保护碱基添加总结.doc

学习资料收集于网络，仅供参考酶切位点保护碱基表6 酶寡核苷酸序列切割率%2 hr20 hrPvu ICCGATCGG ATCGATCGAT TCGCGATCGCGA0 10 00 25 10Sac ICGAGCTCG1010Sac IIGCCGCGGC TCCCCGCGGGGA0 500 90Sal IGTCGACGTCAAAAGGCCATAGCGGCCGC GCGTCGACGTCTTGGCCATAGCGGCCGCGG ACGCGTCGACGTCGGCCATAGCGGCCGCGGAA0 10 100 50 75Sca IGAGTACTC AAAAGTACTTTT10 7525 75Sma ICCCGGG CCCCGGGG CCCCCGGGGG TCCCCCGGGGGA0 0 10 9010 10 50 90Spe IGACTAGTC GGACTAGTCC CGGACTAGTCCG CTAGACTAGTCTAG10 10 0 090 90 50 50又说又笑 又高又大 又香又甜酶切位点保护碱基表2关键词： 酶切位点保护碱基表2 酶寡核苷酸序列切割率%弯弯的小河（月儿、小船） 有趣的问题 难忘的日子2 hr20 hr春天已经到了。 我已经写完作业了。Not I各种句式的掌握TTGCGGCCGCAA ATTTGCGGCCGCTTTA AAATATGCGGCCGCTATAAA ATAAGAATGCGGCCGCTAAACTAT AAGGAAAAAAGCGGCCGCAAAAGGAAAA弯弯的月亮像小船。 蓝蓝的天空像大海 。0 10 10 25 25天上有一架飞机。 水里有许多小鱼。0 10 10 90 90（5）小荷才露尖尖角，早有蜻蜓（立上头）。Nsi I弯弯的月亮像小船。 蓝蓝的天空像大海 。TGCATGCATGCA CCAATGCATTGGTTCTGCAGTT例：小鸟一边飞一边叫。10 9090 90Pac ITTAATTAA GTTAATTAAC CCTTAATTAAGG0 0 00 25 90Pme IGTTTAAAC GGTTTAAACC GGGTTTAAACCC AGCTTTGTTTAAACGGCGCGCCGG0 0 0 750 25 50 90Pst IGCTGCAGC TGCACTGCAGTGCA AACTGCAGAACCAATGCATTGG 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ICGGATCCGCGGGATCCCGCGCGGATCCGCG109090259090Bgl IICAGATCTGGAAGATCTTCGGAAGATCTTCC0752509090BssH IIGGCGCGCCAGGCGCGCCTTTGGCGCGCCAA00500090BstE IIGGGT(A/T)ACCC010BstX IAACTGCAGAACCAATGCATTGGAAAACTGCAGCCAATGCATTGGAACTGCAGAACCAATGCATTGGATGCAT0252505090Cla ICATCGATGGATCGATCCCATCGATGGCCCATCGATGGG009050009050EcoR IGGAATTCCCGGAATTCCGCCGGAATTCCGG909090909090Hae IIIGGGGCCCCAGCGGCCGCTTTGCGGCCGCAA909090909090Hind IIICAAGCTTGCCAAGCTTGGCCCAAGCTTGGG00100075Kpn IGGGTACCCGGGGTACCCCCGGGGTACCCCG0909009090Mlu IGACGCGTCCGACGCGTCG025050Nco ICCCATGGGCATGCCATGGCATG050075PCR引物设计原则信息来源：本站原创更新时间：2004-12-21 0:44:00 PCR引物设计的目的是为了找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。因此，引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。 要设计引物首先要找到DNA序列的保守区。同时应预测将要扩增的片段单链是否形成二级结构。如这个区域单链能形成二级结构，就要避开它。如这一段不能形成二级结构，那就可以在这一区域设计引物。现在可以在这一保守区域里设计一对引物。一般引物长度为1530碱基，扩增片段长度为100600碱基对。让我们先看看P1引物。一般引物序列中G+C含量一般为40%60%。而且四种碱基的分布最好随机。不要有聚嘌呤或聚嘧啶存在。否则P1引物设计的就不合理。应重新寻找区域设计引物。 同时引物之间也不能有互补性，一般一对引物间不应多于4个连续碱基的互补。 引物确定以后，可以对引物进行必要的修饰，例如可以在引物的5端加酶切位点序列；标记生物素、荧光素、地高辛等，这对扩增的特异性影响不大。但3端绝对不能进行任何修饰，因为引物的延伸是从3端开始的。这里还需提醒的是3端不要终止于密码子的第3位，因为密码子第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。 