使用RNAscope-技术探索-HBV-DNA--cccDNA以及mRNA-在肝组织中的分布.docx

使用RNAscope 技术探索 HBV DNA， cccDNA以及mRNA 在肝组织中的分布简介HBV的感染侵入病人体内细胞后，其内含的HBV-DNA脱离包裹的蛋白质被释放形成rcDNA，依赖宿主的DNA聚合酶补齐形成更加稳定的cccDNA，并以cccDNA作为模板转录出不同大小的mRNA，作为各种抗原蛋白以及HBV-DNA的逆转录模板。基于各类核酸不同但同样重要的作用，本项目旨在用一种新型的RNA ISH技术RNAscope来标定HBV-DNA，cccDNA，mRNA，探索各类核酸在乙肝病人组织中的差异分布，并比较在乙肝病人四个发展阶段（immunotolerant, immune active, inactive carrier, and HBeAg-negative hepatitis）的不同变化，以及INF治疗效果不同病人之间的差异变化。本项目有助于我们进一步了解HBV传播的机制，为HBV的治疗提供指导。背景HBV cccDNA的形成HBV 侵入人的肝细胞 ,在细胞质中脱去核壳 ,形成 rcDNA。rcDNA 进入肝细胞核中解脱正链 3端连接的末端蛋白、负链 5端的 RNA 残段 （图一） ;依赖宿主细胞的 DNA 聚合酶补齐两条链上的缺口 ,并进一步折叠、扭曲形成超螺旋结构的 cccDNA ,并以 cccDNA 为模板转录为不同大小的 mRNA ( 3.5Kb、 2.4Kb、2.1Kb、0.8Kb mRNA) ,从而翻译各种病毒蛋白。其中 3,5 Kb 的 pgRNA 作为逆转录模板 ,利用病毒的逆转录酶合成全长的基因组负链 DNA ,再以负链 DNA 作为模板 ,通过病毒 DNA 聚合酶的作用 ,合成正链 DNA , 与负链 DNA 一起组成新的HBV rcDNA。新合成的 HBV rcDNA 一方面进入细胞核内 ,转化为新的 cccDNA ,补充细胞内的 cccD2 NA 库 ,使每个肝细胞中保持大约 550 个 cccDNA分子 ;另一方面与病毒蛋白装配成新的完整 HBV ,释放至细胞外 ,再感染健康的肝细胞 (见图 1) 1。In HBV genome, the incomplete plus strand has a variable 3-end but a defined 5-end around position 1600 near DR2, while the complete minus strand has defined 5- and 3-ends with a terminal redundancy of 9 bases 27. There is a gap around position 1800 near DR1 (Fig. 1).图一HBV基因组结构。HBV基因组有部分单链，部分双链，以及部分的三DNA链在病毒粒子中。各HBV正义链的长度会有很大的不同，但是负义链有固定的5 -和3 -端靠近1800左右的位置。圆圈，引物酶；钻石圈，DNA聚合酶。2. 传统HBV cccDNA 的常用检测方法根据cccDNA与rcDNA在结构和理化特性上的不同 ,可以建立检测 cccDNA 的方法 : (1) rcDNA能与蛋白质共价结合 ,cccDNA 则不能。(2) rcDNA的双链是不对称的 ,全长的一链与病毒 mRNA 互补 ,为负链 ,较短的一链为正链。在正链和负链上均存在缺口 ,两链 DNA 通过 5端 250300 个互补碱基的氢键作用形成部分环状结构 ,而非超螺旋结构 ; cccDNA 的两条链均是完整的 , 形成超螺旋结构。(3) 由于正链和负链上均有缺口存在 ,rcDNA 可以被一些能够切除单链或含有缺口 DNA 的核酸酶如Plasmid2Safe TM A TP2dependent DNase、绿豆核酸酶(mung bean nuclease) 等降解成寡核苷酸或单核苷酸 ,而 cccDNA 则由于双链结构完整 ,不会被上述酶降解2,3。(一) Southern blotHBV cccDNA 以往多用 Southern blot 方法进行检测 ,该方法是分子生物学的经典方法 ,但对操作者的技术要求较高 ,且步骤繁琐 ,灵敏度较低4。图二 Primer selection. PCR was performed to select primer pairs which can specically amplify DNA fragment from HBV cccDNA but not genomic DNA in the PCR. The 106 copies of cccDNA from a plasmid containing HBV genome were used as template in lane 1, 2, 3, 7, 8, 9, 13, 14, and 15; while 1.6106 copies of virus DNA isolated from HepAD38 condition medium were used as template in lane 4, 5, 6, 10, 11, 12, 16,17, and 18. Primer pairs: 1, 4, HBV_CCC_F1/HBV_CCC_R1; 2, 