中药第二章鉴别

第二章 中药制剂的鉴别,中药制剂的鉴别,利用制剂的处方组成、性状特征、显微特征、所含成分的理化性质、色谱和光谱特性以及相应的物理常数，确定制剂真实性的方法，包括性状鉴别、显微鉴别和理化鉴别三大类。,特点,2、药物鉴别为已知药物的确证试验,1、药物鉴别是药物分析的首项任务,3、鉴别试验是个别分析,4、化学鉴别试验要有明显的现象,5、药物鉴别的方法要求专属性强、灵敏度高、再现性好、以及操作简便、快速等特点。,6、制剂鉴别要考虑干扰成分的影响,第一节 性状鉴别,性状：通常是药品的形状、状态、剂型、外观色泽、气味、口味、溶解性、熔点等的总称。,制备工艺,1形状或形态 当制剂的形状或形态发生改变时，可能与变质、掺杂等有关。2色 泽 系指制剂在日光下呈现的颜色及光泽度。常与制剂的品种、原料、所含成分、生产工艺、贮藏时间等有关，一般较为固定，为中药制剂质量的重要标志。3气、味 口尝制剂时，要取少量有代表性的样品，咀嚼至少1分钟，使舌的各部位都充分与药液接触，以便能准确地尝到药味。,注意事项：,制剂的性状指成品的颜色、形态、气味等；有包衣的丸剂、片剂应描述除去包衣后的片心、丸心的颜色及气味； 硬胶囊应写明除去胶囊后内容物的性状；制剂色泽有两种色调组合，描写时以后者为主，如棕红色。,对不同剂型的中药制剂常采用不同的性状描述方法,附子理中丸（蜜丸）：本品为棕褐色至棕黑色的水蜜丸，或为棕褐色至棕黑色的大蜜丸；除去包衣后显棕褐色；气微，味微甜而辛辣,相对密度：八角茴香油相对密度在25时0.9750.988。 折光率：丁香罗勒油折光率为1.5301.540。 旋光度：八角茴香油旋光度为-2 +1。 凝点：八角茴香油凝点不低于15。 熔点：薄荷脑熔点为4244。 馏程：松节油 在154165馏出的数量不得少于90.0%（ml/ml）。,二、物理常数测定,旋光度,1、偏振光：仅在一个平面上振动的光。,2、旋光性：光学活性物质使偏振光偏振面 发生旋转的性质。,右旋体：偏振面右旋(+)左旋体：偏振面左旋(-),3、旋光度() ：偏振光振动平面旋转的角度,通过旋光仪测定，不是物理常数,4、比旋度,当旋光性物质的浓度为1gml，液层厚度为ldm时所测得的旋光度。,l液层厚度或旋光管长度，dm c溶液浓度，gml,钠光谱D线（589.3nm）,固体供试品,旋光管 标准石英旋光管,旋光计的检定，中国药典（2010年版）规定用 A. 葡萄糖作基准物 B. 水杨醛作基准物 C. 半乳糖作基准物 D. 水合氯醛作基准物 E. 标准石英旋光管,1. 鉴别,2. 在杂质检查中的应用 如硫酸阿托品中莨菪碱的检查,3. 在含量测定中的应用 如葡萄糖注射液的含量测定,【实例分析】谷氨酸钾注射液（规格：20ml6.3g）的含量测定,精密量取本品15ml 2份，分别置50ml量瓶中，各加盐酸10ml，用水稀释到刻度，摇匀，依法测定旋光度，旋光管的长度为2dm，测得第一份样品的3次旋光度平均值为4.84、第二份样品的3次旋光度平均值为4.85，两份样品各次的旋光度的级差为0.02。测定前，以溶剂为空白，校正读数为0.00；测定后，再次测定溶剂的旋光度， 仍为0.00。 求出谷氨酸钾注射液标示量的百分含量。已知谷氨酸的比旋度为31.532.5。,分析：本法中， 盐酸的作用是将谷氨酸钾转变为谷氨酸。 两份样品的旋光度值级差 0.02，测定前后空白读数均为0.00，故测定结果有效。设供试品中谷氨酸钾的浓度c（g/100ml）,测定某药物的比旋度，配制的供试品溶液浓度为50.0mg/ml，样品溶液宽2dm，测得旋光度为+3.25，则比旋度为 A. +6.50 B. +32.5 C. +60.0 D. +16.25 E. +325,测定盐酸土霉素的比旋度时，若称取供试品0.5050g，置50ml量瓶中，加盐酸液（91000）稀释至刻度，用2dm长的样品管测定，要求比旋度为188 200。则测得的旋光度的范围应为 A、3.804.04 B、380404 C、1.902.02 D、190202 E、1.882.00,折光率,折射现象：光线通过两种密度不同的透明介质时，其速度和方向发生改变的现象。