电泳技术的临床应用2011-02

现代电泳技术的临床应用,Sebia,何鹏 临床应用,使用范围和检测原理,电泳技术就是利用在电场的作用下, 由于待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小, 形状等性质的差异, 使带电分子产生不同的迁移速度, 从而对样品进行分离, 鉴定或提纯的技术.在生化检测中, 主要用于分离各类蛋白分子.,蛋白电泳检测的不同步骤,制备胶片,加样,温度启动电源,开始电泳,染色, 脱色,结果检测,发展历程,1809年俄国科学家列伊斯首先发现电泳现象1937年瑞典科学家Tiselius建立了界面电泳技术, 并首次证明了血清是由白蛋白及, , 球蛋白组成的因此获得1948年诺贝尔化学奖.1950年后, 区带电泳从发展到成熟. 1980年以来, 毛细管电泳逐渐受到重视,常用的电泳技术,滤纸电泳醋酸纤维素薄膜电泳凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳 : 琼脂糖凝胶适用于蛋白质和核酸的电泳支持介质, 成本低, 结果易保存.聚丙烯酰胺凝胶电泳 : 最常用的定性分析蛋白质的电泳方法, 特别是用于蛋白质纯度检测和测定蛋白质分子量, 一般用于科研.毛细管电泳 :经典电泳技术和现代微柱分离相结合的产物,电泳技术的医学应用,蛋白质电泳分析是实验室必备的检测手段, 可全面精确, 描绘出患者蛋白质的全貌. 对疾病的早期诊断, 疗效观察及预后判断具有非常重要的临床价值.根据使用的染料或者是底物的不同，我们可以检测到不同类型的蛋白:血清蛋白 脂蛋白(运送脂类) 各种酶类血红蛋白正确解释电泳结果,为临床对疾病的判断提供可靠参考,血清蛋白电泳,蛋白染色,血清蛋白电泳后会呈现出5 或者 6 条带.染色后,每个条带呈现出的不同程度的染色对应着各自的蛋白浓度.如何检测染色程度: 需要使用光密度仪.,正常的电泳图谱,出现单克隆免疫球蛋白的电泳图谱,血清蛋白电泳的目的是什么?,检测异常 :含量的变化 : 条带中蛋白含量的增加或减少将电泳作为常规检测之一, 基于蛋白含量的变化, 有助于我们对以下疾病的筛查 :炎症 营养不良肺气肿性质的变化 : 异常条带的出现对异常条带的筛查,有助于我们检测下列疾病: 骨髓瘤 巨球蛋白血症(Waldenstrom)细菌和病毒感染在这些情况下, 必须要做其他辅助测试, 比如说免疫固定, 使用不同类型的抗血清对异常蛋白进行检测. (对于后期治疗有很重要的指导意义),什么情况下必须进行电泳检测?,总蛋白异常升高或异常下降A/G比例变化血液沉降速度发生异常变化出现恶性疾病征兆在免疫球蛋白定量检测中发现 某一种免疫球蛋白出现大量异常增加,电泳区带分析,双白蛋白,或者一条宽峰,或者在白蛋白条带出现附属条带可能是由以下原因造成 :遗传性双白蛋暂时性的双白蛋白血症可能是由于药物刺激导致的急性胰腺炎导致的双白蛋白血症 : 大量的胰酶的出现可以导致白蛋白降解,白蛋白区带,双白蛋白血症,双白蛋白血症,在下列情况下白蛋白会出现下降 :- 肾病综合症, 蛋白流失, 胃肠病: 检查尿蛋白- 淋巴细胞增生综合征- 营养不良- 肝脏功能不全- 慢性炎症- 严重烧伤- 血液稀释,在下列情况中白蛋白会出现增加:- 脱水症状- 血液浓缩- 白蛋白注射,Alpha 1 globulins(1球蛋白区带),将会在下列情况下出现下降:- 蛋白流失- 肝功能不全- 先天性抗胰蛋白酶缺乏症出现两个条带:- 抗胰蛋白酶的不同基因型出现增加:- 炎症症状,急性炎症电泳图谱,Alpha 2 globulins(2球蛋白区带),下列情况中出现下降:- 肝功能不全- 血管内溶血,溶血的标本,下列情况下Alpha2区域会出现增加现象: - 炎症症状- 肾病综合征- 出现游离轻链,肾病综合征,Beta globulins(球蛋白区带),在下列情况下会出现下降 :- 肝功能不全- C3 长期缺乏 或者 C3 代谢过快 (also in aging sample,C3 denaturation, splitted in up to 4 fractions: 1 between a2 and b, 1 on b1, 1 on b2 and 1 on g),在下列情况下会出现两个条带:- 长期存放的标本或者是高胆固醇的标本, LDL 有不同的迁移率; 从而导致LDL电泳是偏移 Beta位置,Beta球蛋白在下列情况下会出现增加现象:- 胆管阻塞- 肾病综合征- 肝硬化- 缺铁性贫血- 血球蛋白异常- 高脂蛋白血症- 大量溶血,酒精性肝硬化中的- 桥,免疫球蛋白是机体的正常生理成分，机体保持一定水平。