（生物医学工程专业论文）基于嵌入式linux的实时pcr仪中温度控制系统的研究.pdf

a b s t r a c t a b s t r a c t p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ( p c r ) w h i c hw a sf i r s ti n v e n t e db yd rk a r ybm u l l i s i n19 8 3h a sp r o m o t e dt h em e d i c a ls t u d yf r o mh o l i s t i cl e v e la n dc e l l u l a rl e v e lt o m o l e c u l a rl e v e la n dm a d ear e v o l u t i o nt ob i o m e d i c a lf i e l d n o w , i th a sb e e nw i d e l y u s e di nm e a s u r i n gp a t h o g e n ，i m m u n ee s s a y , g e n ee x p r e s s i o n ，m u t a t i o na n d p o l y m o r p h i s ma n ds oo n ap c r i n s t r u m e n ti sak i n do fd e v i c et h a tc a l lr t l np c r g e n e r a l l y , l a r g en u m b e ro fd n af r a g m e n t sc a n b ep r o d u c e da f t e r2 0 - 3 0c y c l e s r e a l t i m ep c r ( r t - p c r ) i n s t r u m e n t sc a nn o to n l yr u np c rb u ta l s om o n i t o rt h ew h o l e p r o c e s so fp c ri nr e a lt i m ea n da tl a s ta n a l y z e1 n k n o w nt e m p l a t eb yt h es t a n d a r d c u r v e ，m a k i n gu s eo ft h ea c c u m u l a t e ds i g n a lo ff l u o r e s c e n c e t h i sp a p e rw a st od e v e l o pas u i to ft e m p e r a t u r ec o n t r o ls y s t e mu s e di nr t - p c r i n s t r u m e n t f i r s t l y , ah e a t - c o o ls y s t e mf o rar e a l - t i m ep c r i n s t r u m e n tw a sc a l c u l a t e da n d s i m u l a t e d t e m p e r a t u r ep l a y sak e yi m p o r t a n tp a r ti nt h ep c ra m p l i f i c a t i o np r o c e s s a n dt h ea m p l i f i c a t i o ni ne a c hp c rc y c l ei sc o m p l i c a t e ds e q u e n t l yb yt h r e es t e p st h a t a r eh i 曲t e m p e r a t u r em e l t i n g ，l o wt e m p e r a t u r ea n n e a l i n ga n dm i d d l et e m p e r a t u r e e x t e n s i o n al i m i t e dr a n g eo ft e m p e r a t u r ei sn e c e s s a r yt om a k et h ep c rp r o c e e d s m o o t h l yi ne v e r ys t e p t h em o d e l so fh e a t - c o o ls y s t e mi np c r w e r ed e s i g n e da n d t h ea m o u n to fh e a tn e e d e dw h e nt h es y s t e mr a i s e df r o ma n n e a l i n gt e m p e r a t u r et o m e l t i n gt e m p e r a t u r ew a sc a l c u l a t e da c c o r d i n g t ot h r e es t e p so fp