,i,r,空气、供试液,折光率是入射角的正弦与折射角的正弦的比值,钠光谱D线（589.3nm）,20,入射角,折射角,入射角i为90时，sin i=1,这时折射角达到最大值，称为临界角0（一定条件下为常数）， n=1/sin0,观测系统和读数系统,目镜中颜色的调节,表示光线从棱镜入射角达到了临界角,1、鉴别和纯度检查2、含量测定,（1）折光率因素(F)法,标准溶液折光率,同温度时水的折光率,样品溶液每间隔1%浓度时折光率增加值,样品%,方法：a.配制浓度已知标准溶液， b.求F(斜率),c.求C测,（2）标准曲线法 配制一系列的标准溶液，浓度在供试品近似浓度附近，测定一系列n， 做出标准曲线（n-C曲线）,未知溶液折光率,同温度时水的折光率,物质的折光率与下列因素有关 A、光线的波长 B、被测物质的温度 C、光路的长短 D、被测物质浓度 E、杂质含量,20时水的折光率为 A、1.3305 B、1.3325 C、1.3330 D、1.517 E、1.7左右,一、含 义,利用显微镜对含药材粉末的中药制剂中特有的组织、细胞及细胞内含物等特征进行鉴别的方法。,第二节 显微鉴别法,板蓝根颗粒制法,取板蓝根，加水煎煮，煎液滤过，滤液浓缩，加乙醇静置使沉淀，取上清液，回收乙醇并浓缩至适量。加入适量的蔗糖和糊精，制成颗粒，干燥即得。,显微鉴别的目的,检查制剂中 是否有缺少或代用的药材 对药品的真实性进行鉴别。,二、程序,处方分析 供试品预处理 显微制片 显微观察 显微测量 显微化学反应 结果判断,（一）处方分析,组成较少：全检-如左金丸（黄连、吴茱萸）组成较多：主药、贵重药、毒性药、混乱品种 -如人参健脾丸：由11味药材组成 药典规定需检出：人参主药 砂仁贵重药 山药混乱品种,1. 选择鉴别药味,2. 选择专属性鉴别特征选取该药材在本制剂中易察见、专属性强的显微特征12个排除类似的或因加工而消失的特征,（一）处方分析,人参粉末图,戊己丸：3 -白芍草酸钙簇晶 六味地黄丸：6 -牡丹皮草酸钙簇晶 归芍地黄丸：8 -白芍糊化淀粉粒团块 -牡丹皮木栓细胞,（一）处方分析,若制剂的显微鉴别特征在国家药品标准中有记载，则可省去该分析过程，直接依法鉴别。中国药典2005年版：290/564,（二）供试品预处理,散剂、胶囊剂：直接取粉末制片。片剂：取23片研细，混匀，粉末制片。,水丸、糊丸、水蜜丸： 取数丸，置乳钵中研细，混匀，再取适量 粉末装片。,（三）显微制片,粉末制片法： - 冷装片 -水合氯醛加热 透化装片解离组织制片法：观察单个细胞,粉末冷装片：解剖针挑取粉末少许，置载玻片中央偏右处，滴加适量透明剂1-2滴，搅匀，放置盖玻片水合氯醛试液透化装片：挑取粉末少许，置载玻片中央偏右处，滴加水合氯醛1-2滴，搅匀，用试管夹夹持载玻片一端，保持水平置酒精灯火焰上方约1-2cm加热，微沸后，离开火焰，再滴加水合氯醛试液，小火继续加热，如此反复操作至透化清晰。避免水合氯醛结晶析出，放冷后滴加稀甘油1-2滴，封片镜检。,解离组织制片法,纤维素细胞壁的细胞间质主要有果胶纤维构成，可因与氢氧化钾或氢氧化钠等碱液共热而分解破坏；木化细胞的细胞间质常因含有木质素而不被碱液破坏，可用氧化剂破坏木质素，是细胞分离。氢氧化钾法-薄壁组织发达，木化组织较少或分散存在的供试品。硝铬酸法，氯酸钾法-木化组织较多或集成较大群束的供试品。,（四）显微观察,2-5个标本 对照观察 “之”字移动,（五）显微测量,用目微尺，在显微镜下测量细胞及细胞内含物等的大小。,目镜测微尺,直径1820mm的圆形玻璃片（ 50格或100格）,台微尺（标定目微尺）,通常将长1mm（或2mm）精确等分成100（或200）小格，每1小格长为10m,标定目微尺,测量方法,需测量的目的物显微制片置显微镜载物台上，用目镜测微尺侧量目的物的小格数，乘以上述每一小格的微米数。,（六）显微化学鉴别,（七）结果判断,药品检验报告书,结论：本品按检验上述项目，结果符合规定。,三、实例-牛黄解毒片的显微鉴别,制法： -雄黄、大黄、牛黄、冰片成粉； -黄芩等四味加水煎煮，滤液浓缩成膏； -混匀，压制成片或包衣，即得。