水杨酸及其衍生物对溶菌酶光敏损伤的保护作用分析

第17卷第1期 2012年1月 集美大学学报(自然科学版) Journal of Jimei University(Natural Science) V0117 No1 Jan2011 文章编号10077405(2012)01-0020-06 水杨酸及其衍生物对溶菌酶光敏损伤的保护作用分析 鲍小丹，马建华 (集美大学生物工程学院，福建厦门361021) 摘要利用十二烷基磺酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)，研究了365 nm紫外照射弓I发蒽 醌一2一磺酸钠(AQS)、溶菌酶(Lysozyme)和水杨酸及其衍生物(水杨醛、水杨酸甲酯)水溶液体系的 光化学反应效应及影响因子结果表明：AQS能够造成Lyso的光敏损伤，且损伤程度随AQS浓度增加及 光照时间的延长而加剧；水杨酸及其衍生物对Lyso的光敏损伤具有显著的保护作用，其保护效果与水杨酸 及其衍生物的浓度呈正相关；以抗坏血酸(Vc)作为对照，相同条件下，其保护效果依次为：水杨酸一水 杨醛Vc水杨酸甲酯 关键词蒽醌一2一磺酸钠；溶菌酶；光敏损伤；SDSPAGE；水杨酸；衍生物 中图分类号O 62531 文献标志码A Analysis of Protective Action of Salicylic Acid and Its Ramification on Photooxidation Damaged to Lysozyme BAO Xiaodan，MA Jianhua (School of Biotechnology Engineering，Jimei University，Xiamen 361021，China) Abstract：The photochemical reactions and their influence between anthraquinone-2一sulfonic acid (AQS)，lysozyme，salicylic acid and its ramification by irradiation under 365 nm were investigated using SO dium dodecyl sulfatepolyaerylamide gel electrophoresis(SDSPAGE)The results showed that lysozyme was photooxidated by AQS，and the damage was dependent on the concentration of AQS as well as the UV treat ment timeSalicylic acid and its ramification could significantly protect the photooxidation of lysozyme，and the protective effect had positive correlation with their concentrationCompared with ascorbic acid(Vc)， the efficiency of protection was successively as followssalicylic acidsalicyl aldehydeVcmethyl salicy late Key words：AQS；lysozyme；photooxidation；SDSPAGE；salicylic acid；ramification O 引言 水杨酸(Salicylic acid，SA)是植物体内产生的一种简单酚类化合物，也是植物组织中的一种天 然活性物质研究认为，水杨酸是激活植物过敏反应和系统获得性抗性的内源信号分子，并在植物的 抗病、抗低温、抗旱、抗盐和抗紫外线等抗逆反应中发挥诱导作用 引水杨酸甲酯(Methyl salicy一 收稿日期2011一o51O 修回日期20110624 基金项目福建省自然科学基金资助项目(2009J01032)；厦门市集美区科技计划项目(350211Z20092C01)； 集美大学创新研究团队专项基金资助项目(2010A007) 作者简介鲍小丹(1985一)，女，硕士生，从事食品科学方向研究通讯作者：马建华(1956一)，女，教 授，从事食品化学方向研究，E-mail：jianhuam1957126eom 