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第十二章 弧菌科一、教学大纲要求（1）弧菌科的分类和特性。（2）霍乱弧菌和副溶血弧菌的分类、临床意义、细菌特性、实验室检查和耐药性。（3）气单胞菌和邻单胞菌的分类、临床意义、细菌特性、实验室检查和耐药性。二、教材内容精要（一）弧菌属的分类及主要特点弧菌属（Vibrio）在分类上属于弧菌科，共有36个种，其中14种弧菌已被证明引起人类感染并可从临床标本中分离得到，包括引起肠道感染的O-1群霍乱弧菌、O139群霍乱弧菌、非O1群霍乱弧菌、副溶血弧菌、拟态弧菌、河流弧菌、霍利斯弧菌；引起伤口感染、中耳炎和败血症等肠道外感染的溶藻弧菌、辛辛那提弧菌、创伤弧菌、弗尼斯弧菌、少女弧菌、麦氏弧菌和鲨鱼弧菌。其余为海洋性弧菌与人类感染无关。本属除麦氏弧菌外氧化酶均阳性，能发酵葡萄糖，对弧菌抑制剂O/129敏感，钠离子能刺激其生长，其中有些种在无盐条件下不能生长；营养要求不高，许多致病性弧菌在普通培养基上可生长，在血平板上可呈现、溶血或不溶血菌落；在麦康凯培养基上，许多致病性弧菌可生长形成乳糖不发酵菌落。（二）霍乱弧菌1分类（1）血清分型 霍乱弧菌（V.cholerae）有不耐热的H抗原和耐热的O抗原。前者为共同抗原，特异性低，后者具有群特异性和型特异性，是霍乱弧菌分群和分型的基础。根据O抗原的不同，霍乱弧菌现有155个血清群，其中仅O1群和O139群引起霍乱。O139血清群是新出现的型别，与O1群抗血清无交叉反应，但可与O22和O155血清群产生交叉反应，遗传学特征和毒力基因与O1群相似。O2血清群O138血清群可引起人类的胃肠炎，无明显的季节分布，不引起霍乱流行，不被O1群霍乱弧菌多价血清所凝集，称之为非O1群霍乱弧菌，以往也称不凝集弧菌或非霍乱弧菌。O1群霍乱弧菌的O抗原由A、B、C三种抗原成分组成，A是O1群的群特异性抗原，通过三种抗原成分的不同组合可分成三个型别:AB构成小川型、AC构成稻叶型、ABC构成彦岛型。彦岛型的抗原性不稳定，各型之间可以相互转换，以小川型和稻叶型为常见流行型别。（2）生物型 根据生物学特性，O1群霍乱弧菌可分为古典生物型和El-Tor生物型，两个生物型具有相同的血清型。El-Tor生物型是具有溶血性的生物型，现发现El-Tor生物型细菌在环境中的抵抗力、存活力更强，在我国流行的以El-Tor小川型为主。（3）噬菌体分型 根据霍乱弧菌对噬菌体的裂解模式不同进行分型，得到32个型，其中第组和第组噬菌体较为实用，前者以裂解古典生物型为主，后者仅对El-Tor生物型有高度特异性。2细菌特性（1）形态染色 革兰染色阴性，呈弧形或逗点状，菌体尾端有一鞭毛，运动活泼，悬滴镜检可见穿梭状运动，患者粪便直接涂片可见弧菌纵列呈“鱼群”样，O139群弧菌亦为单端单鞭毛，有荚膜。（2）培养特性 需氧或兼性厌氧菌，在1644均可生长，最适生长温度37；营养要求不高，在普通培养基上生长良好，耐碱，在pH6.810.2范围均可生长，一般增菌培养常用pH8.48.6的1碱性蛋白胨水进行选择性增菌。常用的选择性培养基有硫代硫酸钠-枸橼酸盐-胆盐-蔗糖琼脂平板（TCBS平板），霍乱弧菌发酵蔗糖产酸，菌落呈黄色；4号琼脂和庆大霉素琼脂平板，因含亚碲酸钾，霍乱弧菌在其上生长将培养基中的碲离子还原成元素碲，形成灰褐色菌落。