,处方： 雄黄 大黄 牛黄 冰片; 黄芩 石膏 桔梗 甘草,分析结果：检-大黄 雄黄（中国药典）,-牛黄解毒片的显微鉴别,-牛黄解毒片的显微鉴别,取样：取23片，去包衣，乳钵中研细， 或用刀片从药片断面刮取少量粉末。制片：按粉末制片法装片观察：置显微镜下观察，应有以下特征 -草酸钙簇晶大，直径60140m（检大黄） -不规则碎块金黄色或橙黄色，有光泽（检雄黄）,-牛黄解毒片的显微鉴别,结论：本品按中国药典2005版一部检验上述项目，结果符合规定。,四、注意事项,为提高准确性，可与对照药材或已经鉴定的药材对照观察。 药渣投料或投料量不足等，需配合理化鉴别、含量测定等方法进行检验。,思考,某企业生产左金丸（黄连、吴茱萸）时，黄连用盐酸小檗碱或用提取过盐酸小檗碱的药渣投料，请设计检验方案，揭露这两种违规行为。,第三节 理化鉴别,利用制剂所含化学成分的理化性质，通过化学反应法、光谱法和色谱法等分析方法和技术检测有关成分是否存在，从而判断制剂的真伪。,以制剂药味中的指标性成分（主要为有效成分或特征性成分）为检测对象，故可以更加客观深刻地评价药品的真实性。对于液体制剂或其它不含原料药粉的制剂，理化鉴别则显得为重要。,特点,方法,化学反应法微量升华法荧光鉴别法薄层色谱法(今后中药制剂鉴别的发展方向)分光光度法气相色谱法和高效液相色谱法,一、化学反应鉴别法,（一）原理（二）特点1.操作简便，适用性较强。2.其否定功能往往强于肯定功能,专属性较差。3.易发生假阳性或假阴性反应,处方分析，首选主药、辅药、贵重药和毒性药作为鉴别重点。 对样品进行预处理，除去干扰性成分，富集被检成分。选用专属性较强的检测试剂。 必要时做阳性或阴性对照试验加以验证，保证其专属性和灵敏度。,应用注意,大山楂丸 P67,【 成 份 】 山楂、六神曲(麸炒)、麦芽(炒)。【 制 法 】以上三味，粉碎成细粉，过筛，混匀；另取蔗糖600g，加水270ml与炼蜜600g，混合，炼至相对密度约为1.38（70C）时，滤过，与上述粉末混匀，制成大蜜丸，记得 。,（三）常用的一般化学反应,1. 生物碱 （1）碘化铋钾反应 产生红棕色沉淀 （2）碘化汞钾反应 产生类白色沉淀 （3）硅钨酸反应 产生白色沉淀 （4）苦味酸反应 产生黄色结晶性沉淀 需在酸性条件下进行。 注意事先排除其它成分的干扰。 少数生物碱不与上述通用沉淀试剂反应。,2. 黄酮类化合物 最多使用的检识反应为盐酸镁粉反应，呈紫红色。大山楂丸（山楂）、抗骨增生丸（淫羊藿）、参茸保胎丸（黄芩）等。此外，黄芩提取物采用二氯氧锆-盐酸显色反应（黄色）进行检识。 3. 蒽醌类化合物 主要应用碱液反应（Borntrager反应），阳性反应呈红色，加酸红色褪去呈黄色。例如大黄流浸膏（大黄）、天麻首乌片（何首乌）。,4. 皂苷, 泡沫反应 甾体碱管多，三萜酸管多或等 醋酐浓硫酸反应 甾体皂苷呈现污绿色，三萜皂苷呈现红、红紫色。 三氯化锑或五氯化锑反应 氯仿液呈紫兰色。 氯仿浓硫酸反应 氯仿层出现红色或兰色，硫酸层出现绿色荧光。 地奥心血康胶囊（黄山药和穿山龙薯蓣的提取物）、养心定悸膏（甘草、红参、麦冬）。,5. 香豆素、内酯类和酚类, 氯亚氨基-2，6-二氯醌反应（Gibbs反应），呈现蓝色。 异羟肟酸铁反应 呈红色。应用品种有：养阴清肺膏（牡丹皮）、前列舒丸（牡丹皮）等。 6. 挥发性成分 主要使用香草醛浓硫酸反应检识此类成分，正反应呈红、红紫色。 应用品种主要有：万应锭（冰片）、牛黄解毒片（冰片）、养心定悸膏（桂枝、生姜）等。,7. 矿物药,1）朱砂（主含HgS） 铜片反应。 HgS+2HCl+CuCuCl2+Hg（白 ）+H2S2）石膏、牡蛎、海螵蛸等（钙盐）草酸铵反应 CaSO4+(NH4)2C2O4CaC2O4（白）+(NH4)2SO4 CaC2O4溶于盐酸，难溶于醋酸。 CaC2O4+2HClCaCl2+H2C2O4,3）雄黄（主含As2S2） A. 氯化钡沉淀法（检出硫） As2S2+KClO3 +4HNO3 2K3AsO3+H2SO4+Cl2+4NO H2SO4+BaCl2 BaSO4（白） B. 