第1期 鲍小丹，等：水杨酸及其衍生物对溶菌酶光敏损伤的保护作用分析 2l late)和水杨醛(Salicyl aldehyde)作为水杨酸的衍生物对植物的防御机制也有重要的作用 植物 对非生物逆境耐受能力的提高源于外源性水杨酸对抗氧化酶活性的调节作用 J此外，水杨酸及其 衍生物作为一种酚类化合物，其本身对自由基侵害有一定的防御能力马建华 研究认为，水杨酸 甲酯能快速有效地清除羟基自由基黄娟【1刚研究表明，在水溶液和微乳液体系中水杨酸及水杨酸甲 酯能有效地清除单线态氧及阻断对亚硝胺的合成作用 蒽醌及其衍生物历来被用作强光敏剂的模型化合物卜 J而且，有蒽醌及其衍生物对DNA光敏 损伤的相关研究：马建华等-l 用激光光解研究了蒽醌一2一磺酸钠(AQS)与高聚鸟嘌呤核苷酸的相 互作用，并阐明了反应机理；刘玉侠等u 用不同取代基的蒽醌衍生物与G一四联体进行作用，揭示 了不同的光敏损伤机制；陈年友等-I 用合成的卟啉一蒽醌类衍生物对DNA进行断裂，效果明显但 蒽及其衍生物对蛋白质光敏损伤的研究报道则很少，尤其利用水杨酸及其衍生物拮抗或消除以AQS 对蛋白质光敏损伤的研究目前未见相关报道本文以Lyso为模型蛋白质，以AQS为光敏剂，利用 SDSPAGE研究了365 nm紫外光照条件引发AQS对Lyso的光敏损伤作用，并研究了水杨酸及其衍 生物对Lyso光敏损伤的保护作用 1材料与方法 11仪器与试剂 ZF一20C紫外灯(上海宝山顾村电光仪器厂，中国)；垂直电泳槽MiniPill(BioRAD，美 国)；凝胶成像仪G：BOX(Syngene公司，英国)；紫外分光光度计Cary50(瓦里安公司，美国) 水杨酸、水杨酸甲酯、水杨醛均为分析纯；溶菌酶(Lyso)，分子质量为144 ku，Fluka公司产 品；实验溶液采用超纯水配制 12方法 样品经ZF一20C紫外灯(365 rim)辐射处理后进行SDSPAGE实验用MiniPIII跑电泳，电 泳结束后用质量分数为025的考马斯亮蓝G一250染色，经脱色液(3O甲醇一10乙酸(体积分 数)脱色后，用G：BOX成像并分析结果用紫外光谱仪Cary50扫描，扫描速度为24 000 iinmin， 狭缝宽度为500 nlll，扫描时间0012 5 s ，)多士甲 厶皇口木 21光照波长的选定 图1为测得的AQS和Lyso水溶液的紫外吸收 光谱图由图1可见，Lys0在300 nnl以上几乎无 吸收为了排除紫外光照射对Lyso的影响，保证 Lyso的光敏损伤均由AQS引起，本实验选用了波 长为365IlTI的紫外光进行照射 22 Lyso最适电泳浓度的选择 图2为不同浓度Lyso水溶液的SDSPAGE 电泳图由图2可以看出，Lyso是纯的蛋白质， 其分子质量为l44 ku随着Lyso浓度的降低， 产生的条带逐渐变浅考虑到最佳浓度效果，选 用第二条带(25 X 10一molL )的Lyso浓度 进行后续蛋白质电泳实验 23不同浓度AQS对Lyso光敏损伤的影响 图3为2510一molL 的Lyso及不同浓 200 250 300 350 400 450 500 Arim 图1 AQS和Lyso水溶液的紫外一可见光谱 Fig1 The UV-visible absorption spectra of AQS and Lyso aqueous solution 22 集美大学学报(自然科学版) 第l7卷 度AQS的混合溶液置于空气中，在365 nll波长下光照80 min后得到的电泳图由图3可以看出，当 AQS达到13 X 10molL 时，Lyso在2328 ku处开始出现较大分子质量的蛋白质片段，该片段 约是Lyso分子质量的2倍，说明该蛋白质片段为二聚产物当AQS达到I010一molL (即 AQS和Lyso的浓度比为4)时，在3537 ku处出现第三条条带，其分子质量近似为Lyso分子质量 的25倍，并随AQS浓度的增加，其强度继续增强表明，随着AQS浓度的增加，Lyso的损伤加剧， 且除了蛋白质的交联反应外，还发生了蛋白质的断裂，断裂的小分子继续与二聚体反应生成分子质量 为3537 ku的产物 ku 116 66 45 35 25 18 14 说明：M-Marker；19一Lyso溶液其浓度分别为5x10 25xlO，125x10,625x10 ，312xlO ，156x10 moL一 说明：MMarke ；C一对照组；16一AQS，其浓度分别为 0，13x10,27x10 ，53xlO ，10xl0，20xl0 toolL Notes：M-Marker；19-Lyso solutions，their concentrations are 5xlO_4， N0tes：MMarker；CC0ntr0l；16一AQS，their concentrations are 0， 25x10 ，125x10,625x10-5,312xlO ，15610 toolL 13xlO,27xlO,53xlO 10x10-320xl0too1L一 圈2不同浓度的Lyso溶液凝胶m_llt 图3不同浓度AQS对Lyso光敏损伤的凝胶电泳图 Fig2 Gel electrophoresis pattern presents different Fig3 Gel electrophoresis pattern presents the effect of cOncentraliOns of Lyso solution different concentrations of AQS on the photodamage of Lyso 24不同光照时间对Lyso光敏损伤的影响 图4为2510toolL Lyso和20 X 10一molL AQS的混合溶液光照不同时间 后的SDSPAGE电泳图由图4可知，光照 10 min后即在2328 ku处出现第二条条带， 光照40 min后开始在3537 ku处出现第三条 条带，且随光照时间的延长损伤的条带越来越 明显，至80100 min时损伤条带清晰可见， 但没有出现更多的条带结果表明，随着光照 时间延长，AQS对Lyso的光敏损伤加剧，结 果与AQS的浓度变化对Lyso的光敏损伤类似 紫外光照时间的延长会产生更多的AQS，激发 三重态，引发光氧化反应，并加剧Lyso的光 敏损伤但是AQS与Lyso可能以某一固定方 式结合并相互作用，从而使Lyso有相同的交 联和断裂位点，表现在2328 ku和35 37 ku处出现条带 25水杨酸及其衍生物对Lyso光敏损伤的保 护作用 说明：MMarker；C一对照组；1725xl0 molL LySO和 20xl0。molL- AQS混合溶液，其光照时间分别为0，10，20， 40，60，80，100 min Notes：MMarker：CContr0l：1725xlO_4moL-LySO and 20xl0。molLAQS mixed solutions，their light time is 0，10，20，40，60，80， 100 minutes 图4光照不同时间时AQS对Lyso光敏损伤的凝胶电泳图 Fig4 Gel electrophoresis pattern presents the effect of ir- radiation time Off the photodamage of Lyso aroused by AQS 251 Vc和水杨酸及其衍生物水溶液的紫外一可见吸收光谱 0 2 O O O 4 4 M O 2 0 0 O 4 4 H 第1期 鲍小丹，等：水杨酸及其衍生物对溶菌酶光敏损伤的保护作用分析 23 10toolL )的混合溶液中，光照100 rain Mnm 后，所得到的SDSPAGE电泳结果如图6一图8 图5各个水溶液的紫外一可见吸光谱 所示由图6一图8可知，加入较高浓度的水杨酸 Fig5 The UV-visible absorption spectra of 或水杨醛后，2328 ku和35 37 ku处的条带强 d 竹e maqueoussoIuton 度明显减弱，且随着抗氧化剂浓度的降低，条带变得越来越明显而较高浓度的水杨酸甲酯却对条带 的减弱影响不大(见图7)这表明，加入一定浓度的水杨酸、水杨醛能有效地降低AQS对Lyso的光敏 损伤，而水杨酸甲酯对Lyso光敏损伤的拮抗效果则较弱 253水杨酸及其衍生物对Lyso光敏损伤保护能力比较 为了确定水杨酸及其衍生物对AQS光敏损伤Lyso保护作用的强弱，以Vc为对照，进行对比实 验图9为相同浓度的水杨酸及其衍生物(20 X 10molL-1)分别加入到Lyso和AQS混合溶液 中的电泳图由图9可知，水杨酸及其衍生物对Lyso的光敏损伤保护效果不同，保护效果依次为： 水杨酸 水杨醛Vc水杨酸甲酯 说明：MMarker：C一对照组：12510 mo1LLySO； 2一无抗氧化剂：3725x10 molL- LySO， 10xl0。molL-AQS和水杨酸混合液，其浓度依次为 395xl0r。