（林产化学加工工程专业论文）螺旋藻变异株生物活性物质的研究.pdf

摘要 本文对螺旋藻的培养优化及其生物活性物质进行了研究。以提高螺旋藻直线型变异株 s p d z 胞内活性物质的含量为目的，对影响s p d z 生长及胞内藻蓝蛋白和多糖含量的各理 化因子进行了系统的探讨，并研究了螺旋藻藻蓝蛋白和多糖的抗肿瘤、抗氧化活性。主要 结果如下： 1 、通过螺旋藻变异株s p d z 的培养及培养条件的优化，确定了s p d z 的适宜培养条件 为：接种密度0 2 ( o d 5 6 0 ) ，光强3 5 0 0 l u ) 【，温度2 5 ，初始p h 值1 0 o ，以尿素为氮源添加 量为0 8 9 l 。 2 、通过对影响螺旋藻变异株s p d z 藻蓝蛋白和多糖含量理化因子的研究表明，当温 度2 5 、光强3 5 0 0 l u x 、初始p h9 5 、尿素用量o ：8 9 l 、葡萄糖添加量2 o g l 时，藻蓝 蛋白含量最高；当温度3 0 、光强4 5 0 0 l u x 、初始p h9 5 、尿素用量o 4 9 l 、葡萄糖添 加量2 o g 几时，多糖含量最高。 3 、采用d e a e s e p l 砭s ef a s tf l o w 、s d s p a g e 凝胶电泳、紫外可见光谱、红外光 谱等对藻蓝蛋白及多糖产品进行分析，结果显示：藻蓝蛋白纯度( o d 6 2 0 o d 2 9 0 ) 为3 7 4 ， 与试剂级4 o 接近，亚基分子量为3 5 9 k d a ，最大紫外吸收位于6 2 0 砌处，二级结构主要 以q 一螺旋结构为主；螺旋藻多糖组成单糖为吡喃糖，成苷的半缩醛羟基主要为a 构型。 4 、藻蓝蛋白对d p p h 自由基和o h 自由基均有一定清除作用，且对d p p h 自由基的 清除率可高达7 7 ：而多糖对d p p h 自由基和0 h 自由基的清除效果比较差。多糖和藻 蓝蛋白对肿瘤细胞都均有一定抑制效果，其中藻蓝蛋白对b e l 7 4 0 2 抑制效果最强，当其 浓度为4 0 0 u 咖l 时，抑制率可达3l ，而多糖对h l 6 0 抑制效果最好，在同样浓度下， 抑制率可达5 1 。 关键词：螺旋藻；培养优化：藻蓝蛋白；多糖；生物活性 s t u d y o nt h eb i o a c t i v ec o m p o u n d so f5 矽扫比砌口p 励而p 刀s 豇 m u t a n ts t r a i n a b s t r a c t 1 ko p t i m i z e dc u l t i v a t i o na i l db i o a c t i v ec o m p 0 蚰d so f 印驴甜矗阳p 肠胞脚捃h a v eb e e n s t u d i e di i lt l l i st l l e s i s t oi m p r o v et h ec o n t e n to fb i o a c t i v ec o m p o u r l d si i lt h ec e no f 印打扰胁搬 p 肠纪凇话m 咖ts 俩n ( s p d z ) ，m e 砌u e i l c eo fp h y s i c a la n dn 嘶e n tf a c t o r so n 也eg r o w t l lo f s p d z 觚dt h ec o i l t e n to fp h y c o c y a l l i n sa n dp o l y s a c c 王l a r i d e sw e r ei n v e s t i g a t e di i l d e t a j l f l l n l l e 肌o r e ；m e i ra n t i c a n c e r 觚da n t i o x i d a i l ta c t i v i t i e sw e r ea l s oi m ，e s t i g a t e d n l er e s u l t so f t h er e s e a r c ha r es u n u n a r i z e da sf 0 l l o w s ： 1 1 l ec u h i v a t i o nc o n d i t i o n so fs p d z 、r eo p t 砌z e dw i m 廿1 em e m o do fs i i l g l ef a c t o r t i l e r e s u l t ss h o wt h a t 也es u i 协l ec u l t i v a t i o nc o n d i t i 0 璐f o rs p - d za r e ：抵l l l a t i o nc o n c e l l 啾i o no 2 ( o d 5 6 咖) ，l i 啦i n t e n s i 够3 5 0 0 l u ) 【，t e m p e 锄玳2 5 ，p h 诃u e1 0 o ，觚d 也ed o s a g eo fu r e a 0 8 9 l a d d i t i o no for g ；m i cc a r b o nr e s o u r c ei i l2 知t o u km e d