血平板上菌落较大，El-Tor生物型可形成溶血环。可在无盐培养基上生长，但在含有高于60g/L氯化钠的培养基上不能生长；O139群霍乱弧菌能在无盐及30g/L氯化钠蛋白胨水中生长，不能在80g/L浓度下生长。（3）生化反应 氧化酶、明胶液化和吲哚试验阳性，发酵蔗糖和甘露醇，赖氨酸、鸟氨酸脱羧酶阳性，精氨酸双水解酶阴性。霍乱弧菌古典生物型和El-Tor生物型的区别见表12-1。（4）抵抗力 霍乱弧菌对干燥、热、酸和消毒剂均敏感，但在自然环境中存活时间较长， O139群霍乱弧菌在水中存活时间较O1群霍乱弧菌长。 表12-1 霍乱弧菌古典生物型和El-Tor生物型的区别特征古典生物型El-Tor生物型羊红细胞溶血-D鸡红细胞凝集-+VP试验-+CAMP试验-+多粘菌素B敏感试验+-组噬菌体裂解+-组噬菌体裂解-+注：+，90阳性；-，90阴性；D，10%89%阳性。3临床意义霍乱弧菌O1群和O139群是烈性肠道传染病霍乱的病原体。在自然情况下，人类是霍乱弧菌的易感者。人通过摄入霍乱弧菌污染的食物或水，引起霍乱。进入肠道的霍乱弧菌通过鞭毛运动穿过肠黏膜表面的黏液层，接近肠黏膜上皮细胞，通过普通菌毛的作用定植。肠道内的环境有利于霍乱弧菌的繁殖，产生霍乱肠毒素，导致疾病的发生。霍乱弧菌的主要致病因素是霍乱毒素（cholera toxin，CT），CT是目前已知的致泻毒素中最强烈的毒素,可造成肠液大量分泌，导致严重的呕吐和腹泻，使体内水分和电介质大量丢失，形成严重的水样腹泻综合征。4.微生物学检验 (1)检验程序 见图12-1。 标本（粪便、肛拭） 直接检查 碱性蛋白胨水增菌6h8h直接 直接 霍乱 与O1 选择性平板分离（TCBS、4涂片、 荧光 毒素 或O139群 号平板、庆大霉素琼脂）动力、 抗体 测定 抗体制动 染色 玻片试验 检查 凝集试验 可疑菌落 纯培养 涂片革兰 与O1群多 初步报告 染色 价血清或 O139群血清 革兰阴性弧菌 做玻片凝集 氧化酶（） 试验 涂片革兰 生化鉴定、 染色 O1或O139 镜检 群血清玻 片凝集试验 初报 报告图12-1 霍乱弧菌的检验程序(2) 标本采集 霍乱是烈性肠道传染病，检验标本主要以病人的大便为主，必要时呕吐物和被呕吐物污染的衣裤亦可作为标本。一般采取新鲜粪便，或用棉拭子插入直肠内45cm采取。病人标本最好床边接种，预计能在3h内进行培养者，可将肛拭子置于灭菌的含碱性蛋白胨水的试管中，或将1015ml大便放在带盖的广口瓶中，送往实验室。不能在3h内进行接种或需送至较远实验室的，应将标本转至卡-布半固体运送培养基中送检，避免使用甘油盐水缓冲运送培养基。送检标本应密封并派专人送达。（3）检验方法 1）显微镜检查 涂片染色:取病人“米泔水”样或黏液絮状粪便标本直接涂片，革兰染色或1：10稀释复红染色，镜检；一般新鲜粪便中弧菌较典型，排列呈“鱼群”状，菌株随人工培养传代次数增加或菌落放置过久而逐渐变为不典型的短杆状；动力观察：可用悬滴法、压滴法或暗视野显微镜观察动力，霍乱弧菌运动活跃，新鲜粪便标本中常呈“穿梭样”或“投标样”运动；制动试验：将病人“米泔水”样粪便或6h的增菌液0.25ml同0.25ml适当稀释的霍乱多价“O”免疫血清混合，5min后作暗视野或悬滴法检查，并以生理盐水与标本混合作为对照，有免疫血清存在时，菌体凝集成块，动力消失；直接荧光抗体染色检查和O1群抗原单克隆抗体凝集试验，可快速诊断霍乱弧菌感染。