（生物医学工程专业论文）小鼠骨髓间质干细胞的分离及其诱导定向脂肪细胞分化.pdf

硕士学位论文中文摘要 不同的剂量或处理条件下会使之向骨及软骨组织和脂肪组织几个方向分 化，只是所占比例不同，脂肪比例少时只有6 - 1 0 ，生成成熟脂肪细 胞的条件不稳定。那么本文旨在研究最适宜的诱导方案，优化诱导条件， 通过免疫组化的方法加以鉴定，最大程度的定向成脂。我们观察到传代后 纯化的m s c s 成脂后油红染色呈桔红色，胞内充满脂肪滴，倒置显微镜下 目测十个非重叠视野统计后成熟脂肪细胞比例达9 0 以上。检测碱性磷 酸酶染色阳性，m a c 一1 和因子染色阴性，排除巨噬细胞，中性粒细胞和 造血细胞的可能。本实验为组织工程和进一步研究在生理病理状态下 m s c s 成脂过程奠定基础。 目的建立小鼠骨髓间质干细胞( m s c s ) 的分离和鉴定方法；稳定和 优化骨髓间充质干细胞在体外定向向脂肪细胞分化的适宜诱导条件；初步 探索其向脂肪细胞组织工程的可行性，为解决临床软组织缺损的损伤修复 和整形难题提供理论和实践基础。 方法采取贴壁细胞分离法，分离和纯化小鼠骨髓m s c s ；选用第5 代 小鼠骨髓m s c s ，分别采用c f u f 培养法和c f u - f 集落再克隆生成c f u - f 集落法鉴定骨髓m s c s 的增殖和自我更新能力；利用不同组合的成脂培养 基定向诱导骨髓m s c s 分化为脂肪细胞；利用油红0 免疫组化染色鉴定分 化后的细胞。 结果分离和纯化的小鼠骨髓m s c s 呈均匀有序的成纤维母细胞样形 态；植入2 0 0 0 个1 0 0 0 0 0 个细胞i m 时，可生成不同比例的纯的c f u f 集落，所生成纯的c f u - f 集落数与种入的细胞数呈良好的线性关系；小型 c f u f 集落再克隆生成c f u - f 集落的能力较弱；而大型c f u f 集落具有较 硕士学位论文中文摘要 高的再克隆生成c f u - f 集落的能力，再克隆生成c f u f 集落率高达9 0 ， 而且往往一个目的集落可再克隆生成多个c f u - f 集落；不同诱导方案均可 诱导m s c 生成脂肪细胞，而合用地塞米松、3 一异丁基一卜甲基黄嘌呤、胰 岛素和消炎痛时效果最佳，诱导m s c 生成脂肪细胞的效率可高达9 6 以上。 绝大多数为油红0 染色阳性的成熟脂肪细胞。 结论实验结果表明我们采取贴壁细胞分离法，经过长期传代可得到 纯化的小鼠骨髓m s c s ；这种小鼠骨髓m s c s 具有高度的增殖能力、自我更 新能力和定向分化为脂肪细胞的能力。卜甲基- 3 - 异丁基黄嘌呤、地塞米 松、胰岛素、消炎痛四种诱导剂合用可导致9 6 以上的小鼠骨髓m s c s 定 向分化为成熟脂肪细胞。 关键词间质干细胞，脂肪细胞，组织工程，基因表达 l l i 硕士学位论文 英文摘要 a b s t r a c t h u m a nm e s e n c h y m a ls t e mc e l l sa g et h o u g h tt ob em u l t i p o t e n tc e l l s ，w h i c ha r ep r e s e n ti na d u l tm a r r o w ，t h a tc a nr e p l i c a t ea su n d i f f e r e n t i a t e dc e l l sa n dt h a th a v et h ep o t e n t i a lt ob ed i f f e r e n t i a t et ol i n e a g e so fm e s e n c h y m a lt i s s u e s ，i n c l u d i n gb o n e ，c a r t i l a g e ，f a t ，t e n d o n ，m u s c l e ，a n dm a r r o ws t r o m a c e l l st h a th a v et h ec h a r a c t e r i s t i c s o fh u m a nm e s e n c h y 7 m a ls t e mc e l l sw e r ei s o l a t e df r o mb o n em a r r o wo fv o l u n t e e rd o n o r s t h e s ec e l l sd i s p l a y e das t a b l ep h e n o t y p ea n dr e m a i n e da s am o n o l a y e ri nv i t r o t h e s ea d u l ts t e mc e l l sc o u l db ei n d u c e dt od i f f e r e n t i a t ee x c l u s i v e l yi n t ot h ea d i p o c y t i c 、e h o n d r o c y t i c ，o ro s t e o c y t i cl i n e a g e s i n d i v