综上所述我们可以归纳十条PCR引物的设计原则： 引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。 产物不能形成二级结构。 引物长度一般在1530碱基之间。 G+C含量在40%60%之间。 碱基要随机分布。 引物自身不能有连续4个碱基的互补。 引物之间不能有连续4个碱基的互补。 引物5端可以修饰。 引物3端不可修饰。 引物3端要避开密码子的第3位。 PCR引物设计的目的是找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。如前述，引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。对引物的设计不可能有一种包罗万象的规则确保PCR的成功，但遵循某些原则，则有助于引物的设计。1.引物的特异性引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源。2.避开产物的二级结构区某些引物无效的主要原因是引物重复区DNA二级结构的影响，选择扩增片段时最好避开二级结构区域。用有关计算机软件可以预测估计mRNA的稳定二级结构，有助于选择模板。实验表明，待扩区域自由能（G）小于58.6lkJ/mol时，扩增往往不能成功。若不能避开这一区域时，用7-deaza-2-脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的。3.长度寡核苷酸引物长度为1530bp，一般为2027mer。引物的有效长度：Ln=2（G+C）+（A+T+，Ln值不能大于38，因为38时，最适延伸温度会超过Taq DNA聚合酶的最适温度（74),不能保证产物的特异性。4.G+C含量G+C含量一般为40%60%。其Tm值是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度，有效启动温度，一般高于Tm值510。若按公式Tm=4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为5580，其Tm值最好接近72以使复性条件最佳。5.碱基础随机分布引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在G+C富集序列区错误引发。6.引物自身引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹状结构牙引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。若用人工判断，引物自身连续互补碱基不能大于3bp。7.引物之间两引物之间不应不互补性，尤应避免3端的互补重叠以防引物二聚体的形成。一对引物间不应多于4个连续碱基的同源性或互补性。8.引物的3端引物的延伸是从3端开始的，不能进行任何修饰。3端也不能有形成任何二级结构可能，除在特殊的PCR（AS-PCR）反应中，引物3端不能发生错配。在标准PCR反应体系中，用2U Taq DNA聚合酶和800mol/L dNTP（四种dNTP各200mol/L）以质粒（103拷贝）为模板，按95，25s；55，25s；72，1min的循环参数扩增HIV-1 gag基因区的条件下，引物3端错配对扩增产物的影响是有一定规律的。AA错配使产量下降至1/20，AG和CC错七下降至1/100。引物A：模板G与引物G：模板A错配对PCR影响是等同的。9.引物的5端引物的5端限定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA序列；引入突变位点、插入与缺失突变序列和引入一启动子序列等。10.密码子的简并如扩增编码区域，引物3端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增特异性与效率。特殊目的的引物设计将在有关章节讨论。随着人们对引物的认识，一些引物的计算机设计程序也应运而生，下面将讨论有关引物计算机设计方法。 PCR参数设定的基本原则 PCR知识 一个PCR反应开始，首先是双链DNA解离为单链，使之有利于与引物结合过程可以通过加热来完成。在9095条件下，即使复杂的DNA分子，如人基因组DNA也可变性成单链，根据模板DNA复杂程度，可以调整变性温度和时间。一般情况下选择94C、30s可使各种复杂DNA分子完全变性。过高温度或持续时间过长，对TaqDNA聚合酶活性和dNTP分子都会造成损害。变性后的DNA很快冷却至4060，即可使引物和模板DNA发生结合。这是由于模板DNA结构比引物复杂得多，引物和模板之间碰撞的机会大大高于模板互补链之间的碰撞。复性温度的选择，可以根据引物的长度和其G-+-C含量确定。引物长度为1525bp时，退火温度可通过Tm4X(G+C)+2X (Ad-T)计算得到。在Tm允许的温度范围内，选择较高的退火温度可大大减少引物和模板之间的非特异结合，提高PCR的特异性。退火时间设置为30s，足以使引物和模板之间完全结合。PCR反应的延伸温度为7075，此时，TaqDNA聚合酶具有最高活性。引物在16个核苷酸以下时，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。可采用反应温度缓慢升高到