c r t h e n ，t h es y s t e m w a ss i m u l a t e db yu s i n gt h es o f t w a r eo fa n s y sa n dt h er e s u l tm a t c h e do u rd e s i g n s e c o n d l y , ap h a s es h i f tf u l lb r i d g ec i r c u i tw a sd e s i g n e df o rah i 曲f r e q u e n c y s w i t c h i n gp o w e rs u p p l yw i t ha10 0k h zf r e q u e n c yf o rh e a t i n ga n dc o o l i n gw i t ha s u i t a b l er a d i a t o r t h e n ，c o m p a r e dt os e v e r a lw a y s ，ah e a t c o o ls y s t e mo fr t - p c rw a s b u i l tw i t hs e m i c o n d u c t o r ( p e l t i e r ) h e a t c o o lm o d e a n dt h e n ，ah i g hs e n s i t i v es e n s o r p t l0 0w a sc h o s et od e t e c tt h et e m p e r a t u r es i g n a la n dt h ed a t aa c q u i s i t i o na n df i l t e r c i r c u i t su s e ds p e c i a l l yf o rt e m p e r a t u r es i g n a lw e r ed e s i g n e d f i n a l l y , s o m ep r o g r a m sw e r ed e v e l o p e d t oc o m m u n i c a t eb e t w e e nt h ee m b e d d e d l i n u x ，w h i c hh a st h eq u a l i t yo fs t r o n gr e l i a b i l i t y , h i g hs p e e da n dl o wp o w e r ，a n da p e r s o n a lc o m p u t e r f i r s t ，t h ea dc o n v e r s i o np r o g r a ma n dt h es e r i a lc o m m u n i c a t i o n p r o g r a m w e r ed e v e l o p e di nt h ee m b e d d e dl i n u xs y s t e m t h e n , t h es e r i a l c o m m u n i c a t i o np r o g r a ma n dt h et e m p e r a t u r es i g n a ld i s p l a yp r o g r a mb a s e do n m s c o m mi nap e r s o n a lc o m p u t e rw e r ed e v e l o p e d 一i i i 北京工业大学t 学硕士学位论文 i nt h i sp a p e r , t h et e m p e r a t u r ec o n t r o ls y s t e md e s i g n e dt ob eu s e di nr t p c r i n s t r u m e n tc o u l dm e e tt h ed e m a n do fp c r a m p l i f i c a t i o no nt h ew h o l ea n dw o u l d e s t a b l i s ht h ef o u n d a t i o nf o ru st or e s e a r c hr t p c ri n s t r u m e n tw i t ho u r s e l v e s i n t e l l e c t u a lp r o p e r t yr i g h t s k e yw o r d sp o l y r n e r a s ec h a i nr e a c t i o n ，t e m p e r a t u r ec o n t r o l ，h i g hf r e q u e n c ys w i t c h i n g p o w e rs u p p l y , p e l t i e r , e m b e d d e dl i n u x i v 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得北京工业大学或其它教育机构 