i d u a ls t e mc e l l sw e r ei d e n t i f i e dt h a t ，w h e ne x p a n d e dt oc o l o n i e s ，r e t a i n e dt h e i rm u l t i l i n e a g ep o t e n t i a l m u l t i l i n e a g ep o t e n t i a lh a v ea p p l i c a t i o ni nf i e l d sw h i c ha r en e r v a l ， h e m a t o p o i e t i cs y s t e m ，h e a r td i s e a s e aa n ds oo n i t i sw i d eu s e do n a u t o g r a f t i n ga n da l l o g r a f f ，w h i c hi se a s yt ob et r a n s f e c t e dm a k ei tb e c o m et a r g e t e dc e l lt og e n et h e r a p e u t i c s i ti sg o o dm e t h o d st od i f f i c u l td i s e a s e s t o d a ys t u d i e sh a v em a d em o d e l so fr a b b i t ，h u m a n ，m u r i n e ，b a b o o n ，p o r c i nd e f f e r a t i o ni n t oa d i p o c y t e s i n c l u d i n ga p 2 ，a d i p s i n ，p p a r 2 ，c e b p l 2a n dc e b p 1 3 ，c e b p al i p i d a c t i v a t e dt r a n s c r i p t i o nf a c t o r s m e a n w h i l eb m sp r o m o t eb o t ha d i p o p r o g e n i t o r sa n df o r m a t i o no fa d i p o c y t e s f i r s t l yd e x a m e t h a s o n ei sm a i n l yi n d u c ed r u g ，i t 硕士学位论文 英文摘要 p r o m o t er e l a t e du p - r e g u l a t i o ng e n ee x p r e s s i o no fa d i p o g e n e i ca n dc a r t i l a g e t h er a t ei sl o - 2 0 r e c e n t l yy e a r sj a n d e r o v aa c c o r d i n gt oc o n t r a s tb o l t i n gc o n s t r u c tp r o j e c t ：t h em e d i u mw a sc h a n g e dt od u l b e c c o sm o d i f i e de a g l e sm e d i a ( i n v i t r o g e n ) s u p p l e m e n t e dw i t hd e x a m e t h a s o n e ，3 - i s o b u t y l 一1 - m e t h yx a n t h i n e ，i n s u l i n a n ds c a v oi n d i c a t e dt h a ta d d e dp o l i l i t t l ec o n c e n t r a t i o ni n s u l i n eg r o w t hf a c t o r - ic a na d v a n c ea d i p o g e n e i c o t h e r w i s eh y p o x i aa n dh y p o g l y c e m i ca g e n ti n c l u d i n gt os i g l i t a z o n ea p p e a r st oe x e aap o t e n tl i p o g e n i ce f f e c ti n d e p e n d e n to fp p a r - y 2m a t u r a t i o np a t h w a y t h o u g hm a n yp r o j e c t sb er e p o r t e d ，t h ef o r mo fp e r c e n t i l eh a v en o tb ed e t e r m i n e d i ft r e a t m e n tw i t hd i f f e r e n td o s eo