2）分离培养 将标本直接接种于碱性蛋白胨水，或将运送培养基的表层接种于碱性蛋白胨水中3568h后，转种至TCBS琼脂或4号琼脂或庆大霉素琼脂平板，35培养1218h观察菌落形态，TCBS上出现黄色菌落，4号琼脂或庆大霉素平板上出现灰褐色中心的菌落，均为可疑菌落，应使用O1群和O139群霍乱弧菌的多价和单价抗血清进行玻片凝集试验，结合菌落特征和菌体形态，作出初步报告。将与抗血清凝集的菌落进一步纯培养，依据全面的生化反应、血清学分群及分型进行最后鉴定。符合霍乱弧菌的菌株尚需区分古典生物型和El-Tor生物型（表12-1）。3）鉴定 用于霍乱弧菌的鉴定试验有：霍乱红试验:霍乱弧菌的两种生物型均呈阳性反应，但是，本反应并非霍乱弧菌特有，许多能分解色氨酸和还原硝酸盐的细菌，均能产生阳性反应；糖发酵试验:霍乱弧菌分解葡萄糖、蔗糖、甘露醇产酸不产气，不发酵阿拉伯糖；粘丝试验:弧菌属细菌除副溶血弧菌部分菌株外，均有此反应；O/129敏感试验：参照药敏试验方法进行。将O/129 10g和150g的纸片贴在接种有待测菌的琼脂平板上，35孵育1824h后，纸片周围出现任何大小的抑菌环均为敏感；O1群和非O1群霍乱弧菌均敏感，但已有对O/129耐药的菌株出现；O139群对O/129耐药，用此试验作鉴定时需特别谨慎，需结合其他试验结果加以综合考虑；耐盐试验:霍乱弧菌可在不含氯化钠和含有6氯化钠培养基中生长，氯化钠浓度高于6则不生长。4）霍乱弧菌的生物分型试验 见表121，这些试验中，每种试验都可能或多或少地存在例外情况，可根据实验室具体情况采用数种试验，多数符合，一般情况下即可判定霍乱弧菌的这两个生物型。（4）耐药性 致病性弧菌在MH培养基上生长良好，可用NCCLS规定的纸片扩散法进行体外抗生素药敏试验，常规测定氨苄西林、四环素、氯霉素、SMZ-TMP、呋喃唑酮。对于具有自限性的腹泻而言，体外药敏试验并非必需，但对监控弧菌的耐药性发展趋势有意义。（5）结果与报告 霍乱属于法定的甲类传染病，一旦从病人粪便标本中分离出霍乱弧菌，需立即向上级管理部门报告。（三）副溶血弧菌1细菌特性（1）形态染色特点 革兰阴性直或微弯的杆菌，常呈多形性。在液体培养基中形成极端单鞭毛，在固体培养基上，菌体形成侧鞭毛，运动活跃。无荚膜、无芽胞。（2）培养特性 需氧或兼性厌氧，营养要求不高，具有嗜盐性，在无盐或NaCl含量超过80g/L的培养基上不生长，最适NaCl浓度为35g/L，最适pH为7.78.0，最适生长温度3037。（3）生化反应 氧化酶试验阳性，能分解葡萄糖、麦芽糖、甘露醇、覃糖、阿拉伯胶糖和淀粉产酸，不分解乳糖、蔗糖、纤维二糖、木胶糖、卫矛醇、肌醇、水扬苷。甲基红、靛基质、明胶液化、鸟氨酸脱羧酶、赖氨酸脱羧酶和硝酸盐还原试验阳性，VP、硫化氢、尿素酶和精氨酸双水解酶阴性。（4）抗原 具有耐热的菌体（O）抗原、有群特异性；在菌体抗原表面存在表面（K）抗原，不耐热，能阻止O抗原发生凝集；还有鞭毛（H）抗原，不耐热，无特异性。（5）抵抗力 抵抗力弱，不耐热，在淡水中生存不超过2d，但在海水中能存活47d以上，耐碱怕酸。