i 吼m a y a c c e l e r a t es p d zg r o w i | 1 t h e p h y s i c a la r l dn 删e n t f a c t o r sa 丘e c t i n gm ec o n t e n to fp h y c o c y 础a n dp o l y s a c c l 嘶d ei n t h e 印护以切口c e l l s 、e r ed i s c u s s e d 1 1 1 er e s u l t ss h o wt h a tt h el l i 曲e s tc o n t e n to fp h y c o c y a m n c a i l b eo b t a i n e dw h e nm ec u l t i v a t i o nc o n d i t i o n sa r e ：t e m p e r a t u r e2 5 ，l i 出i n t e i l s i t ) r3 5 0 0 l u ) 【，p h v 越u e9 5 ，u r e ao 8 9 l ，a n dg l u c o s e2 0 9 l o nt 1 1 eo t h e rh a i 】吐t h ek g h e s tc o n t e n to f p o l y s a c c h a r i d ei so b t 暑血e du n d e r t h ec o n d i t i o n s ：岬r a t u r e3 0 ，l i 出i n t e i l s 时4 5 0 0 l u ) 【，p h v a l u e9 5 ，u r e ao 4 9 la i l dg l u c o s e2 0 9 l d e a e s e p h 啪s ef a s tf l o w ，s d s - 队g e ，u v 觚df t 瓜w e r ee m p l o y e dt 0c h a r a c t e r i z e p h y c o c y a i l i n 锄i dp o l y s a c c d e 1 1 1 er e s u l t si n d i c a t e 也a tm ep 咖o fp h y c o c y 碰ni s3 7 4 ( o d 6 加d 2 8 0 ) ，w 拉c hi sc l o s et 0t h e 贼毽e n l 删e4 0 ，a 1 1 di t ss u b m l i tm o l e c u l a rw e i g h ti s 3 5 9 k d a i t sm a x i i i l 眦a b s o 印t i o ni sa tw a v e l e 呼h6 2 0 i l 玛a i l dq h e l i xc o r 面m l a t i o ni s l e m 萄o re l e m e n to f i t ss e c o n d a i d rs 仃u c t u r e t h er e s u l t sa l s os h o wt h a tt l l em 萄o rc o m p o n e n to fm e p o l y s a c c h 撕d ei i ls p d zi sp ) ，r 锄o s e ，a i l dt l l eh e m i a c e 谢h y d 的x y lt of o n i lg l y c o s i d ei s o 卜c o 州置留删i o n p h y c o c y a n j i lc a ne l i i n i i l a t eb o t hh y d r 0 x y lr a 【d i c a la i l dd p p h 砌i c a l ，a 1 1 di t sd p p hm d i a l s c a v e n g i n gr a t ec a nr e a c ha t7 7 c o 1 p a r e dt 0p h y c o c y 撕玛p o l y s a c c 蜥d es h o w sw e a k s c a v e n g i i l ga b i l i 时o nm ea b o v e 饥er a d i c a l s h la d d i t i o i l ，t h ea n t i c a l l c e ra c t i v i t ) ra s s a y i n d i c a t e st h a tt h ep h y c o c y a n i i la n dp o l y s a c c h 撕d el l a 、，ei n l l i b i t i o ne 虢c to ns o m ec a l l c e rc e l i s w h e nm e i rc o n c e r t r a t i i li sa t4 0 0 u m l ，t h ep h y c o c y a 证na i l dp o l y s a c c h a r i d eh a v ea i li n h j b i t i o n r a ：t eo f31 o nc a i l c e rc e l ib e l 7 4 0 2a n d51 o nc a n c e rc e l lh l 一6 0 ，r e s p e c t i v e l y k e y w o r d s ：印咖“z f 撇，o p t i m i z e dc u l t i v a t i o i l ，p h y c o c y 锄j i l ，p o l y s a c c h a d d e ，b i o a c t i v i 哆 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是誉人在导师的指导下进行的研究工作 所取得的成果。