rc o n d i t i o n s ，m a k ei t d i f f e r e n t i a t i n gi n t oc h o n d r o c y t e s ，o s t e o b l a s t sa n da d i p o c y t e s ，t h e r ea r eq u a n t i t yi sd i f f e r e n t s o m e t i m e sa d i p o c y t e sj u s tt a k ep o s s e s s i o no f2 0 - 3 0 ，i th a v en os t a b l ec o n d i t i o no fd i f f e r e n t i a t i o ni n t oa d i p o c y t e s w eo b s e r v ep a s s a g e5 o fm e s e n c h y m a ls t e mc e l l sw h i c h p u r i f e db ei n d u c e dt oa d i p o c y t e sb yo i lr e d0 s t a i n i n gs h o wo r a n g e , a n de n d o c h y l e m af i l l e dw i t ha c c u m u l a t i o no fl i p i d s n u l l i c o i n c i d e1 0f i e l d sb eo b s e r v e db yf l u o r e s c e n c em i c r o s c o p ys h o w e dt h a tp e r c e n t a g eo fa d i p o c y t e sr e a c hu p t o9 0 ，a p ( a l k a l i n ep h o s p h a t a s e ) s t a i n i n gi sp o s i t i v e ，m a c - 1 ，f a c t o r sa n t i g e ns t a i n i n gi s n e g a t i v e t h a tr e s u l t sd e p l e t ep o s s i b l eo fh e t e r o p h i lg r a n u l o c y t e ，m a c r o p h a g ea n dh e m a t o p o i e t i cc e l l s o u re x p r e i m e n t so b j e c t e dt oe s t a b l i s ht h em e t h o d so fi s l o t i o na n do p t i m i z rt v 硕士学位论文英文摘要 h es u i t a b l ec o n d i t i o n so fi n d u c t i o nf o rr o s e sd i f f e r e n t i o ni n t oa d i p o s i t i e si nv i t r o ，a c c o r d i n gt o i m m u n e h i s t o c h e m i s t r ym e t h o d st o i d e n t i f i e dr a t e so fi n d u c t i o na n da n a l y s i so fc y t o p l a s m i cl i p i d ，t oe s t a b l i s h b e t t e rf o u n d a t i o no nh i s t i o e n g n i e e r i n gs t u d i e so fm s c sd i f f e r e n t i a t i o ni n t oa d i p o c y t e so nc o n d i t i o n so fp h y s i o l o g ya n dp a t h o l o g y o b j e c t i v et oe s t a b l i s ht h em e t h o d so fi s o l a t i o na n dc h a r a c t e r i z a t i o no fm u r i n eb o n em a r r o wm e s e n c h y m a ls t e mc e l l s ，t oo p t i m i z et h es u i t a b l ec o n d i t i o n so fi n d u c t i o nf o rm s c sd i f f e r e n t i a t i o ni n t o a d i p o c y t e si nv i t r o ，t oe x p l o r et h ep o s s i b i l i t yo fm s c sw h e t h e ra v a i l a