2临床意义 副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）具有嗜盐性，存在于近海岸的海水、海底沉积物、海产品（鱼类、贝类）及盐渍的蔬菜、肉、蛋品等中，当人食入未煮熟的海产品或污染本菌的盐渍食物而感染，潜伏期为610h不等，一般引起食物中毒和急性腹泻，病程23d，通常有自限性。副溶血弧菌通过菌毛的黏附，产生两种致病因子，一是耐热性溶血素（thermostable direct hemolysin，TDH），能耐受10010min不被破坏。动物试验表明具有细胞毒性、心脏毒和肠毒性，与人或兔红细胞膜上的神经节苷脂结合引起溶血，其致病性与溶血能力呈平行关系。另一致病因子为耐热相关溶血素（TRH）,其功能与TDH相似。3微生物学检验（1）检验程序 见图12-2。 粪便 可疑食物等 4NaCl蛋白胨水增菌 TCBS、嗜盐菌选择性平板 纯培养 神奈川现象 菌种鉴定 或毒素测定 (耐盐试验和生化鉴定) 报告 图12-2 副溶血弧菌的检验程序（2） 标本采集 首先采集病人粪便或肛拭子，其次是可疑食物，因本菌耐酸性弱，不易在呕吐物中检出，一般不采集患者呕吐物作本菌检查。标本采集后应尽快送检。（3）检验方法1）显微镜检查 一般不做直接镜检，必要时用分离培养的可疑菌落涂片革兰染色或石炭酸复红染色，同时做压滴法或悬滴法检测动力。本菌革兰阴性，两端浓染，带有弯曲状的杆菌，常呈多形性，表现为长杆状、球状或长丝状。动力阳性，运动活跃仅次于霍乱弧菌。2）分离培养 标本增菌，需接种至含40g/L NaCl的蛋白胨水中，37培养，若有副溶血弧菌，一般数小时即出现混浊，并可在表面形成菌膜。本菌在TCBS琼脂上可形成0.52.0mm大小、蔗糖不发酵的绿色或蓝绿色菌落；在SS平板上不生长或长出12mm扁平无色半透明的蜡滴样菌落，有辛辣味，不易刮下；在伊红美蓝平板上不能生长，在麦康凯平板上某些菌株不能生长，能生长者，菌落圆整、平坦、半透明或混浊，略带红色；从腹泻病人中分离到的菌株95以上可出现神奈川现象（Kanagawa phenomenon，KP），即在含高盐（70g/L）甘露醇的人O型血或兔血琼脂平板上产生溶血现象。在不含NaCl或含100g/L的NaCl培养基上不生长，在含30g/L和70g/L的NaCl培养基上可生长。嗜盐菌选择性平板上，本菌可形成较大、中心微微隆起、稍混浊、半透明或不透明的无黏性的菌落。3）鉴定 根据本菌的形态染色、动力阳性、氧化酶阳性，在TCBS等培养基上的生长特点、NaCl生长试验、神奈川现象阳性，各种生化反应鉴定、毒力试验（可用免疫学方法测定TDA和TRH）等可作出鉴定。（四）气单胞菌属1细菌特性 革兰阴性直杆菌，或呈球杆状或丝状，绝大多数有极端单鞭毛，动力阳性，但杀鲑气单胞菌和中间气单胞菌动力阴性，对人也无致病性。兼性厌氧菌，营养要求不高，普通培养基可生长；生长温度较广（045），嗜温菌于1042生长，动力阴性的嗜冷菌在不超过37（中间气单胞菌）或更冷的条件下生长（杀鲑气单胞菌），一些嗜温菌在22比在37的生化反应更活泼。氧化酶、触酶阳性，硝酸盐还原阳性，发酵葡萄糖及其他多种糖类产酸或产酸产气，产生多种酶类如淀粉酶、DNA酶、酯酶、肽酶、芳基酰胺酶和其他水解酶，除极少数菌株外，均对弧菌抑制剂O/129耐药。具体生化反应见表12-2。 