当这种正常水平打破时，则属于疾病，增多或减少则意味着免疫增殖病或免疫缺陷病。 IgG-、lgG- IgA-、IgA- IgM-、IgM- IgD-、IgD- IgE-、 IgE-,Gamma globulins (免疫球蛋白区带),Specific white blood cells (lymphocytes B) turn into plasmocytes,3,Plasmocytes produce antibody proteins, also called Immunoglobulins.,4,Plasmocyte,Immunoglobulin,Bone Marrow produces 3 key blood cells : Red blood cells : deliver dioxygene throughout the body via circulatory systemsWhite blood cells : participate in immune systemPlatelets : help blood coagulate,immunoglobulins are used by the immune system to identify and neutralize foreign elements such as bacteria and viruses.,5,2,Normal Immunoglobulins,Normal Plasmocytes,Normal Proteinogram,Malignant Plasmocyte or Myeloma cell,Proteinogram showing Monoclonal peak,Normal Immunoglobulin,Bone marrow is the flexible tissue found in the hollow interior of bones (backbone, skull, pelvis, rib cage),Clonal immunoglobulin or M protein of IgA type,1,NormalImmunoglobulinsecretion,MonoclonalGammopathy,Multiple Myeloma and Monoclonal Ig,单克隆增殖，是一个细胞在某一分裂阶段发生突变，然后急剧分化、增殖, 并大量表达某种单一的Ig,这种恶性增殖具有如下特点: 1，均一型Ig 2，Ig含量大(也可高达10余克) 3，正常Ig成分减少(正常值以下) 4，轻链型比例失调(/或2:1) 5，出现相关临床表现 M蛋白疾病的“M”含义是Myeloma, Macroglobulinemia, Malignant lymphoma和Monoclonal Gammapathies均以“M”开头. M蛋白在电泳上表现为高而狭窄的尖峰.,Monoclonal Ig,Polyclonal Igs,Polyclonal Igs,Monoclonal Ig,Discovery of a monoclonal immunoglobulin by serum protein electrophoresis,多克隆免疫球蛋白的增加:- 炎症- 肝硬化- 亚急性和慢性感染 - 恶性肿瘤:早期恶性肿瘤有多克隆增殖现象尤其淋巴瘤。 晚期恶性肿由于恶液质出现，Ig反而减少,Ig异常合成-多克隆免疫球蛋白区带,血清蛋白021216狼疮病,血清蛋白030127酒精肝B-r桥,与下列各类疾病相关的寡克隆免疫球蛋白(多个条带) :- 自身免疫病- 先天性免疫缺陷症- 病毒感染 (C Hepatitis, HIV disease, CMV(巨细胞病毒), EBV,)- 免疫抑制治疗,Ig异常合成-寡克隆免疫球蛋白区带,Oligoclonal pattern(寡克隆免疫球蛋白),血清蛋白电泳是 M蛋白 (Monoclonal Protein) 多克隆 (polyclonal Protein) 寡克隆 (Oligoclonal Protein) 的首选检测项目,表1 646例M蛋白类型分类型别 例数 %IgG型骨髓瘤 205 31.73IgA型骨髓瘤 93 14.40IgM型骨髓瘤 56 8.67IgD型骨髓瘤 12 1.86重链病 5 0.77轻链病 214 33.13半分子病 1 0.157S IgM 2 0.31BMG 49 7.59双M蛋白病 8 1.24,上海新华医院, 2005年,多发性骨髓瘤(Multiple Myeloma,MM),MM是造血系统的恶性肿瘤,占整个恶性肿瘤的1%常见于中、老年人(50-70岁居多,40岁以下少见).