b l eo rn o tf o rt h ea d i p o c y t et i s s u ee n g i n e e r i n g m e t h o d st h ed i f f e r e n t i a la d h e r e n c et op l a s t i cw a se m p l o y e dt oi s o l a t em s c s c f u fa n ds u c c e s s i v ec f u fc u l t u r e sw e r ee m p l o y e dt oc h a r a c t e r i z et h ep o t e n to fp r o l i f e r a t i o na n ds e l f - r e n e w a lo fm s c s t h ed i f f e r e n ta d i p o g e n i cm e d i u mw a su s e da si n d u c t i o nf o rt h e d i f f e r e n t i a t i o no fm s c si n t oa d i p o c y t e s t h ed i f f e r e n t i a t e dc e l l sw e r ei d e n t i f i e db yo i lr e d0i m m u n o h i s t o c h e m i s t r ys t a i n r e s u l t st h ep u r i f i e dm s c ss h o w e dt h em o r p h o l o g yo ff i b r o b l a s t s i tw a sf o u n dt h a tt h en u m b e ro fc f u ff o r m a t i o nd e p e n d e d o nt h ep l a n t e dn u m b e ro fm s c s i ts h o w e dag o o dr e l a t i o n s h i p s m a l lt y p ec o l o n yo fc f u - fh a dl i t t l ep o t e n tt or e c l o n e ，b u ta l m o s t 9 0 b i gt y p ec o l o n yo fc f u fh a dt h ep o t e n tt or e g e n e r a t ec f u - f t h em s c sc o u l dc o m m i t t e dd i f f e r e n t i a t e di n t oa d i p o c y t e si n d u c e db y v i 硕士学位论文 英文摘要 d i f f e r e n ta d i p o g e n i cm e d i u m b u tm o r et h a n9 6 m s c sd i f f e r e n t i a t e di n t om a t u r ea d i p o c y t e sw h e ni n d u c e db yc o n b i n e dw i t l ld e x a m e t h a s o n1 - m e t h y - 3i s o b u t y l x a n t h i n e ，i n s u l i na n di n d o m e t h a c i n c o n c l u s i o n so u rf i n d i n g ss h o w e dt h a tw ec o u l dh a r v e s t i n gt h ep u r i f i e dm s c sb yi s o l a t i o no fd i f f e r e n t i a la d h e r e n c et op l a s t i c ，a n dt h i sm s c sh a dt h ep o t e n to fp r o l i f e r a t i o na n ds e l f - r e n e w a l m o r e o v e r ，m o r et h a n9 6 m s c sc o u l dd i f f e r e n t i a t ei n t om a t u r ea d i p o c y t e sw h e ni n d u c e db yc o m b i n e dw i t hd e x a m e t h a s o n e ，1 - m e t h y - 3 - i s o b u t y l x a n t h i n e ，i n s u l i na n di n d o m e t h a c i n o u rf i n d i n g ss u g g e s t e dt h a tm s c sc o u l db ev a l u a b l ef o ra d i p