尽我所知，除文中已经特别注明引用的内容和致谢的地方外，本 论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做 出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式注明并表示感谢。本人完全意 识到本声明的法律结果由本人承担 学位论文作者( 本人签名) ：自氐整加诗年6 月f 1 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解南京林业大学有关保留、使用学位论文的规定，同 意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版( 中国科学技术 信息研究所；国家图书馆等) ，允许论文被查阅和借阅本人授权南京林业大学 可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以汇编和综合 为学校的科技成果，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论 文全部或部分内容。 保密口，在年解密后适用本授权书。本学位论文属于不保密影 ( 请在以上方框内打“ ” ) 学位论文作者( 本人签名) ： 指导教师( 本人签名) ： 加8 年6 月f1 日 嘲每6 其i 卜 致谢 本论文是在导师王飞教授的悉心指导下完成的。在攻读硕士学位期间， 导师在学习、科研和生活方面都给予了细致的关心，为本论文的顺利完成倾 注了大量的时间和精力。导师渊博的知识、严谨的治学态度、一丝不苟的科 学精神使我受益匪浅，终身难忘。值此论文完成之际，向导师表示衷心的感 谢及深深的敬意。 同时，感谢中国药科大学江苏省新药筛选中心的袁胜涛老师及林化系的 倪传根老师为实验产品的性能测试和分析提供的无私帮助，感谢化工院曾韬 教授、王石发副教授、罗金岳副教授、周建兵副教授在中期报告时给予本人 的宝贵指导。在此，谨向各位老师表示衷心的感谢。 在论文研究中，还得到王鹏、齐沛沛、李治林、周谭澈、连之娜等同学 的热情帮助，在此一并致以诚挚的谢意。 籍此机会向一直支持和关爱我的父母和亲人表达我由衷地谢意，他们的 鼓励是我前进的动力。 作者：白凤霞 二零零八年六月 1 文献综述 1 1 螺旋藻概述 天然活性物的研究一直是国内外研究的热点，在如今人类回归大自然的潮流下，天然 药物倍受人们的青睐。但随着陆地资源和可耕种面积的不断减少，全球性食品资源和能源 短缺的压力日益增加，所以开发和利用海洋资源是最长远的解决人类食品资源和能源的重 要途径。海洋微藻作为一种重要的的海洋资源，因其体内富含丰富的活性物质，已成为国 内外研究的热点。 螺旋藻作为微藻的一大类群，生活在地球上己有3 5 亿年的历史了。它主要分布在世 界各海区及陆地淡、盐水湖中，呈蓝绿色，富含蛋白质、维生素、不饱和脂肪酸、多糖和 矿物质，具有全面的营养价值和多种医疗功。2 0 世纪7 0 年代，螺旋藻被联合国食品会议 认定为“明天最好的食品资源”而加以推广，之后随着人们对螺旋藻的进一步了解和研究， 发现它不但含有丰富的蛋白质，而且还含有大量的对人体有益的微量元素及其它活性物质 如多糖、藻胆蛋白、亚麻酸，具有提高肌体免疫力，抗肿瘤、抗辐射、抗氧化、防治心 血管疾病等作用，因此螺旋藻这种纯天然的产物就更加受到人们的重视，越来越受到藻类 学界、营养学界和医学界的青睐。螺旋藻产品也已经投入市场，现已开发的螺旋藻食品有 螺旋藻粉剂、片剂、胶囊、速溶冲剂、饮料、口服液、啤酒、面条、保健盐、营养米粉、 冰淇淋、糖果、巧克力和饼干等【l j ，成为可食用微生物的佼佼者。 1 1 1 螺旋藻的分类地位及生长繁殖 螺旋藻的分类地位：螺旋藻( 勋砌，泐) 是一类低等藻类植物，属于蓝藻门 ( c 弦，z 印办蚴) 、颤藻目( 西c f 如幻r f 口昆d 、颤藻科( 伽c 砒砌n 妇e 口g ) 、螺旋藻属 ( i 跏咖“，帆砌伊) ，是地球上最早的光合生物之一。它是德国d e 证b e n 于18 2 7 年首次在非 洲撒哈拉沙漠乍得湖发现的一类藻，因其形似螺旋状而定名为螺旋藻【2 j 。它可以生长在土 壤、沼泽、盐水、海水、淡水及温泉中，特别是可以生长在热带和暖温带的海洋、沼泽及 盐湖中，甚至一些不适应其它微生物生长的环境，如高碱含量的湖泊中它也可以很好的生 长【3 1 。