的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均 已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 签名：；4 越日期：j 纽逻丝亚 关于论文使用授权的说明 本人完全了解北京工业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部 分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 ( 保密的论文在解密后应遵守此规定) 签名：云悼导师签名：- 2 兰啦日期： 狄斌缈如 第1 章绪论 第1 章绪论 1 1 课题研究的背景与意义 聚合酶链式反应( p o l y m e r a s ec h m nr e a c t i o n ，p c r ) 最早由克里穆利斯( k a r y b m u l l i s ) 博士于1 9 8 3 发明，1 9 8 5 年他与s a i k i 等人在( ( s c i e n c e ) ) 上正式发表 了第一篇与p c r 相关的论文【l 】，于1 9 9 3 年m u l l i s 获得诺贝尔化学奖。 p c r 技术是生物医学领域中的一次革命，它使生物医学研究从整体水平和 细胞水平发展到分子水平，现已广泛应用于病原体测定、免疫分析、基因表达、 突变和多态性等许多领域。 实时p c r 仪不仅能够进行p c r 扩增，还能够利用荧光积累信号来实时监测整 个p c r 反应过程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析，其应用前景广阔。 但是，国内在此方面的研究相对落后，产品主要依靠进口，价格昂贵，因此研发 适合我国国情、功能齐全、而性价比又高、具有自主产权的实时p c r 仪迫在眉睫。 1 2 国内外发展及应用现状 目前，国内外常用的实时p c r 仪主要有以下几种：a b i 公司生产的a p p l i e d b i o s y s t e m 系列，c o r b e r tr e s e a r c h 公司的r o t o r - g e n e 系列，b i o r a d 公司生产的i q 系 列，s t r a t e g e n e 公司的m x 系列，罗氏公司的l i g h t c y c l e r 系列，c e p h e i d 公司的 s m a r t c y c l e r 等。 a b i 美国应用生物公司：a b i7 5 0 0 型：用卤钨灯作为激发光源，可以检测 五色荧光，是核酸检测与定量的一体化平台，可动态观察p c r 每一循环各反应管 中扩增产物逐渐增加的情况。a b i7 7 0 0 型：由氩离子激光器激发荧光，可在5 0 0 - - 6 6 0 n m 范围内调节波长，一次可以测定9 6 个样本，一批样本的完成需2 d , 时。 a b i7 9 0 0 型：其基本构成与a b i7 7 0 0 型相同，不同处在于程序设计完全实现自 动化，可2 4 d 、时无人操作，波长可在5 0 0 6 6 0 n m 之间进行连续检测，而且有2 种样 品盘可供选择( 9 6 孑l 和3 8 4 孑l ) ，满足了药物研究中高通量定量检测核酸序列的需 求。它们都采用半导体加热样品盘来实现控温方式。 c o r b e r tr e s e a r c h 公司：o r o t o r - g e n e3 0 0 0 ：是第一种中心型热循环仪，即从 反应体系内部进行热变化，它以高功率发光二极管为光源，具有双光源系统，蓝 光在4 7 0 n m 处激发荧光，绿光在5 3 0 n m 波长处激发荧光，具有两种样品盘( 7 2 孔和 3 6 孑l ) 供选择。 r o t o r - g e n e6 0 0 0 ：是新推出的实时旋转p c r 分析仪，装有其率 先发明的能进行h r m ( h i g h r e s o l u t i o nm e l t ) 处理的实时扩增平台，6 种通道能够产 北京t 业大学工学硕十学位论文 生从紫外线到红外线的波长范围，进行核实和动态校准功能的o t v ( o p t i c a l t e m p e r a t u r ev e r i f i c a t i o n ) 系统，还能进行浓度分析( 如d n a 浓度的测量) 、熔点曲 线分析、双重量化，具有较好的实验再现能力。这两种产品都采用了中心型热循 环式加热方式。 b i o - r a d 公司： i c y c l e ri q 是在扩增仪上加装定量模块而成，荧光激发波 长范围为4 0 0 7 0 0 r i m ，可在一个反应体系中同时检测4 种荧光信号，一批能完成9 6 个样本的测定，其软件操作方便，具有自动分析等功能。q m y i q ：结构与i c y c l e r i q 相似，以钨卤灯为光源，荧光检测波长在5 1 5 5 4 5a m 之间，具有实时p c r 温度 梯度，熔点曲线分析，可定制的终端点荧光分析等功能。 i q 5 ：结构和基本性 能与m y i q 相似，但其荧光检测范围为5 1 5 7 0 0 n t o ，能够同时检测5 种荧光信号。 