o c y t et i s s u e e n g i n e e r i n g k e yw o r d s m e s e n c h y m a ls t e mc e l l s ，a d i p o c y t e ，t i s s u ee n g i n e e r i n g ，g e n ee x p r e s s i o n 硕士学位论文 英文注释及翻译 英文注释及翻译 m s a m a c r o p h a g es u r f a c ea n t i g e n 巨噬细胞表面抗原 a l p a l k a l i n ep h o s p h a t a s e碱性磷酸酶 骨髓间质干细胞 p e r o x i s o m ep r o l i f e r a t o r - a c t i v a t e x l p p a r 过氧化物酶体增生物激活受体 r e c e p t o r h s c h a e m o p o i e t i cs t e mc e l l造血干细胞 c f u - f c o l o n y - f o r m i n gu n i t - f i b r o b l a s t成纤维细胞集落生成单位 i b m n 3 - i s o b u t y l 1 - m e t h y l x a n t h i n e 3 - 异丁基一1 一甲基黄嘌呤 d x m d e x a m e t h a s o n e f b s f e t a lb o v i n es e r u m 地塞米松 胎牛血清 d m e m d u l b e c c o sm i n j n l u i ne s s e n t i a lm e d i u m基本培养基 t g f t r a n s f o r m i n gg r o w t hf a c t o r转化生长因子 骨形态发生蛋白 硕士学位论文 刖吾 干细胞是一群较原始的细胞，同时具有分裂增殖成另一个与本身完全相同的 细胞，以及分化成为具有特定功能的成熟细胞等两种基本特性。干细胞在生命体 由胚胎发育到成熟个体的过程中，扮演着最关键性的角色；即使发育成熟之后， 一般认为干细胞仍然普遍存在于生命体中，担负着个体的各个组织及器官的细胞 更新及受伤修复等重责大任。根据其发育阶段，大体可分为胚胎干细胞和成体干 细胞。近年来，国内外有关干细胞的基础研究和应用研究不断升温，新概念新技 术和新成果大量涌现。干细胞科学已成为2 1 世纪生命科学研究领域最活跃的一个 热点晦”。 早在上个世纪7 0 年代，f r i e d e n s t e i n 等就报道了骨髓中存在一种纺锤形的 可生成成纤维细胞集落形成单位( c f u - f ) 的细胞。1 9 8 7 年f r i e d e n s t e i n 嘲等报 道在塑料培养皿中培养的贴壁的骨髓单个细胞在一定条件下它们能够表现出强 大的自我复制能力和多向分化潜能。可分化为成骨细胞，成软骨细胞脂肪细胞和 成肌细胞，而且这些细胞经过2 0 一3 0 个培养周期仍能保持其多向分化潜能。由 于骨髓中的这种多能细胞能够分化为多种中胚层来源的间质细胞，后来c a p l a n 嘲 把这些在体外能高度扩增并可多向分化的细胞群命名为骨髓间充质干细胞 ( m e s e n c h y m a ls t e mc e l l s ，m s c s ) 。 m s c s 与神经干细胞和造血干细胞一样属于成体干细胞。m s c s 是存在于骨髓干 细胞中的另一种非造血干细胞，是由中胚层发育的早期细胞，具有多向分化潜能， 不仅能支持造血，还可以分化为多种造血细胞以外的组织细胞，特别是中胚层和 神经外胚层来源的组织细胞。m s c s 又被称为成纤维细胞集落形成单位( c f u - f ) 或间质祖细胞( m p c s ) ，是成人多能干细胞的一类。骨髓间充质干细胞的特点是 ( 1 ) 具有多向分化潜能，( 2 ) 自我更新能力，( 3 ) 高度增值能力，( 4 ) 体内长期重 建能力( 5 ) 横向分化能力。m s c s 主要来源于骨髓，也可以从其他组织如外周血、 皮肤、脂肪、肌肉、脉管系统和脐血等组织中分离到。 近年来的研究认为骨髓问充质干细胞具有多向分化潜能，在一定的实验条件 的诱导下可向不同胚层的细胞转化，如骨细胞，软骨细胞，肌肉细胞以及神经细 硕士学位论文前言 胞等。动物实验证明“”，局部移植骨髓间质细胞后可明显促进病变局部骨，软骨， 肌腱的修复重建。作为组织过程理想的种子细胞应具备的条件是：( 1 ) 取材容易， 对机体损伤小；( 2 ) 体外培养过程中有较强的传代繁殖能力，易于扩增；( 3 ) 植入 机体后能够适应接受区的局部环境并保持分化活性。综合来看，m s c s 最符合种 子细胞的要求，具有良好的应用前景。目前，软组织巨大缺损的损伤修复仍是烧 伤整形外科难于攻克的医学高峰。脂肪组织工程的研究在这一领域有着特殊的意 义。而且，探索如何生成脂肪细胞的研究不仅有利于组织器官工程，还有利于某 些疾病如肥胖症、糖尿病、再生障碍性贫血，骨髓硬化综合症以及缺铁性贫血等 发病机理的研究。