硫化氢反应（检出砷） 2As2S2+7O2 2As2O3+4SO2 As2O3+3H2O 2H3AsO3 2H3AsO3+3H2S As2S3(黄)+6H2O As2S3在盐酸中析出黄色沉淀，并溶于碳酸铵中 形成可溶性铵盐。,o,8. 动物药,常含有较多的蛋白质或氨基酸、故常使用茚三酮反应鉴别之，正反应呈红紫色。 例如：龟龄集（鹿茸、海马等） 参茸保胎丸（阿胶、鹿茸等）,（四）操作方法 1.供试液的制备,1、水提取：室温浸泡：检验氨基酸、蛋白质。 60热水提取：检验糖皂苷、鞣质.2、乙醇、甲醇提取：检验黄酮、酚、有机酸、生物碱；3、乙醚提取：滤液检验酯、内酯、苷元； 药渣挥去乙醚，甲醇回流提取：检验各种苷类。 4、以50%-70%乙醇回流提取：提取多数化学成分；5、升化法提取：升华的成分，如游离蒽醌苷元等。6、水蒸气蒸馏法提取：挥发性成分。,2、操作方式 试管反应：供试液适量置于试管中，加入试剂反应 平板反应-蒸发皿或坩埚：挥去溶剂，滴加试剂于残留物进行检识3、注意事项试管振荡背景加热（五）检验记录与结果判断,（六）应用实例,1.试分析下述鉴别反应检查的是何种药材？并写出反应原理。 取万氏牛黄清心丸（处方组成：牛黄、朱砂、黄连、黄芩、栀子、郁金）3g，加水适量，研匀，反复洗去悬浮物，可得少量朱红色沉淀，取出，加入盐酸1ml及光洁铜片少量，加热煮沸，铜片由黄色变为银白色。,2. 试分析下述鉴别反应检查的是何种药材？并写出反应原理。取冰硼散（处方组成：冰片、硼砂、朱砂、玄明粉）0.5g，加水3ml，振摇，加盐酸使成酸性后，滤过，取滤液加氯化钡试液12滴，即生成白色沉淀，分离后，沉淀在盐酸中不溶解。,玄明粉的主要成分为硫酸钠,二、 升华鉴别法,(一)概述原理:本法是利用中药制剂中所含的某些化学成分具有升华性，在一定温度下获得升华物，根据升华物的理化性质进行鉴别的方法。升华物的鉴别方法主要有： 利用显微镜观察晶型； 可见光下观察颜色； 紫外灯下观察荧光； 加入合适的试液与其发生显色反应或荧光反应。,微量升华法应用于中药材鉴别,1.茶叶 2.大黄 3.斑蝥 4.何首乌,UV,(二)操作方法（微量升华法、 坩埚法、蒸发皿法）,（三）注意事项1.升华时应缓慢加热2.样品粉末用量一般约0.5g （四）应用实例 大黄流浸膏中大黄的鉴别 取本品1ml，置瓷坩埚中，在水浴上蒸干后，坩埚上覆以载玻片，置石棉网上直火徐徐加热，至载玻片上呈现升华物后，取下载玻片，放冷，置显微镜下观察，有菱形针状、羽状和不规则晶体，滴加氢氧化钠试液，结晶溶解，溶液显紫红色。,取本品1g，水蜜丸捣碎，小蜜丸或大蜜丸剪碎，平铺于坩埚中，上盖一长柄漏斗，徐徐加热，至粉末微焦时停止加热，放冷，取下漏斗， 用水5ml冲洗内壁， 洗液置紫外光灯（365nm）下观察， 显淡蓝绿色荧光。,天王补心丸的鉴别,课堂互动,冰片是从龙脑香的树脂和挥发油中取得的结晶，是近乎纯粹的右旋龙脑。中成药中大多使用合成龙脑（外消旋体）。具有良好的升华性，微量升华法又简单实用，是否可以认为中成药中的冰片都能用微量升华法鉴别呢？,消糜栓,取本品1粒，置具塞锥形瓶中，在90水浴中加热，待栓剂完全融化，立即取出，趁热加入醋酸乙酯50ml，充分振摇，放置至室温，0以下放置20分钟，取出，立即滤过，取续滤液2ml，作为供试品溶液。 另取冰片对照品，加醋酸乙酯制成每1ml含5mg的溶液，作为对照品溶液。 照薄层色谱法（中国药典2000年版一部附录 B）试验，吸取上述两种溶液各2l，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-醋酸乙酯（85:15）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%香草醛硫酸溶液，在105加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。