5, HBV_CCC_F1/HBV_CCC_R2; 3, 6, HBV_CCC_F1/HBV_CCC_R3; 7, 10, HBV CCC F2/HBV_CCC_R1; 8, 11, HBV CCC F2=HBV_CCC_R2; 9, 12, HBV CCC F2=HBV CCC R3; 13, 16, HBV CCC F3=HBV CCC R1; 14, 17, HBV CCC F3= HBV CCC R2; 15, 18, HBV CCC F3=HBV CCC R3.HBV_CCC_F1: 5-ACTCTTGGACTCBCAGCAATG-3; HBV_CCC_F2: 5-TGTTCACCAGCACCATGC-3; HBV_CCC_F3: 5-GCGGWCTCCCCGTCTGTGCC-3; HBV_CCC_R1: 5-CTTTATACGGGTCAATGTCCA-3; HBV_CCC_R2: 5-ACAGCTTGGAGGCTTGAACAG-3; HBV_CCC_R3: 5-GTCCATGCCCCAAAGCCACC-3.(二) 普通 PCR基于 rcDNA 的正链和负链上均存在缺口 ,故可以设计跨越两个缺口的引物 ,使 rcDNA 不被扩增 , cccDNA 由于有完整的双链可以被有选择地扩增2,3。(三) Real-Time quantitative PCRHe等3建立了实时荧光定量检测cccDNA的方法。他们将具有发光基团和淬灭集团的 TaqMan探针设计于负链缺口的下游 ,与负链互补。在上游引物的引导下 ,若负链是完整的 , Taq 酶则到达 Taq2 Man 探针所结合的位点 ,利用其 53的外切酶活性将探针切断 ,从而 3端的淬灭集团失去对 5端发光集团的抑制作用 ,产生荧光信号。若负链含有缺口 ,由于上游引物引发的链延伸不能通过负链缺口 ,故不能产生荧光信号。这样 ,cccDNA 和 rcDNA 得以区分开来。此方法变普通 PCR 法的终点监测为实时动态检测 ,不需对 PCR 反应产物进行开盖检测 ,从而减少了 PCR 产物污染的可能 (见图 3) 。图 三 RT-qRCR检测cccDNA（四）入侵检查（Invader Assay）入侵检查是近年来刚开始应用的技术。其基本原理是目标DNA设计一对探针 ,一个探针称为初始探针 (primary probe) ,另一个称为入侵探针(invader probe) ,初始探针的 5端一段寡核苷酸序列不与目标 DNA 互补 ,入侵探针 3末端的单个碱基不与目标DNA互补，Flap核酸内切酶I（Flap endonuclease I）将初始探针5端不与目标DNA互补的寡核苷酸序列剪切下来，之后此段寡核苷酸序列与具有发光基团和淬灭集团的 FRET ( Fluorescence Resonance Energy Transfer) 探针相结合 ,从而产生荧光信号 , 能够被实时荧光 PCR 仪器检测 5。 D KH W 等6根据此原理 ,分别设计了与 HBV DR2区正链下游、负链上游相结合的两种入侵探针 ,这样当正链、负链均为完整时产生两种荧光信号 ,从而检测 cccDNA ;rcDNA 由于正链含有缺口 ,只能产生一种荧光信号 ,得以和 cccDNA 相区分 (见图 4 ,5) 。整合型 HBV DNA 在 DR2 区的 5端也是一段完整的序列 ,但整合多发生在 112bp 的 DR 区6,7 , Wong D K等6据此认为用入侵检查技术测到整合型 HBVDNA 的几率应该很低。图四 入侵检测技术原理示意图图五入侵检查检测cccDNA（五）最新型的RNAscope 技术RNAscope专利技术是近年来最火的RNA原位杂交技术，是RNA原位杂交（ISH）领域的一项重大进步。由Advanced Cell Diagnostics公司（Newark, CA）开发，通过专利的双“Z”探针设计和信号放大系统，使RNA原位杂交具有高度特异性、单分子检测的敏感性并有极高的信噪比，能够在单细胞水平同时定量多个RNA的表达，在获得单细胞中单拷贝RNA表达数据的同时提供完整的组织形态学信息。袁正洪教授8团队利用RNA Scope技术根据HBV各核酸的特点设计了3组探针可以分别识别HBV的totalDNA，cccDNA，mRNA （图六） ，但是效果还有待评估，特别是免疫染色印迹法标记 HBV HBsAg抗原和HBV RNA 重合度很差，并不符合RNA与蛋白之间的表达关系。图六探针组1 与HBV 正义链（nt1930-2900）互补，可以和HBV DNA的正链以及pgRNA杂交探针组2 与HBV 负义链（nt2957-837）互补，只和HBV DNA结合探针组3 对应HBV 正链的缺失段（nt1090-1690），与HBV-DNA负链互补，使用RNAse去除mRNA后可以专门用于检测cccDNA。图七 免疫染色印迹法标记 HBV HBsAg抗原和HBV RNA 重合度很差实验目的目的一，利用RNAScope技术设计两套与袁正洪教授组不同的HBV1b 和HBV2a 的DNA，cccDNA，mRNA探针，并与袁正洪教授组的结果相比较目的二 探索各核酸在乙肝病人肝组织内各个不同时期的分布目的三 对比IFN治疗反应不同病人之间各核酸表达与分布的不同Reference1. 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