“” 通过文献检索发现，迄今为止，有关m s c s 的研究报道以成骨及软骨组织工 程、神经细胞和心肌的修复，肌肉肌腱和韧带的研究，应用于造血恢复重建和应 用于基因治疗的研究报告居多。而有关m s c s 的建系及其脂肪组织工程研究报道 较少。 因此本研究目的旨在建立小鼠骨髓间质干细胞的分离和鉴定方法；稳定和优 化在体外诱导骨髓m s c s 定向向脂肪细胞分化的适宜诱导条件；初步探索骨髓间 质干细胞向脂肪细胞组织工程的可行性，为解决临床软组织缺损的损伤修复和整 形难题提供理论和实践基础。 2 硕士学位论文 第一部分 第一部分小鼠骨髓间充质干细胞的分离，培养和纯化 1 材料和设备： 1 1 实验动物： 1 6 2 0 周龄的b d f l 雄性小鼠购自中南大学湘雅医学院实验动物中心。 1 2 主要仪器和设备： 名称型号产地 c 0 2 培养箱 3 1 3 1f o r m as c i e n t i f i c ，u s a 低温高速离心机5 4 1 5 ce p p e n d o r f ，u s a 普通台式离心机t d 5 - i i长沙平凡仪器仪表有限公司 超净工作台 f o r m as c i e n t i f i c ，u s a 电子天平s i g m ac o ，u s a 酶标仪 e l x 8 0 0b i o - t e ci n s t r u m e n t s ，u s a 正立显微镜和倒置显微镜 i x - 7 0 o l y m p u sc o ，j a p a n 低温冰箱 7 2 5f o r m as c i e n t i f i c ，u s a 图像分析处理系统 e a g l ee y e l i s t r a t a g e n ec o 1 3 主要试剂： d m e m 培养为美国h y c l o n e 产品； 标准胎牛血清为杭州四季青生物制品所； 胰蛋白酶为美国s i g m a 公司产品； f i c o l l 淋巴细胞分离液( l0 7 7 9 m 1 ) ：北京； 碱性磷酸酶：m a x i mb i o t e c h ，i n cu s a ； 因子抗原，m a c 一1 因子抗原：福建迈新生物有限公司； 常规试剂：多聚甲醛，异丙醇，不同浓度酒精等。 d m e m 基础培养液的配制： 称取n a o h2 2 克，l - d m e m 培养基1 包。加适量超纯水充分溶解，加 a n t i b i o t i c - a n t i m y c o t i c l o m l ，补充蒸馏水至1 0 0 0 m l 。其中抗生素终浓度为 l o o u m 1 ，链霉素：l o o u m l ，调p h 值为7 4 ，0 2 2 岬过滤器除菌，分装，4 保存。 3 硕士学位论文 第一部分 p b s 缓冲液： 称取氯化钠5 0 9 ，氯化钾1 2 5 9 ，磷酸氢二钠1 8 1 9 ，磷酸二氢钠1 5 6 9 ，充分溶 解于2 5 0 m 1 双蒸水，4 1 2 保存。 2 5 x p b s 使用液的配制： 4 0 r a l2 5 x p b s 缓冲液加水定容至1 0 0 0 m l ，分装，高压灭菌。 胰酶一e d t a 消化液的配制： 称取胰蛋白酶0 2 5 9 ，用适量p b s 缓冲液充分溶解，补水至l o o m l ，调p h 值为 7 2 ，置4 过夜，0 2 2 u m 滤器过滤除菌，加e d t a 至终浓度为l m o l l ，分装，- - 2 0 保存。 ( 1 ) 台盼蓝染色液：称取4 9 台盼蓝染料，加少量蒸馏水研磨，加双蒸水至l o o m l ，甩 滤纸过滤，4 保存，使用时用p b s 稀释至0 4 。 ( 2 ) 吉姆萨染色液：将吉姆萨染液粉剂0 5 9 放入洁净干糙研钵中研细，然后加 3 3 m l 甘油继续研磨成细末后溶于甘油中，再分次加入甲醇3 3 m l 研磨至全溶，密 封于棕色小瓶中，最后加盖摇动，放置半个月后使用。 2 方法 本实验采用干细胞工程法，细胞生物学方法，组织工程学，免疫组织化学， 分子生物学，功能形态学及超微结构观察。以下就主要免疫组化方法进行介绍。 2 1 吉姆萨染色法：贴壁细胞染色观察。吉姆萨染色取p 。代细胞，用p b s 把培养 瓶底轻轻清洗两次，加入甲醇l m l 固定1 0 分钟，弃去固定液，加入l m l 吉姆萨 染液，将细胞表面覆盖，染色3 - 5 分钟，加磷酸缓冲液少许，与原液混匀，再染 色2 - 3 分钟左右，在显微镜下能分辨细胞核和细胞浆，颜色适度即可倒出染液， 自来水冲洗待其自然干燥后，在倒置显微镜下形态观察。 2 2 台盼蓝染色法：取0 4 的台盼蓝( p b s 配制) 0 5 m l ，培养基0 3 m l 和细胞悬 液0 2 札，充分混匀，用血球计数板计数活细胞( 未着色细胞) 和死细胞( 着色细 胞) 共计数5 0 0 个细胞，计数细胞活力。细胞活力( ) = ( 细胞总数一着色细胞数) 细胞总数x 1 0 0 。 2 3 骨髓单个核细胞的制备： 4 硕士学位论文 第一部分 取1 6 - 2 0 周龄b d f l 雄性小鼠，颈椎脱臼法处死，无菌操作取出其股骨和胫 骨，剔除肌肉及结缔组织。