目前，被定名的螺旋藻有3 0 多个品种，如巨形螺旋藻( 勋f ，讲加口m 咖，) 、强势螺 旋藻( s 加以挖e 一) 、盐泽螺旋藻( s 掰6 s 口五锨) 、钝顶螺旋藻( 勋i ，甜f f 行dp 据纪玎s 蠡) 、极大 螺旋藻( 勋护甜胁垅似砌a ) 等，但被广泛研究和应用的主要为钝顶螺旋藻( 印护“z 砌 p 彪纪脚捃) 、极大螺旋藻( 印护甜，打懈朋缎砌口) 和盐泽螺旋藻( & j “6 瞰妇) 三个品种。 螺旋藻的生长繁殖：螺旋藻是一种多细胞的丝状微生物，丝体呈螺旋状，由短圆柱 形细胞组成，丝长5 0 3 0 0 岬、宽3 8 “m 。因其表面不具胶鞘，不易被微生物附着，细胞 内有气泡，上浮性好，适宜生长温度为2 0 3 5 ，p h 值以8 5 1 0 为宜1 4 j 。螺旋藻没有真 正的细胞核，藻丝的生长繁殖以细胞的不断横分裂和藻丝断裂为主来增加藻丝长度，是一 种光能自养型生物f 5 】，其藻细胞中含有光合层片( 类囊体) 、维生素、粗蛋白、粗脂肪、粗 纤维、灰分、胡萝卜素、碳水化合物等活性物质。 1 1 2 螺旋藻合成的生物活性物质 螺旋藻中含有丰富的生物活性物质，除含有蛋白质、糖类、脂类三大类活性物质外， 还含有丰富的钠、钾、钙、镁、磷、硫、铁、锌、锰等矿物质和微量元素，以及多种维生 素，有资料表明，l 埏螺旋藻的营养成分相当于1 0 0 0 埏各种蔬菜的总和【6 j 。 蛋白质：螺旋藻中蛋白质含量高达6 0 7 0 ，纤维素含量少，含有多种酶，易于营 养物质的吸收。藻蛋白中含有1 8 种氨基酸，且亮氨酸、蛋氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸等8 种氨基酸含量丰富而均衡。除此之外，螺旋藻蛋白还富含藻蓝蛋白，约为细胞干重的1 0 左右【1 7 1 。这些年的研究表明螺旋藻藻蓝蛋白具有较高的应用价值，在食品着色剂、化妆品 以及荧光探针等方面具有很大的应用潜力，是螺旋藻所含有的一种重要的生物活性物质， 近年来不少报道还表明螺旋藻藻蓝蛋白具有抑制肿瘤的功效【3 以。 多糖：螺旋藻中碳水化合物的含量约为l o 2 3 ，其中藻多糖占1 o 1 5 ，是一种 无毒的水溶性天然产物，其分子量约为1 2 0 0 0 1 6 0 0 0 ，是由多种单糖组成的杂多糖i l 引，研 究表明，螺旋藻多糖具有抗肿瘤，抗辐射，抗衰老，抗肌体免疫力以及降血脂等多种生物 学功能，已成为人们研究的热点之一i l h 】。 脂类：螺旋藻中脂类的含量为6 一1 3 ，其中一半为脂肪酸。所含脂类为糖脂，硫脂 和磷脂居多，甘油脂仅占1 2 ，其中绝大部分是不饱和脂肪酸，约占2 3 ，有月桂酸、 肉寇酸、棕榈酸、硬脂酸、十七碳二烯酸、油酸、亚油酸、丫亚麻酸含量等，其中丫一亚麻 酸的含量比较高，约占0 5 左右。近年的报道称，螺旋藻中含有的亚麻酸和亚油酸能降 低血脂和血液里的胆固醇，对防治心血管疾病有显著效果l l 孓1 6 j 。 维生素：螺旋藻中含有维生素b 2 、维生素b 1 2 、维生素c 和维生素e 等多种维生素， 种类全，含量丰富。值得一提的是，螺旋藻中富含b 胡萝卜素，其含量明显大于牛肝、 菠菜等其它营养食品。d 一胡萝卜素是维生素a 的前体，维生素a 在维持上皮组织的结构 与功能，维持正常的视觉中起着重要作用。而p 胡萝卜素本身也具有提高肌体免疫力， 抑制癌细胞的发生和生长的功能。此外，维生素b 1 2 几乎不存在于植物性食物中，可以说 螺旋藻是维生素b 1 2 含量最高的天然植物性食物【 j 。 微量元素：螺旋藻中的铁、锌、硒、碘、氟等微量元素的含量丰富，其中螺旋藻中 所含的铁都是人体可吸收性的铁质。据报道，每天服用少量的螺旋藻粉( 4 8 9 ) 便可满足 人体对大部分维生素及微量元素的需求。 除了上述活性物质外，螺旋藻中还有一些未知的生物活性物质，如一些激素、萜类、 甾体、生物碱、强心甘、抗病毒物、色素等。从螺旋藻所含的生物活性物质中，可以看出 螺旋藻的营养元素的含量已经打破了多项记录：它比任何已知的天然食品含有更多的p 一 胡萝卜素、可吸收性的铁、维生素b 1 2 以及y 亚麻酸。 2 1 1 3 螺旋藻的国内外研究及开发利用状况 螺旋藻开发利用最早的是中非乍得土著人，当时只是作为填肚食品。对螺旋藻的真正 研究开始于1 9 6 5 年，1 9 7 0 年由墨西哥的s o s a t e x c o c o 公司投资的世界第一座螺旋藻大规模 工业化生产的工厂建成。随后几年内，日本、以色列、美国以及我国台湾地区也相继建立 了很多螺旋藻工厂。我国对螺旋藻的研究比较晚，开始于2 0 世纪8 0 年代，并多次自国外引 进钝项螺旋藻的藻种，1 9 8 3 年在江西成功的进行了螺旋藻的繁殖实验并收获了一批干品。 张景襄等在国内首次进行了螺旋藻的工厂化培养和食品添加剂螺旋藻粉的制作。此后广 东、云南、湖北、山东、江苏等沿海省市相继建立了螺旋藻厂。“九五”期间，螺旋藻的优 良品系的筛选、螺旋藻生物反应器的研制及螺旋藻深加工已列入国家高新技术研究发展计 划( 8 6 3 计划) 【1 3 】。自2 0 0 0 年以来，基因工程成为改良和创建生物技术良种的有力武器， 在螺旋藻的基因识别和克隆研究方面取得了不少有意义的成果。 目前国内外的研究主要集中在以下几个方面： 1 利用现代生物技术( 包括分子遗传学和基因工程等技术) 培育各种不同特性、富含 某种成分的螺旋藻优良品系。张晓辉等1 1 9 j 人将h o x y 基因的克隆应用于螺旋藻系统学中。 