,聚氧乙烯单硬脂酸酯1748g 甘油22g,三、 荧光鉴别法,（一）概述原理：利用中药制剂中所含的某些化学成分，在紫外光或可见光下能产生一定颜色荧光，或经试剂处理后能产生荧光的性质进行鉴别的方法。特点： 简便、灵敏，具有一定的专属性。例如大黄和土大黄 ，前者显棕色至棕红色荧光，而后者显亮蓝色荧光，很容易区分。,荧光,常温下，处于基态的分子吸收一定的紫外可见光的辐射能成为激发态分子，激发态分子通过无辐射跃迁至第一激发态的最低振动能级，再以辐射跃迁的形式回到基态，发出比吸收光波长长的光而产生荧光。,（三）操作方法 通常取中成药的提取液点加于滤纸上或加入蒸发皿中，置紫外光灯（365nm）下约10cm处观察所产生的荧光。必要时可在供试品上加酸、碱或其它试剂，再观察荧光及其变化。,硫色素反应,下列升华性成分分别存在于哪些药材中A.蒽醌类B.牡丹酚C.苯甲酸D.斑蝥素E香夹酸与桂皮酸1决明子2斑蝥3安息香4牡丹皮5大黄6何首乌7 徐长卿,A.游离蒽醌衍生物B.苯甲酸和桂皮酸C.小檗碱D.桂皮醛E.莨菪碱1 药材粉末微量升华,得梭针状结晶,加碱液显红色,它检查2 药材粉末滴加95%乙醇和30%硝酸,镜下产生针簇状结晶。它检查3 药材粉末微量升华，得针状，针簇状和棒状结晶，香气浓。它检查4 粉末的氯仿提取物加10%盐酸苯肼，镜检可见杆状结晶。它检查5 粉末的氨性乙醚提取物加KII2试液，镜下呈黄紫色，飞鸟状结晶。它检查,四、薄层色谱鉴别法Thin Layer Chromatography （TLC）,色谱过程是组分分子在流动相和固定相间多次“分配”的过程。,（一）概述,1、定义 基于相同物质在同一的色谱条件下，表现出相同的色谱行为这一基本规律，将供试品和对照物同板、同法点样、展开、干燥、显色后，对比分析所得供试品与对照物的色谱图，对药品进行定性鉴别。,2、特点,(1) 简便快速(数十秒数十分钟)(2) 广泛适用性(3)分离效率高(多柱路)用毕一次弃去，可直接用样品的粗提物点样(4) 色谱后衍生的灵活性、专属性(5) 分析结果直观性,系统适用性试验(05版药典新增) 检测灵敏度 主要用于限量检查. 分离度 用于限量检查和含量测定时，要求定量峰与相邻峰之间有较好的分离度，除另有规定外，分离度R=2(d2-d1)/（W1+W2）应大于1.0。 重复性 主要用于含量测定.即同一供试品溶液在同一块薄层板上平行点样的待测成分的峰面积测量值的相对标准偏差(RSD)应不大于3.0%；需显色后测量的相对标准偏差应不大于5.0%。,3.对照物（对照品、对照药材、对照提取物（2010版16个）的设置方式 设置一种或数种对照品 设置一种或数种对照药材 设置对照提取物 同时设置对照品和对照药材(“双对照”),提取方法：甲醇提取薄层板：硅胶G+0.5%NaOH展开剂： 甲苯-乙酸乙酯-甲酸（15:2:1）检测波长：365nm,1 2 3 4 5 6,1 大黄素2 大黄素甲醚3-4 何首乌对照药材5-6 首乌丸,首乌丸薄层色谱鉴别,TLC已广泛用于中药材及其制剂的检验，成为中药鉴别的重要方法和鲜明特色。 中国药典大多数品种采用硅胶薄层色谱法，少数使用聚酰胺薄层色谱法和氧化铝色谱法。 薄层色谱法还可用于药品的杂质检查和含量测定。,4、供试液的制备,分散溶剂提取法（单一、分段）液液萃取法固液萃取法,一捻金中人参二醇和人参三醇的鉴别,左：稀酸水解后氯仿萃取，受大黄中成分的干扰， 无法辨认人参二醇和人参三醇。右：氧化铝小柱,（1）展开剂待测成分斑点Rf = 0.3-0.7,与相邻成分分离度大于1单一溶剂极性顺序,5、影响TLC的主要因素,选择展开剂的方法三角形法,将要被分离的物质的溶液间隔地点在薄层板上，用吸满不同展开剂的毛细管点到不同样品点的中心，借毛细管作用，展开溶剂从圆心向外扩展，这样就出现了不同的圆心色谱,选择展开剂的方法微量圆环法,洗脱能力,流动相分子与组分分子竞争占据吸附剂表面活性中心的过程。流动性极性增加，占据吸附剂表面活性中心能力 ，洗脱力,强,强,复合溶剂系统,占比例大（底剂）：极性相对小，溶解物质和基本分离；占比例小（极性调节剂）：极性相对大，有较强洗脱力，但不能提高分辨率；适量中等极性的溶剂：有利于不相溶解的溶剂混合，并可降低展开剂的粘度，提高展开速度；展开剂中加入少量酸或碱（拖尾抑制剂）可抑制某些斑点的拖尾，利于弱酸、弱碱性物质的分离。