用充满1 0 m 1 d m 酬培养基( 10 9 6 胎牛血清，l o o u m l 青 霉素，l o o u m l 链霉素) 的注射器反复冲洗，随后把这些细胞转移到离心管， 2 0 0 0 r p m 离心5 分钟。收集细胞再加入5 m l d m e m 培养基制成细胞悬液。把这些细 胞加入1 0 7 7 9 m 1 淋巴细胞分离液( f i c o l l p a q u e ) 的顶层。2 0 0 0 r p m 离心3 0 分 钟。把其顶层2 3 移出，再2 0 0 0 r p m 离心l o 分钟。随后用p b s 冲洗( 重复三次以 去除淋巴细胞分离液) 。最后收集细胞制成1 o 1 0 7 c e l l m l 细胞悬液以备实验 用。细胞记数板记数骨髓单个核细胞并用台盼蓝拒染法测定细胞活性。 2 4 骨髓间质干细胞的培养、传代和纯化 取分离后骨髓单个核细胞接种到铺有胶原膜的2 5 m i 培养瓶，2 4 - 4 8 小时换 液，去除未贴壁的细胞。以后每3 4 天完全换液一次。在原代细胞培养两周左右 或细胞密度达8 0 - 9 0 时，以0 2 5 9 6 胰蛋白酶( s i g m a ) 消化后，收集贴壁细胞制成 l 1 0 7 c e l l m 1 单细胞悬液，接种到铺有胶原膜的2 5 m i 培养瓶继续传代培养。通 过多次细胞传代培养，直至贴壁细胞纯化为骨髓m s c s 。不同胎牛血清之间差异 显著，细胞增殖活性在一定的范围内( 2 5 - 2 0 ) 随着血清浓度的增加而加大， 当血清浓度超过2 0 ，细胞增殖活性将不再增高嘲。细胞培养条件：含1 0 的胎 牛血清( 杭州四季青生物制品所) 以及1 0 0 - u m l 青霉素、1 0 0 - u m 1 链霉素的d m e m 培养基；3 7 ，5 的c 0 2 ，饱和湿度。 2 5 骨髓问质千细胞的形态学观察，倒置显微镜下观察培养的骨髓问质千细胞形 态。 2 6c f u - f 培养： 取p 5 代贴壁细胞制成1x1 0 7 c e l l m 1 单细胞悬液。按2 0 0 0 1 0 0 0 0 0 个不同 组分分别植入3 5 m 培养皿中。每皿均为2 m l 含l 旷二巯基乙醇、2 0 9 6 胎牛血清的 d m e m 培养基体系；置3 7 ( 2 、5 9 6 的c 0 2 、饱和湿度的培养箱内培养1 4 2 1 天。部 分培养皿用p b s 冲洗后瑞氏吉姆萨染色，在光学显微镜下计数集落，含5 0 个细 胞以上的细胞集落为一个c f u - f 。另一部分培养皿则用于继续传代培养或用于其 它鉴定。c f u - f 集落再克隆生成c f u - f 集落：应用刮除的方法，每皿只保留一个 目的c f u - f 集落，每批十皿，以0 2 5 胰蛋白酶消化后，收集贴壁细胞，l ：1 分别植入3 5 m m 培养皿中继续进行c f u - f 培养，观察其再克隆生成c f u - f 集落的 5 硕士学位论文第一部分 能力。 2 7 贴壁细胞特异性检测 酶染色：按标准法检测培养细胞的碱性磷酸酶与酸性磷酸酶反应。 吞噬细胞功能检测：将颗粒细胞直径小于1 微米的酵母细胞膜啐片( s i g m a c o ) 加入培养1 4 天的培养皿中，置c 0 2 培养箱4 5 分钟后，用p b s 冲洗，吉姆萨 染色后于光学显微镜下检测细胞的吞噬作用。 抗原检测：用m a c - 1 单抗( h y b r i t e c h ) 检测巨噬细胞相关抗原m a c 一1 ，用 因子单抗( d a k o p a t t sc o p e n h a g e n ) 检测因子相关抗原，具体按厂家提供的 标准操作程序执行。 3 ，结果 3 1 小鼠骨髓m s c s 的分离纯化传代： 台盼蓝染色测出骨髓单个核细胞活力达9 6 左右。原代培养2 4 h 后，镜下观 察发现培养液中有大量悬浮细胞增殖，多为小鼠骨髓中的造血细胞，并有少量红 细胞相互聚集成团；少量细胞贴壁生长。接种后7 2 h 首次换液，可见贴壁细胞体 积增大，呈梭形或多角形，核居中，含1 2 个核仁，呈成纤维母细胞样形态。1 周 后成纤维母细胞样细胞迅速增多，并开始互相融合，培养1 3 1 8 d 时细胞可长满 培养瓶底的8 0 9 0 。连续换液后除去悬浮细胞。连续传代4 、5 次，细胞可被 纯化，呈均匀有序的成纤维母细胞样形态。多次传代后小鼠骨髓m s c s 得到了进一 步的纯化。 3 2c f u - - f 集落的形成： 植入2 0 0 0 1 0 0 0 0 0 个m s c 细胞皿，可生成不同比例的纯的c f u - f 集落。当 每皿种入的细胞数较少时，生成纯的c f u f 集落数量也较少；每皿种入的细胞数 较多时，生成纯的c f u - f 集落数量也较多。表1 显示所生成纯的c f u f 集落数与 种入的细胞数呈良好的线性关系。 3 3o f u - f 集落再克隆生成o f u - f 集落的能力： 表2 实验结果表明小型c f u - f 集落再克隆生成c f u f 集落的能力较弱。在每 批挑选出的1 0 个目的集落共十批实验中，绝大部分集落缺乏再克隆生成c f u f 集落的能力；仅其中3 批的1 2 个目的集落能再形成小型c f u f 集落。