郭建军等【2 0 】人进行钝顶螺旋藻f e s o d 基因的克隆。 2 研发和寻求能进行高密度培养螺旋藻的培养生物反应器和方法。目前人们不断的进 行优化培养基配方和生物反应器。 3 采用先进的分离纯化手段从螺旋藻中提取高质量的活性成分以及提高这些成分的 活性药用价值。刘国清掣2 1 】人用螺旋藻来治疗贫血症，乐晓桐【冽等人将螺旋藻多糖修饰 后治疗肿瘤。孔玉沙等【2 3 1 人复方补骨脂酊联合螺旋藻胶囊治疗自癜风。 在应用上主要表现在以下几个方面： 食品与保健品：螺旋藻被f a o 誉为人类未来最理想的食品，螺旋藻作为一种丰富而 均衡的蛋白质补充剂，大多以粉状、片状或丸剂的形式投放市场。现己开发的螺旋藻食品 有螺旋藻粉剂、胶囊、饮料、口服液、啤酒、面条、保健盐、冰淇淋、糖果、巧克力和饼 干等。此外其他像乳酪、酸乳酪和豆腐这样的发酵食品的制作，也为螺旋藻的应用提供了 许多可能性。 医药行业：螺旋藻富含的活性物质，对许多疾病具有特殊的医疗和保健作用，具有 显著的抗辐射、抗突变功能，可用于防治癌症、抗衰老，增强肌体的免疫力等多种功能。 它所富含的p 胡萝卜素被称为“抗癌之神”，藻蓝蛋白具有抗肿瘤作用，还可以作为荧光 探针用于免疫学研究。 畜牧业：螺旋藻可明显提高肉鸡的日增重及蛋鸡的产蛋率和成活率、降低饲料消耗、 改善胴体性状和蛋黄颜色。研究发现，饲料中添加2 螺旋藻，可使雏鸡成活率提高1 6 8 ， 增重幅度提高3 3 4 ；在蛋鸡饲料中添加螺旋藻，提高产蛋率1 0 左右。螺旋藻还是一种 营养价值很高的优质饵料，可提高水产动物特别是海珍品育苗成活率，降低育苗成本，提 高幼体的免疫力和活力，改善肉质、增加鱼体光泽。 化妆品业：螺旋藻可提高皮肤细胞的免疫力，保护皮肤的自我调节功能，防止水分 流失，抵抗紫外线侵害，消除皮肤表面自由基，增加皮肤胶原蛋白的合成，软化角质层， 3 促进血液循环和皮肤再生，可起到防皱、防晒、抗辐射、美白、祛斑、抗衰老的作用，并 可促进头发生长。根据北京医科大学药物所、昆明医学院等皮肤科和医学美容等单位进行 的2 3 6 例临床试用表明：螺旋藻营养液能提供皮肤所需氨基酸、藻多糖、s o d 等多种营养 活性成分，有增加皮肤弹性、润肤保湿、除皱、祛斑等功效。 环保方面：螺旋藻具有良好的营养价值及药用价值，但随着可适合螺旋藻生长的水 体的逐渐减少，如何减少场地耗费，同时利用工业废水来培养螺旋藻成为最近几年的热门 研究方向。因其在生长繁殖过程中需要吸取大量营养物质，具有生长繁殖快、适应性强， 具有更高的可发酵性的特点，因此，螺旋藻是一种用于废水处理很有前途的微藻，它不仅 具有上浮性，且丝状的螺旋藻比较容易从培养液中分离出来，易于收获，生长过程中还能 分泌胞外生物絮凝剂，从而强化了废水处理过程。 1 1 4 影响螺旋藻生长及活性物质含量的理化因子研究 影响螺旋藻生长的理化因子主要是温度、光照强度、p h 值、营养条件等，它们对螺 旋藻的生长、化学组成及含量均有影响。通过改变碳、氮源浓度、温度、光照强度、光质 等，都可以使螺旋藻富集某种特定的化学成分。 温度：温度是影响螺旋藻细胞代谢活动的主要因子，温度对藻细胞的影响主要从两 方面研究，一方面与藻细胞的组成物质有关，特别是蛋白质、脂肪；另一方面是与反应有 关的温度系数，细胞主要是从这两方面进行包括酶反应、细胞渗透性和细胞组成等代谢调 节。当外界培养温度逐渐升高时，细胞的比生长速率升高；当温度达到其最适生长温度时， 细胞的呼吸速度和新陈代谢加快，细胞的比生长速率达到最高；此后随着温度的升高，呼 吸速率大于光合速率，反而不利于细胞生物量的积累；当温度超过细胞的生长极限温度后， 由于细胞内调节代谢的某些限速步骤受到破坏，细胞比生长速率呈直线下降，细胞死亡。 温度的改变不仅影响螺旋藻的生长速率，还影响螺旋藻的组成。研究表明在温度为 3 6 3 8 下培养的螺旋藻，其总脂类、叶绿素、糖脂类都大于在2 5 2 7 下培养的螺旋藻。 大多数情况下，提高培养温度，脂肪酸含量增加，多不饱和脂肪酸，含量减少；降低培养 温度，磷脂含量增加，不饱和脂肪酸的合成提高，但抑制了糖脂和叶绿素的积累【2 4 j 。张 少斌等1 2 副研究表明温度为3 0 3 5 时，螺旋藻生长速率及藻胆蛋白含量均最高。 光照强度：螺旋藻在光合自养的生长过程中，当营养和温度不限制其生长时，光就 成为影响其生长的主要因素，其生长率和生物量是光照度的函数，在适宜的光照强度范围 内，螺旋藻生物量和蛋白质含量随着光照度的增加而增加。当光辐射强度超过一定值时， 螺旋藻生长受到抑制。光照度还影响螺旋藻的色素含量，及其利用有机碳源和氮源进行的 混合生长。其脂肪酸组以及饱和与不饱和脂肪酸的比例也受光照条件的影响。研究表明光 照强度对螺旋藻生长有很大影响，适宜的温度有利于螺旋藻的生长，当温度低于5 0 0 l u ) ( 时，则看不到螺旋藻生长，当光照强度达到4 0 0 0 l u ) 【时，螺旋藻生长速率达到最大【2 6 j 。尤 珊等1 27 j 研究表明提高光照强度不仅有利于提高细胞生物量，同时能促进胞外多糖的分泌， 也加速藻体的衰老。光照强度为2 0 k 1 ) ( 的生长速率和胞外多糖的分泌量分别是1 0 k l x 的两 倍和三倍。 