，19710 。49xlO。4 24xlO ，12x10-4 mo卜L Notes：MMarker；C-Control；125x10-4 toolL一Lyso：2一No an tioxidant；37一Mixed solution with 25x10-4molL- LySO 10103 molL一 AQS and different concentration of SA,whose concen trations are 395x100197x10-349x10-2410 12lO。4molL- 说明：MMarke ；C一对照组；125xlO molL- Lyso； 2一无抗氧化剂；3725xlO molLLyso，10xl0 molL- AQS和水杨酸甲酯混合液，其浓度依次为2OxlO ，1OxlO。， 625x10 125x10 molL- Notes：M-Marker；C-Control；1-25xlO molL一 Lyso：2一N0 antioxi dant；37-Mixed solution with 25xlO。molLLyso10xl0 molL AQS and different concentration of methyl salicylate，and their concentra tionsare20x10-3,1Oxl0-3,25xl 62510-5,125xl toolL- 图6水杨酸对AQS光敏损伤Lyso影响的凝胶电泳图 图7水杨酸甲酯对AQS光敏损伤Lyso影响的凝胶电泳图 Fig6 Gel electrophoresis pattern presents the effect of salicylic acid on the photodamage of Lyso aroused by AQS Fig7 Gel electrophoresis pattern presents the effect of methyl salicylate on the photodamage of Lyso aroused by AQS O 2 0 O O 4 4 _蚕 O2 0 0 O 4 4 一虿 M 24 集美大学学报(自然科学版) 第17卷 说明：M-Marker；C一对照组；125xl0 mo1LLySO； 2一无抗氧化剂；372510r4 molL- l Lyso，1OxlO-3 molI AQS和水杨醛的混合液，其浓度依次为2OxlO一，1OxlO ， 25x10-4,625x10-5125x10-5 mo1L Notes：M-Marker：CContr0l：12510-4 molLLyso；2-No an tioxidant；37一Mixed solutionwith 25x10-4mo1L- Lyo, 1OX10 molLAQS and ditfierent concentrations of saliicyl ahLde- hydeznd the salicyl aldehyde concentrations are 20x1010xl0 2510_4625xIf)-3125x10 mol 图8水杨醛对AQS光敏损伤Lyso影响的凝胶电泳图 Fig8 Gel electrophoresis pattern presents the effect of salicyl aldehyde on the photodamage of Lysoaroused byAQS 说明：M-Marker；C一对照组；125 xl0 molL Lys。；2一无抗氧化剂；36一抗氧化剂分别为水杨 酸，水杨酸甲酯，水杨醛，Vc Notes：M-Marker；C-Comrol；1-25xlO molL一 Lys0；2一No antioxidant；3-6-the antioxidants aFe salicylic acid，methyl sal- ieylate,salicyl aldehyde and Vc 图9不同抗氧化剂对AQS光敏损伤Lyso影响的 凝胶电泳图 Fig9 Gel electrophoresis pattern presents the effect of different antioxidants on the photodamage of Lyso aroused by AQS 3 讨论 Lyso是由129个氨基酸组成的单肽链蛋白酶，其结构高度稳定其中3个酪氨酸均位于分子的内 