而大型 c f u - f 集落具有较高的再克隆生成c f u - f 集落的能力，再克隆生成c f u f 集落率 6 硕士学位论文 第一部分 高达9 0 。而且往往一个目的集落可再克隆生成多个c f u - f 集落。 3 4 讨论： 目前骨髓m $ c s 的分离、纯化、培养比较常用的方法是壁细胞分离法、密度 梯度离心法、流式细胞仪和免疫磁珠分离法。在本实验中我们采取的是 f r i e n d e n s t e i n 建立的贴壁细胞分离法结合密度离心法，这种分离方法操作简 单、快速、实用，对骨髓需求量少，对细胞活性影响小，更符合细胞生长的微环境， 细胞不易分化，这种方法更适合分离以研究分化潜能为目的间质干细胞。我们利 用骨髓中间质干细胞贴壁生长，而血细胞和造血干细胞悬浮生长的特性将它们分 离开。m s c s 的体外生长与多种因素有关，常用1 0 的胎牛血清培养m s c s ，高浓度 血清中含有大量促进细胞增殖分化的因子，容易使细胞过早出现老化，不利于 m s c s 的生长，合适的血清浓度有助于m s c s 贴壁、扩增及多系潜能的维持在原 代培养中贴壁的细胞除m s c s 外，还混杂有内皮细胞、脂肪细胞、巨噬细胞，但是 后三种细胞贴壁较骨髓m s c s 要牢固，通过严格控制消化液的量和时间，让骨髓 m s c s 在短时间内脱离瓶壁，而且内皮细胞、脂肪细胞、巨噬细胞在传代的过程中 不处于生长优势，通过反复消化传代，最终将骨髓m s c s 与内皮细胞、脂肪细胞、 巨噬细胞分离开，一般传至第五代骨髓m s c s 即可被纯化。经过多次传代，得到进 一步纯化的骨髓m s c s “”。之所以选择在体外分化是考虑到m s c s 随着传代次数 的增多而逐渐丧失其多向分化潜能。向脂肪细胞的分化能力只能维系1 0 代以内， 以后向成软骨细胞、神经星状细胞分化的功能相继丧失，但是体外培养的m s c 向 成骨细胞的分化能力可维持2 0 代以上0 3 】。 鉴定细胞是否是m s c s 的标准除p i t t e n g e rm f 等“”所使用的诱导向骨、软骨 和脂肪细胞等间质细胞分化的功能标准外，检察细胞能否形成c f l l f 是另一重要 标准。实验结果表明我们分离纯化的小鼠骨髓m s c s 具有生成c v u - f 集落的能力， 而且所生成纯的c f u f 集落数与种入的细胞数呈良好的线性关系。取c f u - f 的细 胞检测，所有细胞形态均一，长梭型，有突起，胞浆及核染色淡，吞噬试验阴性， 因子相关抗原和m a c 一1 抗原检测阴性，碱性磷酸酶反应阳性，符合成纤维母细 胞的特征( 资料未显示) 。迸一步研究发现c f u - f 集落还具有再克隆生成c f u - f 集落的能力，尤其是大型c f u - f 集落具有较高的再克隆生成c f u - f 集落的能力， 再克隆生成c f u - f 集落率高达9 0 。而且往往一个目的集落可再克隆生成多个 7 硕士学位论文 第一部分 c f u - f 集落。这说明我们分离纯化的小鼠骨髓m s c s 不仅具有高度的增殖能力， 而且还有活跃的自我更新能力。 8 硕士学位论文 第二部分 第二部分小鼠骨髓间充质千细胞定向诱导分化为脂肪细胞 1 材料和方法 1 1 主要仪器和设备： 名称 c 0 2 培养箱 低温高速离心机 普通台式离心机 超净工作台 电子天平 酶标仪 正立显微镜和倒置显微镜 低温冰箱 图像分析处理系统 型号 3 1 3 1 5 4 1 5 c t d 5 - i i 产地 f o r m as c i e n t i f i c ，u s a e p p e n d o r f ，u s a 长沙平凡仪器仪表有限公司 f o r m as c i e n t i f i c ，u s a s i g m ac o ，u s a b i o - t e ci n s t r u m e n t s ，u s a o l y m p u sc o ，j a p a n f o rm s c i e n t i f i c ，u s a s t r a t a g e n ec o 1 2 主要试剂 诱导剂：地塞米松，胰岛素，卜甲基3 一异丁基黄嘌呤，消炎痛。( 皆为s i g m a 公司试剂) 油红0 溶液的配制： 用蒸馏水稀释异丙醇成6 0 加入油红0 直至不再溶解，3 7 水浴，再加入油红 0 ，直到饱和，室温下保存。 碱性磷酸酶：m a x i mb i o t e c h ，i n cu s a 因子抗原，m a c - i 因子抗原：福建迈新生物有限公司 染色方法： 碱性磷酸酶染色：( 偶氮偶联法) 血细胞内的碱性磷酸酶在p h 9 4 9 6 的 条件下将基质液中的- 阿尔发”一磷酸萘酚钠水解，产生”阿尔发”一萘酚与重氮 盐偶联形成不溶性灰黑色沉淀，定位于酶活性所在之处。 吞噬细胞功能检测： 9 ie y e o0 o e 8 7 l x 一 5 g 乩 仡 盼 硕士学位论文 第二部分 吞噬细胞分两类，一巨噬细胞a p s ，其功能是非特异性地吞噬病原体，衰 老病残和突变的细胞外，还在特异性免疫形成过程中参与抗原识别和