,提取方法：甲醇提取薄层板：硅胶G+0.5%NaOH展开剂： 甲苯-乙酸乙酯-甲酸（15:2:1）检测波长：365nm,1 2 3 4 5 6,1 大黄素2 大黄素甲醚3-4 何首乌对照药材5-6 首乌丸,首乌丸薄层色谱鉴别,万氏牛黄清心丸中黄连的鉴别,黄连对照药材50mg，加甲醇10ml，置水浴上加热回流15分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为对照药材溶液。另取再取盐酸小檗碱对照品，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。,照薄层色谱法（附录B）试验，吸取含量测定项下备用溶液及上述两种溶液各2l，分别点于同一硅胶G薄层板上，以苯醋酸乙酯甲醇异丙醇浓氨试液（12:6:3:3:1）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同的黄色荧光斑点。,取该品3g，加乙醚15ml，研磨，弃去乙醚。残渣挥干乙醚，加醋酸乙酯30ml，加热回流提取1小时，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇3ml使溶解，滤过，滤液作为供试品溶液。另取栀子苷对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（附录B）试验，吸取上述两种溶液各5l，分别点于同一硅胶G薄层板上，以醋酸乙酯丙酮甲酸水（10:7:2:0.5）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105加热约10分钟。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。,万氏牛黄清心丸中栀子的鉴别,注意,多元展开剂能反复使用吗？每次展开后，展开剂组分的比例由于挥发或被固定相选择性地吸附必然会改变。展开剂可以一次配制很多，方便随时取用吗？应在使用前新鲜配制，特别是含低沸点溶剂时尤为重要，以避免组分挥发而引起的比例变化。,（2）相对湿度,硅胶的硅醇基以氢键形式优先吸附水，物理吸附使硅胶的活度降低，影响了弱极性物质的吸附，湿度增大，化合物的Rf值相应地 。在相对湿度50%-60%时，平衡后的硅胶含水量约13%，多数情况下，是适用的。,增大,厚朴中厚朴酚及和厚朴酚的鉴别,万应锭(左图：湿度32，右图：70),不同湿度对苍术正己烷提取物薄层行为的影响,展开时的最佳相对湿度范围决定于溶质和溶剂的极性，随溶质和溶剂极性的增加相对湿度的范围也相应地增大。原因：展开室中展开剂蒸气有取代吸附在薄层上水分子的趋势。苯：适宜的相对湿度范围很窄乙醚：相对湿度在20%-50% 氯仿-异丙醇-25%氨水（45:45:10）：相对湿度在20%-80%,解决办法：,A.记录相对湿度B.控制相对湿度a 硫酸溶液法b 无机盐溶液法c 用另一块玻璃板盖在活化后的薄层上，只有原点区露出以便点样。,（3）温度,RH恒定的情况下，一般在较高温度展开时，Rf值较高。一般来说温度变化在5， Rf值变化一般不会超过0.02。温度首先影响各有机溶剂的蒸发程度，影响了展开槽中各蒸气比例，故影响到被分离物质的层析行为。其次，温度的变化影响了含水展开剂两相的溶解度，改变了溶剂的比例。,三七总皂苷的薄层鉴别,常温展开三七皂苷R1与人参皂苷分不开，低于10可以分开,补充：溶剂蒸气,薄层色谱与柱色谱的区别之一就是溶剂的蒸气相在展开箱中也参与色谱展开而形成三维的层析过程。展开箱的气体空间在层析过程中起着重要的作用。,展开室饱和 是指展开前及展开中溶剂系统中所有组分在整个气体空间达到平衡，即达到饱和状态。预吸附 指薄层板的干燥板面（即未被溶剂湿润的部分）对展开室空间气体分子的吸附，即预饱和。