都采用半导体加热方式。 美国s t r a t e g e n e 公司： m x 4 0 0 0m u l t i p l e x ：以石英卤素灯为激发光源，其检 测波长可在3 5 0 8 3 0 n m 范围内进行调节，温度均一性好，其样品盘的规格包括 标准的9 6 ：j ：l 盘、8 联管或2 0 0 u l 单管，其程序可以进行实时数据分析。 m x 3 0 0 0 p q p c r ：具有4 色滤光片系统，可同时检测4 种荧光信号进行多重p c r ，同时进行 9 6 个反应和熔点曲线分析，其程序也可进行实时数据分析。 m x 3 0 0 5 pq p c r ： 与m x 3 0 0 0 p 性能基本相同，但具有5 色滤光片系统，能够进行五重p c r 。它们也 都是采用半导体加热方式。 r o c h e 公司： l i g h t c y c l e r2 0 ：加热系统为中心热循环式，使用3 2 孑l 样品盘， 蓝光最高可在4 7 0 n m 波长处激发荧光，能同时实时检测6 个通道的荧光信号，扩 增反应在一个特殊设计的玻璃毛细管中进行，它有很高的表面体积比使热量能够 快速传递，使热循环的速度大大提高，再加上有压缩空气推动的温度控制系统， 进行3 5 个循环使用2 0 u l 的毛细管仅需要3 0 分钟而使用1 0 0 u l 的毛细管仅需要6 0 分 钟。 l i g h t c y c l e r4 8 0 ：是一个9 6 孔和3 8 4 孑l 样品盘可供选择的紧密而通用的长箱 式仪器，采用半导体加热方式，以氙灯为激发光源，可以检测6 色荧光，能在4 0 分钟内完成4 0 个循环。 c e p h e i d 公司的s m a r t c y c l e r ：使用专用的毛细反应管，有1 6 种反应模式可供 选择，而且每种模式都有各自的程序，任一种模式不仅能同时检测4 种荧光信号， 不同的使用者可对同一批样品同时运行不同的模式进行检测，是目前唯一允许在 不同条件下同时进行p c r 反应的定量p c r 仪。反应快速、结果准确，2 0 分钟就能 获得很好的结果。该系统的一台电脑可以同时连接6 个板块，灵活性强，能同时 进行多达9 6 个独立的反应模式程序，极大满足了实验室对检测量的需求，该系统 已被广泛应用于传染性疾病及基因检测。 目前，国内研究实时p c r 仪的也很多，如杭州大和、上海风林、厦门安普利、 西安天隆等，但其控温精度和检测灵敏度都要低于国外主要实时p c r 仪厂家的指 第1 苹绪论 标。 随着基因科学及分子生物学的发展，实时p c r 仪的应用前景更加广阔。人们 对实时p c r 仪也提出了更高的要求：p c r 反应、荧光检测与数据分析一体化，提 高仪器的性价比；缩短循环时间，减少循环次数，降低荧光检测的阈值，提高检 测的灵敏度，以缩短科研人员的实验时间、提供初始拷贝数的检测极限；较高的 通量和较少的试剂用量；全波长检测和较好的重复性等【2 j 。 1 3 论文的主要研究内容 d n a 扩增系统是实时p c r 仪的基本组成部分，p c r 反应过程中的高温变性、 低温复性、中温延伸都是在一定的温度范围内才能进行的，故温度控制在p c r 中 起着重要的作用。本文主要针对d n a 扩增系统中的温度控制系统进行研究。 目前，实时p c r 仪在温度控制加热方面主要有两种方式：中心热循环式和半 导体加热样品盘式，前者对空气动力学的依赖较大，难以控制；后者以其体积小、 温度均匀、升降温速度快、温控精确、可靠性高等优点而被广泛采用。 本文采用了半导体加热方式来实现温度的升高与降低。 首先，设计能够盛放反应试管的温度加热系统，通过计算和模拟得出使其温 度以3 。c 秒的速率升高所需要的热量，从而为温度控制系统的研制提供理论依 据； 其次，设计用于加热制冷的能够提供反应功率的高频开关电源； 再次，利用半导体( 帕尔贴) 来搭建p c r j j l 3 热与制冷系统，利用敏感度高的 温度传感器p t l 0 0 采集温度信号，并设计专用于温度信号的采集、滤波电路，对 温度信号进行前端放大滤波处理； 最后，利用嵌入式l i n u x 系统与p c 机进行通讯。开发l i n u x 下的a d 转换程序、 串口通讯程序；开发p c 机中的基于m s c o m m 控件的串口通信及温度信号显示程 序。 最终研制一个p c r 反应中的温度信号采集、传输、显示与处理的系统，这对 研制实时p c r 仪至关重要。 1 4 论文各章安排 本论文具体安排如下： 第l 章是绪论。主要阐述本文研究背景及意义，分析国内外研究进展情况， 提出本文主要研究内容。 第2 章是实时p c r 仪的原理和方法。主要阐述设计的理论基础，包括p c r 技术、实时p c r 技术等。 北京工业大学1 = 学硕士学位论文 第3 章介绍温度控制系统的计算与模拟。计算p c r 反应过程中所需加热功 率，并进行模拟仿真。 第4 章是高频开关电源的开发。电源工作的好坏能够直接关系到整个系统工 作的成功与否，本章具体介绍用于加热制冷的高频开关电源的设计。 第5 章是系统硬件的开发。主要包括p c r 反应加热制冷平台的搭建、信号 前端放大滤波及传输等。 