以往对此病认识不足，漏诊、误诊可达到70%以上.随着寿命的延长对此病认识的提高病例数显著增加.,MM临床表现特点,骨痛,骨骼肿块与病理性骨折,骨质疏松和溶骨现象贫血免疫功能低下,反复感染肾脏损害高钙,高粘(血浆相对黏度6以上)高尿酸血症表现MM的临床表现多样化,常常因此就诊于骨科、肾脏内科等,延误诊治,多发性骨髓瘤的免疫学特征,血中出现M蛋白,正常Ig水平明显减低尿中出现M蛋白和轻链蛋白(BJP)骨髓中浆细胞明显增加无免疫活性Ig导致免疫功能低下,多发性骨髓瘤病人溶骨报告(骨盆),多发性骨髓瘤病人溶骨报告,多发性骨髓瘤病人溶骨报告(颅骨),临床实例,意义未明的单克隆免疫球蛋白疾病: Benign MC在法国,在对献血者进行检测时,会检测到0,15% 比例的单克隆免疫球蛋白携带者. 在老龄人群中检测到的携带者比例更高 (80岁以上人群). 在对60到99岁人群的检测显示, 出现Ig的比例从2,6%上升至19,2%.(平均值= 5%),MGUS,MGUS携带者特征: -未出现临床和影像学特征-未出现不良反应, 未检测到血钙升高,也未出现肾功 能衰竭-未见骨髓瘤的临床特征-单克隆免疫球蛋白 20g/l -其他免疫球蛋白都是正常的,同时在患者尿液中未检测到本周氏蛋白-单克隆免疫球蛋白的浓度随着时间的推移未发生增 加现象-其他的免疫球蛋白的浓度也未随时间推移而出现下降,在20%的情况中, MGUS 将会转化成恶性疾病 (6-10 years),Kyle report显示,通过对1384名含有MGUS的患者的 2035(average : 22 years)年的跟踪监测发现, 24%的患者最终演变成恶性的淋巴细胞增生症(multiple myeloma, macroglobulinemia, amyloidosis,).从检测到单克隆免疫球蛋白,直到作出多发性骨髓瘤的诊断报告,这段时间是不定的,从2-29年(平均是10年左右).,大量报告显示,在下列情况中,发展成为恶性淋巴细胞增生疾病的可能性很小 :- 单克隆免疫球蛋白: IgG 15 g/L IgA 10 g/L IgM 5 g/L- 尿蛋白中未出现本周氏蛋白- 其他类型的免疫球蛋白未出现下降,寡克隆免疫球蛋白,由于药物原因导致的免疫缺陷:- 在器官或者骨移植之后 - 自身免疫病: (类风湿关节炎, 干燥综合征(66%), 系统性红斑狼疮.) 由于细菌或病毒感染导致的免疫缺陷:- 病毒 : HIV (63%), EBV, CMV, viral hepatitis,- 细菌,寄生虫感染: (脑膜炎, 脑炎,),在一些肿瘤中: (慢性淋巴细胞性白血病CLL: 29%) 在5 % 正常群体中 (MGUS) 在多发性硬化患者中: (CSF 90%),检测结果阐述,电泳的结果是以%的形式给出的, 但是对于临床诊断, 结果必须要以浓度的形式给出g/L蛋白浓度出现异常时,必须要进行其它的补充检测,患者的随访,首次被发现的患者:如果检测到的异常M蛋白峰值不多, 同时其他免疫球蛋白的含量未发生变化,也没有临床症状, 怀疑可能是 MGUS,第一年每4 至 6个月对患者经性随访,从第二年起, 每年进行一次随访.,已确诊的患者: 如果电泳结果和先前检测相同, 利用异常峰值进行量化以便于检测异常M蛋白的浓度是否发生变化. 这种情况下的随访检测,一定要选择相同的技术方法. 如果随访结果显示出现异常区带, 一定要进行免疫固定电泳确认这些异常蛋白的成分.,异常血清蛋白质电泳图谱的分型及其特征,免疫固定电泳结果分析指南,在血清蛋白电泳时,检测到异常条带的出现,或者是某一个条带的蛋白出现异常增加 电泳结果显示为低免疫球蛋白血症, 或者免疫球蛋白定量结果显示可能是游离轻链病 尿蛋白检测结果异常(检测到单克隆游离轻链),查看患者是否做过血清蛋白电泳,如果有必要需要进行血清的免疫固定电泳,什么情况下必须要进行免疫固定电泳检测?,加样: 同一样品重复加样6次2) 电泳: 大约9分钟,3)电泳结束后, 加不同类型抗血清:ELP: 固定液G: antiserum anti IgG heavy chainA: antiserum anti IgA heavy chainM: antiserum anti IgM heavy chainK: antiserum anti kappa light chainL: antiserum anti lambda light