吸附饱和 是指薄层板未被溶剂湿润的部分与展开室的饱和气体空间达到平衡状态，即“完全饱和”，这是预吸附的极限状态。毛细管饱和 指薄层板所有的自由空隙借毛细管作用被溶剂充满的过程，即相当于展开后薄层的状态。,边缘效应(未饱和的展开室中展开 ),在展开过程中极性较弱和沸点较低的溶剂在薄层的边缘较易挥发，因此边缘部分的展开剂中极性溶剂的比例增大，Rf值相应增大。,脱混(未饱和的展开室中展开 ),用两种或多种极性相差很大的溶剂组成的展开剂时，由于吸附剂对不同极性溶剂产生不同的吸附作用，形成展开剂组分的浓度梯度，当溶剂完全分离时，往往在薄层板上出现第二个溶剂前缘。,预吸附和吸附饱和,吸附剂表面的空间是很有限的，当用多组分溶剂展开时，不同溶剂分子在吸附区相互竞争，如硅胶是亲水性吸附剂，它首先对溶剂组分中的极性分子有更大的亲和力，所以在吸附平衡过程中，被吸附的各组分的浓度比与气体空间的很不相同，与溶剂的液相组成差别更大。因此在未饱和的情况下展开过程是很复杂的。,常规的平底展开箱在展开前较难达到展开箱饱和，所以普通的做法是在内壁加贴与之等宽等高的用溶剂湿润的滤纸有助于达到饱和。用双槽展开箱在其一侧槽中加溶剂可以较容易地达到吸附饱和及展开箱饱和。,人参及西洋参的薄层鉴别,操作者的熟练程度,不合格的手铺自制板,新鲜溶剂与多次开瓶使用后的溶剂,（二）仪器与材料,1、薄层板：市售薄层板（亦称预制薄层板）（1）硅胶：微酸性极性固定相，适用于酸性、中性物质分离（可制备成酸性不同或碱性硅胶扩大使用范围）。（2）氧化铝：碱性极性固定相，适用于碱性、中性物质分离（可制备成中性或酸性氧化铝扩大使用范围）。（3）纤维素：含有羟基的极性固定相，适用于分类亲水性物质。（4）聚酰胺：含有酰胺基极性固定相，适用于酚类、醇类化合物的分离。,自制薄层板 最常用的固定相有硅胶G、硅胶GF254、硅胶H、硅胶HF254等。其颗粒大小，一般要求直径为1040m。薄层板采用湿法制备，即使用涂布器（铺板器）将制好的固定相糊均匀涂布于玻板上。,倾注法,2.点样器材（定量点样）,定容毛细管（微升毛细管） 微量注射器 点样器,3.展开容器,专用展开缸 水平式 直立式： 平底式 上行展开 双槽式双槽展开缸具有节省溶剂、便于预平衡、可控制展开箱内的湿度等优点。展开缸盖子应能密闭，体积应与薄层板大小相适应。,全自动点样仪,手动点样仪,微升毛细管,双槽展开缸,4.显色（检视）装置喷雾显色应使用玻璃喷雾瓶或专用喷雾器，要求用压缩气体使显色剂呈均匀雾状喷出；浸渍显色可用专用玻璃器皿或适宜的展开缸做为浸渍槽；蒸气熏蒸显色可在双槽展开缸或大小适宜的干燥器中进行； 荧光检视装置为装有可见光、254nm及365nm紫外光源和相应滤光片的暗箱，可附加摄像设备供拍照图像用，暗箱内光源应有足够的光照度。,喷雾显色,荧光显色,（三）操作步骤1、薄层板制备 （1）市售薄层板 临用前一般应在110活化30分钟。 （2）自制薄层板 1份固定相和3份水（或0.20.5羧甲基纤维素钠水溶液），在110活化30分钟，立即置干燥器中备用。薄层板一般要求新鲜制备，当天使用。使用前应在反射光及透射光下检查质量，若板面不均匀、不平整或有麻点、有气泡、有破损及污染等情况，应弃去不用。,2、供试品溶液、对照物的选择及对照品溶液的制备,TLC分离能力有限，需对样品进行必要的提取、分离和净化。按供试品溶液的制法，制备对照品溶液,万应锭（清热，镇惊，解毒 ）,供试液制备：取本品6 g,研碎,加甲醇20ml，置水浴上温浸1小时，滤过，取滤液1Oml，蒸干，残渣加20%氢氧化钠溶液5ml置水浴中加热水解8小时，放冷，加水1Oml，用醋酸乙酯提取两次，每次20ml水液加盐酸调节至pH23，用乙醚提取2次，每次30ml，合并乙醚液，挥干，残渣加甲醇溶解，使成1 ml，作为供试品溶液。对照液制备：取熊去氧胆酸，鹅去氧胆酸*，胆酸，去氧胆酸，猪去氧胆酸对照品，加甲醇制成每1ml各含lmg的溶液，作为对照品溶液。,薄 层 板：硅胶G自制板，长20cm；厚度：500um点 样：供试品溶液与对照品溶液分别点样24 ul展 开 剂：异辛烷一醋酸乙酯一冰醋酸(15：7：5)展 开方 式：展开箱用展开剂预平衡15分钟，上行展开：展距：16一18cm显 色：喷以硫酸乙醇溶液(1 -10）在110加热数分钟，至斑点显色清晰。