第6 章是嵌入式l i n u x 系统与p c 机通讯程序的开发。主要涉及到l i n u x 下 的a d 转换、串口通讯及p c 机中的操作界面的设计、数据采集处理功能的实现 竺 可o 最后总结了论文中讨论的内容，指出该系统中存在的不足，并提出改进措施 与展望。 一4 一 第2 章实时p c r 仪的原理和方法 第2 章实时p c r 仪的原理和方法 2 1p o r 技术介绍 p c r 是一项在短时间内体外大量扩增特定的d n a 片段的分子生物学技术： 由一对位于靶序列两端互补的寡核苷酸引物介导，通过对温度的调节，使模板 d n a 双链或经p c r 扩增形成的双链d n a 解离，从而使双链d n a 变性为两个 单链d n a ( 模板d n a 的变性，温度在9 0 9 5 ) ；引物与模板d n a 单链的互 补序列配对复性( 模板d n a 与引物的退火，温度在5 5 6 5 ) 成为引物- d n a 单链复合物；以及在d n t p s 存在下d n a 聚合酶能使引物沿单链模板延伸成为双 链d n a ( 引物的延伸，温度在7 0 7 5 ) 。这种热变性复性延伸的过程，就 是一个p c r 循环，如图2 1 所示1 3 】。一般通过2 0 - 3 0 个循环，就可获得大量( 1 0 6 1 0 9 倍) 的成指数递增的要扩增的d n a 片段。 图2 1p c r 反应过程 f i g 2 - 1d i f f e r e n ts t e p si np c r p c r 仪能自动完成聚合酶链式反应。早期的p c r 仪( 如水浴锅式p c r 仪) 只能做扩增，不能在扩增的同时进行分析，在扩增结束后，p c r 经指数阶段扩 增到达平台期进入饱和，不再遵循指数扩增规律，检测重现性极差。即使同一个 北京工业大学_ 丁学硕十学位论文 模板在9 6 孔p c r 仪上做9 6 次重复实验，所得结果也有较大的差异( 如图2 2 所示) ，无法直接从终点产物量推算出模板量。采用内标法( 一种提高定量分析 精度的标定方法) 后可部分消除终产物定量所造成的不准确性。但即使如此，传 统的实时定量方法也都只能算作半定量、粗略定量的方法【4 1 。 o e + 0 0 星 墨9 o o e o ， 勺 o c u 埔 呈4 o o e 0 1 u _ - _ 一 1 o o e - 0 1 图2 2p e 公司在同一台p c r 仪上对相同模板进行9 6 次扩增的扩增图 f i g2 - 2a m p l i f i c a t i o ng r a p ho f9 6c y c l e si nt h es a m eb l o c k o fap ec o m p a n y sp c ri n s t r u m e n t 2 2 实时p o r 仪的原理及应用 2 2 1 实时p c r 技术 实时p c r 技术是美国p e 公司于1 9 9 5 年研制出的一种新的核酸定量技术， 是指在p c r 反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个p c r 进 程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法【5 j 。它在常规p c r 基础 上添加了荧光染料或荧光探针，荧光染料能够特异性地掺入d n a 双链而发出荧 光信号，从而保证荧光信号的增强与p c r 产物的增加完全同步【6 j 。实时p c r 是 基于荧光共振能量转移( f l u o r e s c e n c er e s o n a n c ee n e r g yt r a n s f e r , f r e t ) 技术的：一 个具有特异性的寡核苷酸荧光探针，在探针的5 端标记一个荧光基团，3 端标记 一个基团，两者能够构成能量传递结构，荧光基团所发出的荧光可被淬灭基团吸 收：p c r 扩增时( 在延伸阶段) ，报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光 监测系统能够检测到荧光信号【7 j 。 第2 章实时p c r 仪的原理和方法 现在通用的适用于实时p c r 检测系统的化学发光材料主要有两类：一类是 非特异性d n a 嵌入染料( 如s y b rg r e e ni 【8 1 ) ；另一类是以杂交形式进行的单链 检测系统，主要有水解探针或t a q m a n 探针l g l 、分子信标【l o 】、s c o r p i o n s l l l l 和杂交 探针【1 2 】等。 实时p c r 反应早期，荧光产生的水平不能与背景明显地区分开来，随后荧 光的产生进入指数期、线性期和最终的平台期，在反应处于指数期的某一点上来 检测p c r 产物的量，并且由此来推断模板d n a 最初的量【l 引。为了便于对所检 测样本进行比较，在反应的指数期，首先要设定一个荧光信号的域值( t h r e s h o l d ) ， 一般这个域值是以p c r 反应的前1 5 个循环的荧光信号，荧光域值的缺省设置是 3 1 5 个循环的荧光信号的标准偏差的l o 倍。