chainincubation time,4) 终止反应, 吸出多余的抗血清, 烘干胶片5) 清洗胶片,染色,传统的单克隆免疫球蛋白检测方法-免疫固定电泳(IF),正常血清标本,Ig G l单克隆免疫球蛋白(近负极端),Ig G l单克隆免疫球蛋白(近正极端),出现在 a2 区域的Ig A l,出现两个异常蛋白带 :利用Beta巯基乙醇处理后, 结果为Ig A l单克隆免疫球蛋白,BME/Fluidil treatment,BME/Fluidil treatment,检测结果显示为3个IgA l:利用Beta巯基乙醇处理后, 结果为Ig A l单克隆免疫球蛋白,Ig M k 单克隆免疫球蛋白,寡克隆免疫球蛋白 Ig G (k + l),双克隆免疫球蛋白 Ig G k 和 Ig A k,免疫固定结果显示为单独的 l 成分:需要使用抗 l游离轻链和/或抗 Ig D和Ig E的抗血清确认,该结果为 l型游离轻链,BJ assay,characterized on HYDRAGEL BENCE JONES,免疫固定结果显示为2个独立的 l 成分:需要使用抗 l游离轻链和/或抗 Ig D和Ig E的抗血清确认,该结果为单克隆Ig D l, 并伴随有 l 游离轻链,BJ assay,characterized on HYDRAGEL BENCE JONES,免疫固定结果确认: Ig E l 单克隆免疫球蛋白,免疫固定结果显示为单独的 l 成分:需要使用抗 l游离轻链和/或抗 Ig D和Ig E的抗血清确认,特殊病例,在免疫球蛋白区域检测到异常条带, 但是免疫固定检测结果却为阴性,在使用抗-纤维蛋白原的抗血清结果显示为阳性,尿蛋白的电泳研究,肾单位的生理结构和各类生理蛋白,1百万个肾单位每天过滤180升的血浆，同时产生大约1.5升的尿液。,尿蛋白 : 定义,在生理学角度讲，正常的人的尿蛋白量在 50 至120 mg/24 h (大约在 100 mg/L)主要的蛋白是白蛋白 (少于 30 mg/L)病理上的肾功能疾病：当尿蛋白量大于150 mg/24 h 而此时，尿蛋白的成分也是不定的。,导致尿蛋白含量增加的原因,生理上的因素 : 间歇性的 (站立过久, 正餐以后, 运动过后, 压力之下)肾前性 : 高血压, 发烧, 心脏或肝脏功能衰退, 蛋白浓度升高 (尿蛋白含量过高)肾性: 肾小球或肾小管受到损伤 (或者两个同时受到损伤)肾后性 : 泌尿系统出现损伤,肾前性的尿蛋白,尿蛋白含量增加,某一种蛋白含量出现异常升高， 超出了肾小管对于这一蛋白的再吸收能力。原因自由轻链, 主要是在单克隆免疫球蛋白疾病中beta 2 微球蛋白, 淋巴组织增生综合征 溶菌酶, 在一些急性髓细胞白血病血红蛋白, 在结合珠蛋白饱和后出现的溶血现象中血清粘蛋白, 又称为Alpha酸性糖蛋白，在支气管癌患者中肌红蛋白, 在横纹肌出现溶解患者中上述各类情况均可导致出现肾病 (尤其是含有自由轻链的本周氏尿蛋白),尿蛋白含量增加,肾性尿蛋白分析,a2-巨球蛋白 (MW :900 kDa),注 : (Cystatin C),血清半胱氨酸蛋白酶抑制剂C,肾小球过滤,小分子蛋白, 分子量小于 67kDa, 被过滤到尿液中.其他决定各种蛋白被过滤的因素 : 分析形状, 带电量, 血浆浓度.还有一些血液动力学因素可影响蛋白的过滤.,肾小球损伤,经常出现于成人及儿童患者中, 表现为尿蛋白含量出现增加现象 (大于1g/24-h)原因糖尿病感染性损伤 (细菌感染, 乙肝患者, 水痘, 梅毒, 单核白血球增多症 ,) 其他系统性疾病 (自动免疫系统, 癌症,)中毒现象 (重金属, 药物中毒,)此时, 我们可以在尿蛋白中发现白蛋白和其他大分子量蛋白 (大于 67kDa)。,临床示例,肾小管的再次吸收功能,在肾小球中被过滤掉的小分子蛋白， 分子量小于67kDa, 将会在肾小管内被重新吸收 (内吞作用).99% 的在肾小球内被过滤的蛋白, 都将会被重新吸收利用. 例如, 18g/24-h 白蛋白将会被过滤掉; 30mg/L 白蛋白在人的尿液中被发现.,肾小管损伤,肾小管损伤将会改变其对小蛋白分子的重新吸收能力 (小于67kDa的蛋白)通常是暂时性的, 并且少于0.5g/24-hours原因遗传原因 (Fanconis syndrome)免疫球蛋白单克隆扩增 (骨髓瘤)药物作用 (抗癌药物)中毒现象 (重金属)白蛋白 (6, the Bence Jones will interact strongly with the Tamm-Horsfall protein.