4 此外光质对螺旋藻生长也有一定影响，根据张爱琴1 2 8 】的报道，钝顶螺旋藻在较高光 强下，红、黄、蓝、绿、白五种不同的光照中，红光对生长最有利，绿光最差。尤珊等人 的研究表明红光有利于螺旋藻的生长：绿光则能明显刺激螺旋藻胞外多糖的分泌。综上所 述可知，光强与光质对螺旋藻的生长和活性物质含量有很大影响1 2 。 p h 值：螺旋藻是一种能够耐受高碱、高温、高盐环境的优势种，与其它藻类相比， 它可以很好的耐受p h 的逐渐改变，但是p h 的突然改变对其生长是有害的。般来说， 螺旋藻的最适p h 为8 5 1 0 5 ，在此p h 范围内，藻细胞生长良好。当p h 超过l o 5 时，可 以利用的c 0 2 量将受到限制，藻丝变短，培养液颜色发黄，老化并裂解，细胞内容物渗 出，当p h 超过1 1 o 时，藻丝体开始结块，即使在振摇下也难以将藻体分散开。徐明芳等 幽j 研究表明，培养基的初始p h 值在7 o 1 1 o 碱性范围内，螺旋藻培养液的光密度值增长 趋势最好，尤其是p h 值为9 o l o 0 时，螺旋藻生长速度最快。当培养液p h 值为1 2 0 时， 螺旋藻生长受到抑制，培养液光密度值基本不变。所以为使螺旋藻的达较好的生长，控制 适宜的p h 值十分重要。 氮源：氮源就是能提供氮素构成微生物细胞的原生质成分或代谢产物中氮素来源的 营养物质，氮源对螺旋藻的生长起着十分重要的作用。螺旋藻中的蛋白质、核酸等物质的 合成依赖于氮源，螺旋藻所产生的挥发性物质的量也依赖于氮源，氮源对螺旋藻的叶绿素 合成也具有重要意义。在适宜的氮浓度下，螺旋藻对氮源吸收利用率的高低，直接决定着 藻蛋白质的含量，同化的氮越多，藻体合成的蛋白质亦越多。 螺旋藻可以利用无机氮源，也可以利用有机氮源进行生长。硝酸盐是可被螺旋藻同化 的主要氮源，亚硝酸盐也可作为螺旋藻的氮源，且和硝酸盐以同样的方式影响着螺旋藻生 物量的积累。目前科研工作者正摸索着以合适浓度的硝酸铵、氯化铵、硫酸铵等为螺旋藻 的生长提供氮源。沙珍霞等【3 0 】研究表明螺旋藻可同时利用硝态氮和铵态氮，这样既可以 满足藻体的最佳生长需求，又可以降低生产成本。螺旋藻可利用的有机氮源有尿素、酰胺、 氨基酸、蛋白质，其中尿素是最常用的有机氮源。曹世民【3 i 】等研究表明显示使用尿素作 为有机氮源比硝酸钠作氮源的生长好。其原因可能是尿素在碱性培养基中容易分解产生铵 离子，可以直接被螺旋藻吸收利用，而硝酸根离子需经转化后才能进入氮代谢过程。刘传 琳等【3 2 j 研究表明，以尿素代替硝酸钠作为氮源有利于螺旋藻生物量和藻胆蛋白含量的提 高。藻胆蛋白在蓝藻中起着动态氮库的作用，当氮源缺乏时就分解作氮源，当氮源充足时， 其含量就会升高。但尿素含量不能过高否则会引起氨中毒( 尤其在高温时) 。尤珊等j 的 研究则表明，螺旋藻对尿素利用率不如硝酸钠好，此外氮源对螺旋藻生长及胞外多糖积累 有显著影响。可见选择何种氮源，以及以何种剂量给氮应视具体藻种而定。 碳源：螺旋藻属于光合自养微藻，可以直接利用空气中的c 0 2 进行生长，但c 0 2 必 须先溶于水，且主要以h c 0 3 。的形式被利用。h c 0 3 是螺旋藻生长的主要碳源，在z 锄u l 【 培养基中，n 棚c 0 3 作为主要的的碳源，其一方面满足螺旋藻生长的碳素需求，另一方面 作为两性物质决定着z 舭o u l ( 培养基的碱性环境。对于岍c 0 3 的添加量及添加方式人们 已经进行了大量的研究，但近几年对螺旋藻的混合营养培养研究比较热门，即在光和无机 碳源的存在下，再加入一定的有机碳源，使螺旋藻进行混合营养生长。在混合营养培养的 过程中，螺旋藻的生长包含两个功能上相互独立、作用上相互协调的代谢过程，即光合自 5 养代谢和有机底物的好氧呼吸。混合营养生长实质上是光合自养和完全异养的综合体现。 一般认为螺旋藻利用有机碳源是为了弥补藻细胞进行光合自养时能源和碳源的不足，并使 藻细胞在光受限制时仍能获得良好的生长。在混合营养培养下，光合反应速率加快、光饱 和值增高、暗呼吸和光补偿点也显著提高，藻体生长快，生物量较自养大大提高。 螺旋藻可利用的有机碳源主要有糖类、有机酸、氨基酸和某些醇类等，其中研究最多 的是葡萄糖，葡萄糖可以直接构成细胞成分，促进螺旋藻细胞增值。于丽娟等p 4 j 研究表 明葡萄糖浓度螺旋藻生量积累有影响，发现混合营养培养时4 0 9 l 葡萄糖是最佳添加量。 马成浩等【3 5 】研究表明两个重要指标，同时添加2 0 9 l 醋酸钠和4 0 9 l 葡萄糖时，螺旋藻细 胞产率和胞内多糖含量达到最高。可见添加有机碳源进行混养培养可以大大促进螺旋藻生 长及胞内活性物质的积累。 培养方法：螺旋藻的培养方法有两种：静止培养和流动培养。当螺旋藻的营养要求 以满足，其它环境因子也不限制藻体生长时，藻体的流动培养就成为获得高生物量的重要 条件，采用合适的循环速度进行流动培养，可以大大提高生物量。陈必链等p 6 j 研究表明 采用摇瓶培养，生物量明显优于静止培养。一方面摇瓶培养具有促进气液传递、液固传递 的作用，可以防止藻体下沉有利于藻细胞充分的吸收培养液中的营养物质，同时由于光在 培养液中存在衰减现象，特别是在深层培养中，光衰减很明显，摇瓶培养具有良好的混合 效果，使藻细胞接受光强均匀。另一方面摇瓶培养最主要的是能将藻体产生的大量氧气 从培养液中排出，从而使培养液中维持适中的溶解氧。