如果检测到的荧光信号超过域值被 认为是真正p c r 的信号，它可用于定义样本的域值循环数( c t 值) 。c t 值的含义 是：每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数。研究表明，每 个模板的c t 值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系【1 4 1 ，起始拷贝数越多， c t 值越小，利用己知起始拷贝数的标准品可做出标准曲线，因此只要获得未知 样品的c t 值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数( 如图2 2 所示) 。 由于实时p c r 技术不仅实现了p c r 从定性到定量的飞跃，而且与常规p c r 相比，具有特异性更强、灵敏度高、重复性好、定量准确、全封闭反应、自动化 程度高、有效解决p c r 污染问题等优点，已得到了广泛的应用【4 j 。 t h t e s h d dc y c l e 图2 - 3c e p h e i d 公司的s m a r tc y c l e r 上c t 值与起始拷贝数的对数图 f i g2 - 3l o g a r i t h m i cp i c t u r eb e t w e e nc tv a l u ea n di n i t i a t i v ec o p yn u m b e ri nc e p h e i dc o m p a n y s s m a r tc y c l e r s y s t e m 2 2 1 1 实时p c r 仪的组成 实时p c r 仪主要由热循环扩增仪和光学检测系统组成。热循环扩增仪能够 实现p c r 扩增，其装置如图2 4 所示，这部分是本文研究的主要内容，下面将 一1 一 北京i 业大学工学硕学位论立 会做详细的阐述；光学检测系统有一套完整的光路系统，能够激发并实时检测荧 光信号，其结构如图2 5 所示，各种仪器检测到的波长数和光学频率范围不同， 能区分的波长数越多，频率范围越宽，灵敏性越高，仪器性能越好【“】。 剖24 热衙环技 f i g2 - 4 t h e r m o c y c l e r 。f ”f i - 二i e 卫 二口：= l b 口 l 口 o 叶”：口 图2 - 5 荧光检测系统 f i g2 - 5f l u o r e s c e n t d e t e c t i n gs y s t e m 一8 一 第2 章实时p c r 仪的原理和方法 2 2 2 实时p c r 仪的应用 实时p c r 仪已广泛应用于临床及生命科学研究的各个领域中，现主要就以 下几方面作一概述： ( 1 ) 遗传性疾病的基因诊断。迄今对遗传性物质改变引起的疾病还无法根 治，只能通过产前监测和产前基因诊断减少病婴出生。s a n g k i t p o r r l 等1 1 6 j 报道使 用d s d n a 结合染料s y b rg r e e ni ，结合融解曲线分析对q 一地中海贫血纯合子、 杂合子作出诊断。使用双色荧光标记探针，结合不同的引物设计，可以实现对某 些先天性疾病的定量检测。z i m m e r m a n n 等旧提出采用双重荧光p c r 筛查唐氏 综合征，在产前诊断中有应用前景。 ( 2 ) 病原体的分子检测：p c r 技术的问世使病原体检测能够快速、方便地进 行。应用实时荧光p c r 技术就能快速、准确地得到定量检测结果。目前，实时 荧光p c r 技术已应用于肝病【1 8 】、性病以及人类免疫缺陷病毒( h i v ) 【1 9 1 等各种病原 体的临床诊断，为实现快速准确诊断提供了有效的检测方法。 ( 3 ) 肿瘤的分子诊断：尽管肿瘤发病的分子机制尚未完全阐明，但相关基因 的遗传学改变的积累是致癌性转变的根本原因之一己得到普遍承认。癌基因的突 变和表达增加，在许多肿瘤早期就出现。实时荧光p c r 技术不仅能有效地检测 到基因的突变，而且可以准确检测癌基因的表达量，成为检测肿瘤微小残留分子 标志的一种必备工具。如定量结直肠癌淋巴结的癌胚抗原( c e a ) m r n a 的表达 量，可作为诊断癌症微转移的重要依据【2 0 1 。e c k e r t 等【2 1 】提出采用实时荧光p c r 技术检n jl , 童急性淋巴细胞白血病微残留病灶，对儿童急性白血病的治疗有重要 指导意义。 ( 4 ) 其他方面：近年来研究发现孕妇外周血血浆游离d n a 中含有源于胎儿 的d n a ，但其仅占血浆总d n a 的3 - - - 6 。这给无创性产前诊断提供一种胎儿 d n a 的新来源，实时荧光定量p c r 技术可以灵敏地检测孕妇血浆中胎儿的 d n a 。g a l b i a t i 等【2 2 】采用这一技术对妊娠前期、中期和后期孕妇血浆中的胎儿 d n a 进行检测，准确度分别为9 9 4 、9 7 8 和1 0 0 。h w a 等1 2 3 】从以往未妊娠 男胎的孕妇血浆中分离胎儿d n a ，用实时荧光定量p c r 技术检测y 染色体上的 性别决定区( s r y ) 基因，在进行无创性产前性别诊断中有重要价值。 