔排尽，控制热源，维持所需压力和温度，并开始计时，一般培养基控制在0.1MPa灭菌20min；含糖等成分培养基控制在0.056MPa灭菌30min或0.07MPa灭菌20min，然后关闭热源，停止加热，压力随之逐渐降低。,5.灭菌完毕降温及后处理,待压力降至0时，慢慢打开放气阀，开盖，立即取出灭菌物品，但在压力未完全降至0处前，不能打开锅盖，以免培养基沸腾将棉塞冲出；也不可用冷水冲淋灭菌锅迫使温度迅速下降。所灭物品开盖后立即取出，以免凝结在锅盖和容器上的水滴弄湿包装纸或落到被灭菌物品上，增加染菌率。斜面培养基自锅内取出后要趁热摆成斜面，灭菌后的空培养皿、试管、移液管等需烘干或晾干。若连续使用高压锅，每次需补足水分，灭菌完毕，除去锅内剩余水分，保持灭菌锅干燥。,6、注意事项,6.1灭菌前 清洗：将物品彻底清洗干净，物品洗涤后，应干燥并及时包装。包装：包装材料应允许物品内部空气的排出和蒸汽的透入。 物品捆扎不宜过紧，外用化学指示胶带贴封，灭菌包每大包内和难消毒部位的包内放置化学指示物。,装载 ：下排气灭菌器的装载量不得超过柜室内容量的80%；预真空灭菌器的装载量不得超过柜室容积90%。应尽量将同类物品放在一起灭菌，若必须将不同类物品装放在一起，则以最难达到灭菌物品所需的温度和时间为准。物品装放时，上下左右相互间均应间隔一定距离以利蒸汽置换空气。,金属包应平放，盘、碟、碗应处于竖立的位置；纤维织物应使折叠的方向与水平面成垂直状态；玻璃瓶等应开口向下或侧放以利蒸汽进入和空气排出。难于灭菌的大包放在上层，较易灭菌的小包放在下层；金属物品放在下层，织物包放在上层，物品装放不能贴靠门和四壁，以防吸入较