部，不易暴露在溶剂中，对稳定Lyso的结构有重要的作用Lyso有6个色氨酸，其中4个在酶分子 表层部位，其余2个位于Lyso的活性中心部位，参与Lyso的催化过程_】 实验结果显示，AQS在紫 外光照射下能光敏损伤LysoLyso在溶剂中，6个色氨酸都会不同程度地暴露出来，Lyso结构中最易 暴露的色氨酸残基是自由基攻击的主要目标之一l-l 在紫外光照射下，AQS激发三重态-l 与氨基酸 残基发生电子转移反应，产生的自由基使两个色氨酸残基之间成键，致使蛋白质发生交联反应随着 AQS浓度的增大及光照时间的延长，溶液中自由基浓度增大，促使蛋白质交联反应加剧除了色氨酸， Lyso中其他类型的氨基酸残基(如组氨酸、酪氨酸)也可能参与反应本实验出现了3537 ku位置 处的第三条电泳条带，说明AQS对Lys0光敏损伤不仅造成了Lyso交联而且还使其发生了断裂，断裂 的小分子片段与二聚体结合产生了更高分子质量的蛋白质片段 当AQS浓度为2010一molL， 光照时间为2 h时，Lyso已很明显发生损伤，出现2328 ku及3537 ku条带关于AQS光敏造成 Lyso的断裂位点还需进一步研究 本研究结果表明，水杨酸及其衍生物的加人使Lyso的光敏损伤明显减弱，并且保护的效果依次 为：水杨酸一水杨醛水杨酸甲酯水杨酸及其衍生物中，酚羟基与苯环属 共轭连结，其中水杨 酸的羧基和水杨醛的醛基为吸电子基团，苯环上的电子云向羧基或醛基偏移，苯环上电子云密度的减 小致使酚羟基上氧原子的电子云向苯环离域这样容易使水杨酸及水杨醛与AQS的三重激发态及活 性氧反应，失去酚羟基上的H，生成酚氧自由基从而有效减少了AQS三重激发态及活性氧对Lyso 的损伤，减轻甚至避免了蛋白质分子的交联及断裂同时水杨醛通过吸收少量紫外光，减少了Lys0 经紫外光照射引起光敏损伤相比而言，水杨酸甲酯的拮抗效果则相对较弱这可能是因为水杨酸甲 酯的酰氧基吸电子能力相对于羧基和醛基弱得多，这样使酚羟基上氧原子的电子云密度相对较大，不 易失去H形成酚氧自由基之故其详细的作用机制还有待进一步研究 0 2 O 0 0 4 4 0 2 0 O 0 4 4 第1期 鲍小丹，等：水杨酸及其衍生物对溶菌酶光敏损伤的保护作用分析 25 4 结论 365 nm紫外光能够引发AQS光敏损伤Lyso，导致肽键的交联和断裂；Lyso的损伤程度随AQS浓 度的增大而增大，随光照时间的延长而加剧；水杨酸、水杨酸甲酯、水杨醛均能有效保护AQS对 Lyso的光敏损伤，且随水杨酸及其衍生物浓度的升高其保护作用增强，其保护效果：水杨酸一水杨醛 水杨酸甲酯 参考文献 1孟雪娇，邸昆，丁国华水杨酸在植物体内的生理作用研究进展J中国农学通报，2010，26(15)：207214 2易小林，杨丙贤，宗学凤，等信号分子水杨酸减缓干旱胁迫对紫御谷光合和膜脂过氧化的副效应J生态 学报，2011，31(1)：67-74 3李亚，张钢，张玉星，等水杨酸对大叶黄杨茎抗寒性和电阻抗图谱参数的影响J生态学杂志，2010， 29(3)：460-466 4SAYYARI M，BABALAR M，KALANTARI S，et a1Vapour treatments with methyl salicylate or methyl jasmonate allevi ated chilling injury and enhanced antioxidant potential during postharvest storage of pomegranatesJ Food Chemistry， 2010，124(2011)：964970 5ERAsLAN F，INAL A，GUNES A，et a1Impact of exogenous salicylic acid on the growth，antioxidam activity and physiology of carrot plants subjected to combined salinity and boron toxicityJScientia Horticuhurae，2007，1 13(2)： 120128 6YUSUF M，HASAN S A，ALI B，ct a1Effect of salicylic acid on salinityinduced changes in Brassica unceaJ Journal of Integrative Plant Biology，2008，50(9)：1096