实时p c r 是p c r 技术的发展方向，随着技术方法的不断改进与完善、仪器 设备和试剂费用的降低及相关知识的了解和普及，在生命科学领域将得到更加广 泛的应用【2 4 1 。 2 3 本章小结 本章首先介绍了p c r 及实时p g r 技术，其次介绍了实时p c r 仪的结构， 主要有两部分组成：热循环扩增仪和光学检测系统：最后介绍了实时p c r 仪的 几例具体应用。随着科学技术的不断提高，仪器的性能价格比将会大大提高，所 以研发实时p g r 仪是迫在眉睫并且有美好的前景。 第3 章温度控制系统的计算与模拟 实时p c r 中温度控制非常重要，其反应过程中的变性、退火和延伸三个阶 段都是在一定的温度范围之内才能顺利进行。本章首先利用绘图软件a u t o c a d 设计加热系统容器模型，然后理论计算容器和反应样品温度以每秒3 c 升高时 所需要的热量最后利用计算出的热流通量在有限元分析软件a n s y s 中进行温 度场动态分布仿真i ”- 2 9 1 。 3 1 加热模型的建立 利用三维造型软件a u t o c a d 设计模型，经对比多种模型，与加热片相接触 的底座采用如图3 1 所示的圆台模型，这种模型不仅能充分加热反应物还能有效 地减少加热功率的消耗，其尺寸为：在底板长为1 0 9 毫米、宽为7 3 毫米、高为 05 毫米的铝板上有9 6 个铝制空心圆台，每个圆台上端面内外半径分别为r 3 ( 4 5 毫米) 和r 2 ( 35 毫米) ，下端半径为r 4 ( 2 l 毫米) ，圆台高为h 2 ( 1 6 毫米) ，距 底面i 毫米处为一半径为r 0 ( 15 毫米) 的空心半球与圆台光滑相连；盛放反应 物的塑料容器如图3 2 所示，其主要部分是在长宽高分别为1 1 9 毫米、7 8 毫米和 1 毫米扳的下方区域，共有9 6 个小容器，每个小容器的下端为内外径分别为r ( 07 毫米) 和r 0 的空心半球体，上端为高而( 1 35 毫米) 、上下两面外圆半径 分别为r 2 和r 0 、厚为o8 毫米的圆台。使用时把图3 - 2 中的9 6 孔板放置到图1 所示的基座中紧密配合。单个圆台、容器的中心截面尺寸如图3 - 3 所示。 蘩臻网1 l 1fi 。fr rl 。f f f i 。l f ? f j j i | i 。fi 。fl 。j f 。f f 乒乒 乒乒乒乒| ；i r | ；乒 f 。fi fl 。j 。ff j f 1 - 一i 。1 f fi 。fr f f 7 ，。f 。7 ：。：一 i 1j rf f l 。i 。ft 。1 。1 f i 。 j ”扭 j 妇。 。 图3 1 i 底座模型 f i gi b a s e m o d e l 图32 反应物窖器模型 f i 9 2 v e s s e l s m o d e lc oh o l d m a n a n ts a m p l e 图3 - 3 单孔模型尺寸( 单位：米) f i g3s i n g l e w e l ls i z e ( u n i t i s m e t e r ) 32 加热功率的计算 本节理论计算了3i 节模型中实时p c r 反应体系以3 ，秒的速率升温时所 需的功率，采用的热容量、质量和圆台的计算公式如下： 热容量q 的计算公式为： 9 2 ( 3 一1 ) 第3 苹实时p c r 仪温度箨制系统的计算与模拟 式中聍一材料的质量； c 为材料的比热。 对质量m 的计算公式为： m2v xd ( 3 - 2 ) 式中1 ，物体的体积； d 物体的密度。 圆台体积的计算公式为： v = 1 1 3 x 万x h x ( _ 2 + 孑+ r t r ：) ( 3 3 ) 式中卜圆台的高： ，1 、圪圆台的两底面半径。 观察上节中的模型，可以看到加热部分主要是金属铝模型( 图3 1 ) 、塑料容 器模型( 图3 2 ) 和容器内的反应物，文中反应物的热力学参数由水的热力学参 数近似。 各材料的热力学参数见表3 1 。 表3 一l 材料的热力学性能参数 t a b 3 lm a t e r i a l s t h e r m o d y n a m i c sc a p a b i l i t yp a r a m e t e r s 热流通量 材料 比热j ( k g )密度k g m 3 j ( m s ) 铝9 4 62 7 1 02 2 6 1 塑料 1 4 6 3 71 2 0 00 5 0 2 4 4 反应物 4 1 8 2 1 0 0 00 6 9 7 3 2 1 反应物的热容量 图3 - 3 中单孑l 反应物的体积分为两部分，上边是圆台( 其高为h l ，上下端圆 面的半径分别为，1 、，) ，下边是半球体( 其半径为，) ，则反应物的热容量q w 为： q 。