置紫外光灯(365nm)下检视。色 谱识别：供试品色谱中，分别在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。注 意事 项：尽量在低温及低相对湿度(40%以下)下展开。,1-3、万应锭 4、万应锭（水解后酸化前醋酸乙酯提取部分） 5、混合胆酸对照（胆酸（S1）+猪去氧胆酸（S2）+熊去氧胆酸（S3）+鹅去氧胆酸（S4）+去氧胆酸（S5） 6、熊去氧胆酸,本图谱所用的展开剂容易脱混，而使色谱上部部分斑点挤压，且产生第二溶剂前沿，但不影响鉴别。,2、点样1.供试品溶液的制备 采用浸渍法、回流以及超声等方法提取，液液萃取法或固液萃取法进行精制。2.原点的点加（圆点状或窄细的条带状）原点基线距板底边1015mm，圆点状原点直径一般不大于3mm；条带状的宽度一般为510mm。原点间距离一般不少于8mm，毛细管接触点样时应少量多次点加，才能保证原点小而圆。,自动点样设备进行带状点样P77,样品溶液体积大、浓度稀 使用时样品溶液吸在微量注射器中，点样器不接触薄层，而是用氮气将注射器针尖的溶液吹落在薄层上，薄层板在针头下定速移动点宽5-10mm的窄带。带状点样展开后的斑点不仅分辨率明显高于点状点样，而且精密准确，为定量分析提供最佳条件。,原点起始线,5mm,8mm,815cm,11.5cm,溶剂前沿,展开剂液面,原点,（展开距离）,(点样位置),3、展开 一般采用上行一次展开。必要时可进行二次展开或双向展开。 Eg：益气养血口服液中陈皮的薄层鉴别即采用二次展开，先以乙酸乙酯甲醇水吡啶（10017135）展至3cm，取出晾干；再以甲苯乙酸乙酯甲醇水（201011上层）展至8cm，取出晾干。,双向展开,在两个垂直的方向上进行展开。将样品点在薄层板的一个角上，展开适当距离后，挥干溶剂，再将薄层板以与原展开方向成90 的方向进行展开。,展开前一般需用展开剂对展开缸进行预平衡，即使缸内展开剂气液两相达到动态平衡，该过程亦称“饱和”。为此可在展开缸内加入适量展开剂，密闭，保持1530分钟。预平衡后，迅速将薄层板放入展开缸中，立即密闭，展开。若薄层板需同时预平衡，可将点样后的薄层板放入双槽展开缸的一侧槽中，另一侧槽中加入展开剂，如上法预平衡后，再将展开剂移入放有薄层板的槽中，展开。展开剂配制后若分层，则应按要求放置分层后取需要的一相（上层或下层）使用。,4、显色与检视 1）有颜色的可在日光下检视 2）无色或浅色的成分多用喷雾法或浸渍法以适宜的显色剂显色，或再加热使之显色，在日光下检视。 3）有荧光的物质或遇某些试剂可激发荧光的物质可在紫外灯（365nm）下观察荧光色谱。 4）有的成分可用试剂的蒸气（如碘蒸气、氨蒸气）熏蒸显色。 5）某些无色有紫外吸收且不产生荧光的成分可用荧光淬灭法显色。,即在含有荧光剂的硅胶板（如硅胶GF254板），在紫外光灯（254nm）下观察板面上该成分形成的荧光淬灭色谱。,如艾附暖宫丸中香附的鉴别，被检成分香附酮在硅胶GF254板的黄绿色荧光背景下呈深蓝色斑点。,5、记录可采用摄像设备或扫描仪记录相应的色谱图。6、结果判断 供试品色谱在与对照品、对照药材或对照提取物色谱的相应的位置上，显相同颜色或荧光的斑点，则判为符合规定。,薄层色谱的扫描定性鉴别,展开后的薄层色谱，在适宜条件下，使用薄层扫描仪扫描。即以各斑点在薄层板上的位置为横坐标，以斑点对光的吸收强度或发射荧光的强度为纵坐标，将各色斑转换成峰形曲线图谱。经对照比较所得供试品、对照品、阳性对照或阴性对照等各溶液所得扫描图谱中各峰的有无、相对位置和峰高，可以得到可供鉴别的信息和依据。,表 2010年版中国药典新增中药制剂鉴别项目情况,中国药典(2005)新增中成药(116种)鉴别方法,五、紫外-可见分光光度法,（一）概述 定义：某些中药或中成药经适当处理后，所得紫外吸收光谱是由其各组分的特征吸收叠加而成的。若将中药制剂作为一个特定的整体，在一定测试条件