培养液中过高过低的溶解氧都不利 于螺旋藻的生长，在高氧含量下，促进了螺旋藻的光呼吸和氧气对光合作用的直接抑制。 而维持培养液中适宜的溶解氧，使藻光合色素量减少，能进行高效的光合作用，从而促进 螺旋藻生长。 其它因子：除了前述的影响因子外，许多科学工作者还采用磁场、激光等物理技术 来调节螺旋藻的生长，以达到提高生物量的目的。磁场通过改变培养液的电导率来提高细 胞膜的渗透性，增进细胞对矿质离子的吸收，促进细胞的光合效率。激光辐射可以通过光、 热、压力和电磁效应的综合作用，直接或间接影响生物机体，引起细胞d n a 或r n a 、 质粒、染色体畸变效应，酶的活化或钝化，以及细胞分裂和细胞代谢的改变。 1 2 螺旋藻藻蓝蛋白的研究进展 藻蓝蛋白是一类普遍存在于蓝藻细胞中的光合辅助色素，是一种重要的色素蛋白，由 开链四吡咯化合物和脱辅蛋白通过硫链键结合而成。基本结构由q 、b 亚基构成，且多以 三聚体( a b ) 3 和六聚体( a b ) 6 形式存在。根据吸收光谱特性的不同，藻蓝蛋白可分为 c 一藻蓝蛋白和r 藻蓝蛋白，其结构和吸收光谱如图1 1 和1 2 所示i j ，二者均在6 2 0 衄 处出现最大吸收值，所不同的是r - 藻蓝蛋白在5 5 6 i l i i l 处有一较小的吸收峰。藻蓝蛋白是 螺旋藻细胞中起重要光合作用的天然色素，可发蓝色荧光，和生物素、亲和素以及单克隆 抗体结合可制成新一代荧光探针，广泛用于癌症、白血病的治疗中j 。 目前，国际上藻蓝蛋白及标记物的售价相当高，因而研究和开发藻蓝蛋白是一种具有 高经济效益的项目。近几年来，藻蓝蛋白的研究开发主要集中在以下几个方面：一、探索 6 一种适用于工业化生产的大量的藻蓝蛋白的制备方法，降低藻蓝蛋白的成本，以促进其广 泛地开发利用。二、根据藻蓝蛋白活性研究的结果，将藻蓝蛋白的开发从功能性食品扩展 到药品及其医疗诊断试剂开发上来，以更深层次地开发其利用价值。三、深入研究藻蓝蛋 白的理化特性并建立一个良好的质量控制方法，为藻蓝蛋白产品尤其是药品的研究生产 提供质量保障。 尉c h ； hh r = ( ( 取2 ) 虻d o h 图1 1 藻蓝蛋白结构 f i g 1 - ls t m c t u r eo fp h y c o c y a i l i n c p h y c o 哕鲫证r 锄y c o 妒n 蛔 a b 图l - 2 藻蓝蛋白的紫外厨见吸收光谱图 钆c 藻蓝蛋白 b r 藻蓝蛋白 f i g 1 - 2u vs p e c 仃ao f p h y c o c y a i l i n 钆c - p h y c o c y a n i mb r p h y c o c y a n i i l 1 2 1 螺旋藻藻蓝蛋白提取研究 螺旋藻藻蓝蛋白是一种水溶性蛋白，提取比较方便，一般采用研磨法、组织捣碎法、 冻融法或超声波处理的方法破碎细胞，也有人加入溶菌酶处理。然后对细胞破碎液进行离 心或过滤，即可获得藻蓝蛋白的粗提液。粗提液再经硫酸铰盐析，所得沉淀溶于低浓磷酸 盐缓冲液中，并经透析、离心等得到上清液后，进行柱层析，即可获得藻蓝蛋白的纯化液， 纯度可达到3 7 左右。衡量藻蓝蛋白质量及纯度的重要指标之一是其在6 2 0 衄和2 8 0 n m 下的吸收的比值。根据日本的规定试剂级的藻蓝蛋白要求o d 6 2 0 o d 2 8 0 4 0 ，而食品级的 藻蓝蛋白则是要求o d 6 2 0 ，0 d 2 8 0 0 1 1 3 圳。 通常采用的粗提方法有：盐析法、结晶法、等电点沉淀法、超滤法【4 们。藻蓝蛋白的 纯化方法有羟基磷灰石柱层析法，d e a e 纤维素离子交换柱法，葡聚糖凝胶柱层析法。张成 7 武等【4 1 】研究表明，藻胆蛋白粗提液经过多次h a 柱层析，再经s p h a d e xg - 1 0 0 层析，得单一 蛋白溶液。用该法反复提纯效果较好，得到的蛋白纯度达4 5 。林卫红【4 2 j 研究表明藻胆蛋白 粗提液先用硅藻土5 4 5 柱层析，用梯度浓度的p h 7 o 的硫酸铵溶液分级洗脱，再分别上 d e a e 纤维素柱，用磷酸盐缓冲液0 h 6 o ) 洗脱。洗脱液再经盐析，沉淀，渗析，离心，上清 液即为纯化的藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白，能达到4 以上的纯度。a 玎a 瑚i k 郴j 研究表明藻蓝蛋白 粗提液经分步盐析后，再经d e a e s e p h a r o s ec l 6 b 柱层析后纯度达4 o 以上。 1 2 2 螺旋藻藻蓝蛋白的生物活性研究 近年来，国内外研究表明，螺旋藻藻蓝蛋白具有抗辐射、抗感染、抑制肿瘤、抗过敏、 增强免疫力等多种功能，并且已应用于食品、化妆品、医药等行业。 抗癌活性：藻蓝蛋白的抗肿瘤活性机制表现在多方面。可以直接杀伤肿瘤细胞，也 可以通过提高肌体免疫力对活体瘤进行抑制。1 9 8 2 年i i i i m a 哗j 首先发现了给注射有肝肿 瘤细胞的实验小鼠口服藻蓝蛋白后，小鼠的成活率明显提高，且淋巴细胞活性明显高于对 照组。王勇等【4 5 】研究发现藻蓝蛋白对体外培养的h e l a 细胞有较强的抑制生长作用，且随 着培养体系中藻蓝蛋白浓度从l o m 叽增高至8 0 m g l ，抑制率逐步提高，可从3 5 升至 3 l 。