表12-2 气单胞菌属和邻单胞菌属细菌的生化特征试验嗜水气单胞菌豚鼠气单胞菌维氏气单胞菌温和生物型维氏气单胞菌维氏生物型简氏气单胞菌舒氏气单胞菌脆弱气单胞菌类志贺氏邻单胞菌氧化酶+DNA酶+ND+ND-尿素酶-ND-吲哚+-+精氨酸双水解酶+-+赖氨酸脱羧酶+-+鸟氨酸脱羧酶-+-VP试验+-+-葡萄糖产气+-+-+-阿拉伯糖+-乳糖-+-ND-ND-蔗糖+-肌醇-+甘露醇+-+-水扬苷+-+-V纤维二糖V+VV-+-七叶苷水解+-+-溶血（羊血平板）+-+VV-头孢噻吩RRSSRSRS氨苄西林RRRRRRSSO/129（10g/150g）R/RR/RR/RR/RR/RR/RR/RS/S注：+，90阳性；-，10阳性；ND，未定；S，敏感；R，耐药2临床意义本属细菌自然栖生于水中，引起的疾病广泛存在于哺乳动物（如人、鸟类等）和冷血动物（如鲑、鱼、蛇等）中。在人类主要引起肠内感染和肠外感染，前者主要表现为胃肠炎，患者通常呈症状较轻的水样腹泻，症状严重，呈血性粪便且便中有大量白细胞者（和志贺菌引起的痢疾很相似）较少见，本菌是夏季腹泻的常见病原菌之一，主要致病物质为溶血毒素和细胞毒素；后者包括败血症、伤口、眼、关节、腹腔内及其他感染，主要与外伤后伤口接触了污染的水有关。杀鲑气单胞菌为嗜冷菌，通常存在于海水中引起鱼类等感染，不引起人类感染。3微生物学检验（1）检验程序 见图12-3。 粪便、脓汁、伤口分泌物 尿液 血液 离心取沉淀 肉汤增菌直接涂片 血平板或麦康凯平板革兰染色 分离培养 35 1824h镜检 可疑菌落 全面生化反应 涂片革兰染色 革兰阴性杆菌 氧化酶（+） 报告图12-3 气单胞菌的检验程序（2）标本采集 根据不同疾病采集粪便、肛拭子、血液、脓汁、脑脊液和尿液等标本，粪便标本用卡-布氏培养基运送较为适宜。（3）检验方法 1）显微镜检查 取脓汁、伤口分泌物等标本，革兰染色、镜检，气单胞菌属细菌为革兰阴性，两端钝圆的短杆菌，无芽孢，有薄荚膜；粪便悬滴检查，本菌运动活跃。2）分离培养 本菌在大多数普通培养基上可生长，常用的有血平板、麦康凯平板、加有10u/ml氨苄西林的血平板和CIN琼脂平板。在血平板上经372448h培养后可形成白色、光滑湿润、凸起、直径为2mm左右的菌落，多数菌株有溶血环（豚鼠气单胞菌不溶血），35d后菌落成暗绿色；在麦康凯平板上菌落无色，稍混浊无臭味，在液体培养基中呈混浊生长，在SS培养基和TCBS上不生长。3）鉴定与鉴别：氧化酶、触酶阳性、在麦康凯平板上生长、发酵葡萄糖产酸产气、还原硝酸盐为亚硝酸盐等为主要的鉴定试验，全面的生化反应见表12-2。与邻单胞菌和弧菌属的鉴别常用O/129敏感试验、TCBS生长试验和耐盐试验进行鉴别。气单胞菌属间细菌的鉴别：嗜水气单胞菌和豚鼠气单胞菌发酵阿拉伯糖，可与其他菌属鉴别，两者的主要鉴别点为前者VP试验和赖氨酸脱羧酶阳性而后者均阴性；维氏气单胞菌维氏生物型和温和生物型的区别为前者精氨酸双水解酶阴性、鸟氨酸脱羧酶阳性、七叶苷水解阳性而后者均相反，其他菌种间的鉴别见表12-2。（4）耐药性 绝大多数气单胞菌产生内酰胺酶，对青霉素、氨苄西林、羧苄西林、替卡西林耐药，但对广谱的头孢菌素、氨基糖苷类抗生素、氯霉素、四环素、甲氧苄啶-磺胺甲噁唑和喹诺酮类药物敏感，本菌属中唯一对氨苄西林敏感的菌种是脆弱气单胞菌，因此加入氨苄西林的选择性培养基可使脆弱气单胞菌漏检。绝大多数维氏气单胞菌温和生物型对头孢噻吩敏感，而嗜水气单胞菌和豚鼠气单胞菌对头孢噻吩耐药