= 9 6 x 1 3x t 红( 2 + ，2 + r l r ) + 2 3 石厂3 】d c = 5 5 j c ( 3 - 4 ) 3 2 2 塑料容器的热容量 图3 3 中单孔塑料容器体积分为两部分，上边是空心圆台( 其高度为h l ，上 端圆的外半径i 2 为3 5 毫米) ，下边是外径为r o 的空心半球体，为反应物的体 积，则容器的热容量劬为： q p = ( ，w 一9 6 万芬) j i z + 9 6 1 3 万啊( 孑+ 2 + 吃) + 2 3 x a x r 0 3 卜v w x d x c = 3 5 j o c ( 3 5 ) 3 2 3 铝底座的热容量 图3 - 3 中单孔铝容器体积分为两部分，外部为圆台体积( 其高度为h 2 ，上下 两端圆面的外半径分别为r 3 、，4 ) ，内部为容器和反应物的体积( 吻，w ) ，则底座 的热容量为： 吼= ( z w 办+ 9 6 1 3 万红( 孑+ _ 2 + 乃) 一kw xd xc = 8 0 5 j o c 3 2 4 热盖的热容量 热盖的热容量q c 为： ( 3 6 ) q 。= l xw xh xdx c = l o j o c ( 3 7 ) 3 。2 5 总热容量的计算 上述反应物、塑料容器和铝板三部分热容量的总和就是总热容量g f ： q t - - g w + g p + g 口+ g c = 1 8 0 5 j 。c ( 3 - 8 ) 所以要使实时p c r 仪中反应物的温度以3 秒的速率升高，需要的热量q 为： q 2 g fx 3 。c = 5 4 1 5 j s ( 3 9 ) 由于热量是加在如图3 1 所示的铝板底面上，换算成热流通量为： 形= 5 11 5 j 。c ( ( 0 1 0 9 m o 0 7 3 朋) = 6 8 0 5 3 j ( s ) ( 3 1 0 ) 式中a 加热物的面积。 33 有限元分析 331 模型的建立 应用功能强大的大型有限元仿真软件a n s y s 对实时p c r 仪温度加热系统进 行模型设计、模拟仿真，特别是对铝底座的设计，经反复改进后采用了一种最佳 的模型( 见图3 1 ) 。本文利用a n s y s 对单个反应 l 建模并进行模拟仿真，单孔塑 料的模型如图3 4 所示，单孔整体模型如图3 5 所示：外边是铝；中间是塑料；内 部是p c r 反应物；顶部是热盖，用于防止热量流失并起到加快温度升高速率的作 用。按照表3 1 给出三种材料的热力学参数。 图3 4 单孔塑料容器模型 f * 3 - 4s i n g l e - w e l lp l a s t i cv e s s e lo f m o d e l 图3 - 5 单孔整体模型 f i g , 3 5 t h e w h o l es i n g l 。”。i l o o d e l sp i c t u r e 1 5 一 黧 3 32 对边界换热的处理 p c r 反应的加热过程是在一个封闭系统中进行的，与外界热交换很小，故本 模拟中忽略模型与空气的对流和辐射，同时忽略各孔间的相互影响，只模拟单孔 模型。 3 33 网格划分 本文仿真模型中对铝底座、塑料容器、反应物及热盖均采用t e t1 0n o d e8 7 热分析单元，使用自由网格划分中智能的单元大小s m a r t s i z i n g ，网格划分尺寸选 择4 ，网格划分结果如图3 6 所示。 334 加载求解及结果 对图3 6 所示模型进行瞬态传热分析，初始温度设为2 5 c ，采用连续升温方 式，加热时间为3 0 秒，时间间隔为01 秒，模拟仿真共计算3 0 0 步，在模型底面施 加式( 3 1 0 ) 中计算的热流通量。经a n s y s 仿真计算后得到了如图3 7 所示的温 度分布图以及模型内部中心节点( 圆台竖直中心线的中点) 温度随时间的动态变 化曲线图( 见图3 8 ) 。 图3 - 6 厢格旬j 分图 f i g3 - 6 t h ep i c t u r eo f m e s h d i v i s i o n 薹i 耋耋坠! ：些耋堡垄型茎垒塑生塞耋堡篓 图3 7 温度分布图 f i g3 - 7 t h ep i c t u r e o f t e m p e r a l u r ed i s t r i b u t i o n 图3 - 8 中心节点的温度变化 f i g3 8 t h ep i c t u r eo f c e n t r a n o d e sc h a n g i n g t e m p e r a t u r e 北京工业大学1 二学硕士学位论文 表3 2 y 0 出了反应物中心节点在模拟过程中自1 3 秒以后每一秒时的温度值及 其温度变化情况，其中温度变化率指的是1 秒内升高的温度值。 分析图3 8 和表3 2 ，中心节点温度初始时升温速率较慢为o 4 7 s ，随后逐渐 加速，3 0 秒时，升温速率高达5 7 1 s ；当温度高于5 0 时，基本按照大于3 s 的速率升高，达到了理论计算的要求。 表3 - 2 中心节点的温度随时间的动态变化情况 t a b 3 2c e n t r a ln o d e sc h a n g i n gi n s t a n c e sb e t w e e nt e m p e r a t u r ea n dt i m e 时间s温度温度变化率时间s温度温度变化率 1 34 3 3 42 27 4 。5 64 2 2 1 44 6 0 62 7 22 37 8 9 64 4 1 54 8 9 72 9 l2 48 3 5 5 4 5 9 1 65 2 0 63 0 92 58 8 3 24 7 7 1 75 5 3 53 2 92 69 3 ，2