r e d d y 等1 4 6 】发现，藻蓝蛋白可选择性抑制环过氧化物酶2 2 ( c o x 2 2 ) 活性，已知c o ) ( 2 2 在炎症和肿瘤时高表达，且c o x 2 2 抑制剂可诱导细胞凋亡。 抗炎作用：关于藻蓝蛋白抗炎作用的实验研究，国内外均有开展。国内黄峙等即j 观 察了含硒藻蓝蛋白对四氯化碳( c c l 4 ) 致小鼠急性肝损伤的拮抗作用。以2 的c c l 4 油灌胃 复制小鼠急性肝损伤模型。i b m a y 等【4 8 】第一次报道了藻蓝蛋白具有抗炎、清除氧自由基 的作用，他们研究证明藻蓝蛋自在1 2 种炎症实验模型中表现出剂量相关的抗炎效应，可 以减轻炎症组织的水肿。 抗氧化作用：关于藻蓝蛋白的抗氧化作用，r 0 m a y 等【4 9 j 研究表明藻蓝蛋白可以清除 烷基、羟基、过氧基，可以抑制由f e 2 + 、坏血酸致微粒体脂质过氧化。b h a t 等【5 0 j 认为， 藻蓝蛋白还可以清除o n o o ，且其清除氧自由基作用与其发色团有关。 其他活性：近来的研究表明藻蓝蛋白还具有促进细胞生长、神经保护、免疫调节等 作用如能够促进植物血凝素( p h a ) 刺激淋巴细胞转化的作用，提高粒单系祖细胞集落形成 单位( c f u g m ) 的增殖水平，促进粒单系祖细胞的生成。 1 3 螺旋藻多糖的研究进展 螺旋藻多糖实际上是一种由多种单糖组成的杂多糖，其在藻体内含量只有o 5 2 ， 但对人体具有多种特殊生理作用如抗癌、抗辐射、抗衰老、降血脂肌体免疫调节等作用， 因而受到科学界及医药业高度重视。 1 3 1 螺旋藻多糖的提取研究 由于螺旋藻多糖复杂的化学成分，使螺旋藻多糖的提取过程相对复杂，并且螺旋藻多 8 糖的提取率到目前为止没有准确的概念，其提取率、产品质量因人而易，因培养条件、提 纯方法而差别很大。从螺旋藻中提取多糖的方法一般采用热水提取或碱提取，也有报道采 用微波辅助提取及酶法抽提的。所提取的多糖多为白色粉末，也有报道为灰绿色粉末，易 溶于水，难溶于乙醚、丙酮、高浓度乙醇等有机溶剂。因螺旋藻中蛋白质约占细胞干重的 6 0 7 0 ，所以提取螺旋藻多糖关键是有效地去除蛋白质。目前，去蛋白的方法主要有以下 几种：s e v a g 法、泡沫分离技术、三氯乙酸( t c a ) 法、加热浓缩法、酶法。s e v a g 法 是去蛋白质的经典方法，通常只适用于除少量蛋白，而且必须重复多次。t c a 法去蛋白 能缩短流程，多糖损失率降低，有利于后继纯化。用酶法降解蛋白质能提高多糖粗产品的 得率，但所得成分中仍有3 0 以上的蛋白质。螺旋藻多糖的纯化方法有( 1 ) 离子交换纤维 素层析，常见的有d e a e 纤维素、以及d e a e s e p h a r o s e 。( 2 ) 凝胶过滤法，主要有葡聚 糖凝胶( s e p h a d e xg ) ，琼脂糖凝胶( s e p h a r o s e ) ，聚丙烯酰胺凝胶( b i o g e lp ) ，一般采用 s e p h a d e xg 1 0 0 或s e p h a d e xg 2 0 0 、s e p h a 巧ls 1 0 0 。孙向军驯采用双酶法( 胰蛋白酶、木 瓜蛋白酶) 提取螺旋藻多糖，脱蛋白效果接近1 0 0 。通过d e a e s e p h a r o s e 和 s e p h a d e x g 5 0 纯化粗多糖，得到2 个纯的多糖组分。钱志刚等( 5 2 】采用三氯乙酸( t c a ) 沉 淀蛋白质提取螺旋藻多糖，得到产品为白色粉未，提取率1 3 0 l - 3 7 ，产品中多糖质 量含量9 3 8 ，蛋白质质量含量fl 2 0 1 5 兰1 o 0 5 o o 2 0 04 0 0 6 0 08 0 0 九n m 图3 1 3d e a e s e p h a r o s ef a s tf l o w 第5 洗脱峰吸收光谱 f i g 3 一1 3u vs p e c 仃u mo ff h c t i o n s5o b t a i n e df b md e a e s e p h a r o s ef a s tf l o wc h r o m a t o g r a p h y 峰l 扫描后在4 1 7 ，6 2 0 ，6 7 6 衄处有吸收峰，6 2 0 啪处的吸收峰只有0 1 左右，说 明该洗脱峰洗脱下来的主要是叶绿素( 6 7 6 姗，4 1 7 m ) ，几乎不含藻蓝蛋白。 峰2 扫描后在2 5 5 ，4 1 3 ，6 7 5 咖处有吸收峰，在6 2 0 1 1 r n 处没有吸收峰，说明该洗脱 峰洗脱下来的是叶绿素( 6 7 6 眦，4 1 3 衄) 和核酸( 2 5 5 i u l l ) 物质而不含藻蓝蛋白。 峰3 、峰4 扫描后在2 5 5 m 处有吸收峰，在6 2 0 衄处也没有吸收峰，说明该洗脱峰 洗脱下来的是核酸类物质而不含藻蓝蛋白。 峰5 扫描后结果如图3 1 3 所示，在2 8 0 n m 、3 6 0 n m 、6 2 0 m 处有吸收峰，且在6 2 0 r 吼 处的吸收峰最强，说明该峰为目标藻蓝蛋白的洗脱峰，且根据其最大紫外吸光值位于 6 2 0 嘲处，而在5 5 6 啪处没有吸收峰可判断该藻蓝蛋白为c 藻