- If the pI is low, there will be little interaction with THP. 轻链形成的聚合体: - (polymers can reach a MW of 900 kD). 轻链的初级结构: - The primary structure of the free light chains is also involved in the toxicity. This is due to the variable region of the light chain.,病例一,病人甲，女，29岁，蛋白尿肾内科就诊。尿蛋白电泳：100球性蛋白；尿总轻链定量：5.95mg/dl(05.10) 70.10mg/dl（0-5.0）；血清蛋白电泳和免疫固定电泳未见单克隆蛋白；尿本周蛋白电泳可见轻链型M蛋白,病例一,血清免疫固定电泳,尿本周蛋白电泳,病例二,病人丙，男，53岁，多发性骨髓瘤治疗中血清免疫固定电泳：M蛋白阴性尿总轻链定量：6.29mg/dl(0-5.10) 6, the Bence Jones will interact strongly with the Tamm-Horsfall protein.- If the pI is low, there will be little interaction with THP. 轻链形成的聚合体: - (polymers can reach a MW of 900 kD). 轻链的初级结构: - The primary structure of the free light chains is also involved in the toxicity. This is due to the variable region of the light chain.,下列参数会影响本周氏蛋白的毒性 :,等电点 (pI):- When the pI is 6, the Bence Jones will interact strongly with the Tamm-Horsfall protein.- If the pI is low, there will be little interaction with THP. 轻链形成的聚合体: - (polymers can reach a MW of 900 kD). 轻链的初级结构: - The primary structure of the free light chains is also involved in the toxicity. This is due to the variable region of the light chain.,尿液的检测原则,当血液中检测到M蛋白时:- 进行24H尿蛋白检测- 电泳 + IF/BJ- 对异常峰进行鉴定- 对患者进行随访, 目的是确认药后疗效和肾脏损伤程度,重点 : 对患者定期随访检测, 便于及时掌握患者肾脏损伤程度,总结,电泳技术在同工酶分析方面的应用,The Assay and the Clinical Application of Isoenzymes,同工酶的定义,同工酶是以多种分子形式存在于机体的催化功能相同分子结构不同,检测同工酶的目的,检测同工酶活力比单测定酶的总活力更具有脏器特异性和高灵敏性等优点, 因而提高了临床诊断价值早期诊断某些疾病, 阳性率高, 特异性强可以估计病情严重性和判断预后,目前广泛应用于临床检测中的同工酶,乳酸脱氢酶同工酶(Lactate dehydrogenase, LDH)肌酸激酶同工酶(Creatine kinase, CK)碱性磷酸酶同工酶(Alkaline phosphatase, ALP)天冬氨酸氨基转移酶(Aspartate transaminase, AST) - 谷氨酰转移酶(- glutamyltransferase, GGT) - 淀粉酶同工酶( -Amylase, AMY),同工酶的分析方法,由于同工酶的一级结构 (氨基酸序列)及高级结构(构象)的不同, 因此, 一种酶的各个同工酶在化学, 物理化学, 生物化学等方面的性质也就有所差异, 这些差异就提供了分析和鉴定同工酶的理论基础在研究同工酶的所有方法中，电泳法的使用最为广泛。因为此法简便、快速、分离效果良好，并且一般不会破坏酶的天然状态,乳酸脱氢酶同工酶(LDH),乳酸脱氢酶是能催化乳酸脱氢生成丙酮酸的酶每种LD同功酶都是由4个亚单位(肽链)组成的四聚物. 这些亚单位中, 有两类分别专属M(肌肉)和H(心脏).H4 = LD1H3M = LD2